Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Résumé

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Résumé

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

Dans la recherche médicale, une grande attention est focalisée sur des protéines membranaires, soit intrinsèques ou extrinsèques, impliqués dans une variété d'interactions lipidiques. En travaillant avec des protéines interagissant lipides comprend soit la sélection d' un substitut aux lipides, tels que les détergents, amphipols ¹ ou ² petites protéines ou de trouver un substitut à membrane qui maintient la protéine soluble et active. Substituts de la membrane lipoïque comprennent des liposomes et nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs sont des plates-formes de membranes quasi-native développée par ingénierie de la partie protéique, ApoA-1, de la lipoprotéine de haute densité (HDL) dans le sang d'origine naturelle. ApoA-1 est un résidu 243-longue chaîne de courtes hélices a amphipathiques et présente une conformation soluble délipidé. In vitro lorsqu'ils sont en présence de lipides, de deux copies de la protéine d' ApoA-1 réarranger spontanément à entourer le hydrpartie de la chaîne acyle ophobic d'un bicouche lipidique correctif ^5. versions d'ingénierie de ApoA-1 sont généralement appelés échafaudages de protéines membranaires (MSP), et un nombre croissant sont disponibles dans le commerce sous forme de plasmides ou des protéines purifiées. Répétitions ou suppressions des hélices dans ApoA-1 résultat à plus ou moins ⁶ protéines d'échafaudage ⁷ membranaires. Ceci à son tour permet de former des disques d' environ 6 nm à 17 nm à ^{7 8} de diamètre. Il existe différents types d'applications pour le nanodiscs ^{3, 9.} L'application la plus couramment utilisée est de fournir un environnement membranaire quasi-native pour la stabilisation d'une protéine membranaire intégrale ^8, examiné précédemment ^{3, 9.} Une utilisation moins explorée est de fournir une surface de la membrane à l'échelle nanométrique pour l'étude demembrane périphérique des protéines ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} L'article 1 du protocole ci-dessous permet de visualiser la procédure de prise de nanodiscs composé de phospholipides et de protéines d'échafaudage de la membrane.

La préparation des échantillons est un goulot d'étranglement dans la plupart des méthodes. échantillons spécifiques Méthode peuvent ajouter des informations particulières, mais ils font également la comparaison des résultats difficile. Par conséquent, il est plus simple lorsque les échantillons sont multimodaux et peuvent être utilisés directement dans plusieurs méthodes différentes. Un avantage à l'utilisation de nanodiscs est la petite taille de l'nanodisc par rapport aux liposomes (par exemple, les échantillons peuvent être directement utilisés pour les TEM et électrophorèse sur gel non dénaturant, comme dans le présent protocole).

vésicules et des liposomes sont utilisés depuis longtemps pour comprendre la fonction des protéines de la membrane en interaction. Pour des études structurales et de visualisation, un exemple de la détermination de la structure d'une protéine transmembranaire dans des liposomes ¹⁸ est disponible. Cependant, aucune structure 3D à haute résolution d'une protéine de membrane monotopique embarqué sur une membrane de liposome a été encore publié, pour autant que nous le savons. Des nanoparticules d' or ou d' anticorps peuvent être utilisés pour visualiser les protéines de liaison à des liposomes ou des vésicules en utilisant TEM ^19. Même si ces sondes sont très spécifiques, ils pourraient interférer avec les protéines membranaires de liaison en voilant le site de liaison de la membrane ou en masquant les zones d'intérêt avec les parties flexibles. Or marqué ou des protéines d'anticorps complexée pourrait probablement être analysé sur un gel, mais cela augmenterait le coût de l'expérience.

Bien que les liposomes sont une excellente plate-forme, on ne peut être certain que la population a un rapport particulier de protéines par liposome, une caractéristique qui peut être explorée par l'utilisation de nanodiscs ^20. Dans un liposome, des cofacteurs et des substrats peuvent être piégés à l'intérieur soluble. Les substances qui sont solubles dans la membrane se partageront le même sort pour les deux types de mimétiques membranaires. Cependant, comme la zone à deux couches est inférieure à nanodiscs, une petite quantité de substance nécessaire pour saturer les membranes nanodisc.

Comprendre la fonction des protéines grâce à la détermination de la structure atomique a été essentielle pour de nombreux domaines de la recherche. Méthodes de détermination de la structure des protéines comprennent des rayons X ^21; résonance magnétique nucléaire (RMN) , ^{22, 23;} et par microscopie électronique à transmission (MET) ²⁴ à des températures cryogéniques, cryoEM. La résolution par cryoEM a récemment été grandement améliorée, principalement en raison de l'utilisation d'électrons de directetecteurs ^{25, 26.} Les macromolécules sont imagés dans mince, glace vitreuse ²⁷ dans un état quasi-native. Toutefois, en raison du faible contraste entre les molécules biologiques, elles deviennent difficiles à détecter dans la gamme de tailles de 100-200 kDa. Pour les échantillons de taille appropriée, la collecte des données peut être effectuée et le procédé de reconstruction de la particule peut être appliquée pour obtenir une structure ^28.

Cependant, la détermination de la structure protéique par MET est un processus en plusieurs étapes. Elle débute généralement par l'évaluation de l' échantillon monodispersité par coloration négative TEM ²⁹ en utilisant des sels de métaux lourds comme phosphotungsten (PT) ³⁰ ou de l' uranium ^31. Reconstruction d'un modèle à faible résolution de la macromolécule colorées négativement est généralement faite et peut fournir des informations importantes sur la structure moléculaire ^29. En parallèle,la collecte de données en utilisant cryoEM peut commencer. Des précautions doivent être prises lors de l'évaluation des données TEM coloration négative pour éviter la mauvaise interprétation de la formation artefact. Un artefact particulier est l'effet de la tache de PT sur des phospholipides et des liposomes ^32, ce qui entraîne la formation de longues tiges ressemblant à des piles de pièces de monnaie vues du côté ^33. Un tel "rouleau" ou "piles" (ci - après désigné par "piles") ont été observées au début de HDL ^34, et plus tard aussi pour nanodiscs ^35.

L'empilement et un remodelage des membranes peuvent se produire pour de nombreuses raisons. Par exemple, elle peut être induite par des co-facteurs tels que le cuivre, montré par imagerie MET dans un molybdate d' ammonium ³⁶ tache. Une fraction des lipides de la membrane dans des liposomes contient un groupe de tête iminodiacétique mimant complexation des métaux par l'EDTA, l'empilement ainsi des liposomes après l'addition d'ions cuivre ^{36. Gerbage peut aussi être due à une interaction protéine-protéine d'une protéine dans ou sur les bicouches lipidiques (le colorant utilisé est non mentionné) 37. La formation de la pile de phospholipides par PT a été observée dès le début; Cependant, le travail plus tard , a mis l' accent sur la suppression ou la suppression de cette formation d'artefact 38.}

Ici, nous proposons une méthode pour tirer parti de la nanodisc NaPT induite par empilement pour l'étude des protéines membranaires de liaison par MET. En bref, la liaison sur les protéines nanodiscs empêcherait les nanodiscs d'empilement. Bien que les raisons de l'empilement ne sont pas claires, il a été proposé ³⁹ qu'il y ait une interaction électrostatique entre les phospholipides et le groupe phosphoryle du PT, ce qui provoque les disques à coller à l'autre (figure 1A). L'hypothèse derrière notre protocole est que, quand une protéine se lie à une nanodisc, la majeure partie de la surface phospholipide est non disponi ble pour l'interaction avec le terminal en raison de l'encombrement stérique de la protéine. Cela permettrait d' éviter la formation pile (figure 1B). Deux conclusions peuvent être tirées. En premier lieu, la prévention de l'empilement signifie que la protéine d'intérêt est liée à la membrane. En second lieu , le complexe protéine-ND peut être traitée par des procédés classiques de traitement unique de particules ^{24, 40} pour obtenir une morphologie grossière du complexe. En outre, des analyses par des méthodes telles que la non-dénaturant électrophorèse sur gel ou la diffusion dynamique de la lumière peut être réalisée.

Pour démontrer cette hypothèse, nous avons utilisé la protéine de liaison à la membrane 5-lipoxygénase (5LO), qui est impliqué dans de nombreuses maladies inflammatoires ^{41, 42.} Cette protéine de 78 kDa nécessite des ions calcium à se lier à la membrane ^43. Bien que cette association de la membrane a été largement étudiée en utilisant des liposomess = "référence externe"> ^{44, 45, 46} et des fractions de membrane ^47, ceux - ci ne peuvent pas être utilisées pour une analyse TEM et la détermination de la structure.

La préparation de nanodiscs commence par le mélange MSP avec des lipides remis en suspension dans le cholate détergent de sodium. Après incubation sur de la glace pendant 1 h, le détergent est lentement éliminé du mélange de reconstitution à l'aide d'une résine adsorbante. Ce type de matériel est souvent faite de forme en petites billes de polystyrène. Ils sont relativement hydrophobes et ont une forte préférence pour un détergent de liaison par rapport aux lipides ^48. Après avoir retiré les billes hydrophobes et effectuer une clarification par centrifugation, les nanodiscs sont purifiés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Les nanodiscs purifiés sont mélangés avec une protéine de membrane monotopique (et cofacteurs possibles) dans un rapport équimolaire (ou plusieurs rapports pour un titrage) et on laisse rEACT (15 min). L'analyse par TEM est effectuée en appliquant ul-quantités d'échantillon sur, grilles revêtues de carbone lueur déchargée puis en effectuant une coloration négative avec NaPT. Le même échantillon à partir de laquelle les aliquotes ont été appliqués aux grilles de MET peut être utilisé pour l'analyse des non-dénaturant ou une électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, ainsi que par divers types de mesures d'activité, sans changements majeurs.

Protocole

1. Préparation de Nanodiscs

1. Expression et purification de la protéine d'échafaudage membranaire ^{8, 35}
   1. Exprimer le MSP1E3D1 His-tagged dans le E. coli BL21 (DE3) souche T1R pRARE2 dans des flacons. Préparer une culture de départ pendant la nuit de 50 ml avec un milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine à 37 ° C. Diluer la culture starter pendant une nuit dans 2 litres de milieu de bouillon super supplémenté avec 50 pg / ml de kanamycine.
   2. Faire croître les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que la densité optique à 600 nm (DO ₆₀₀₎ atteint environ 3. induire l'expression de la protéine avec 0,5 mM de β-D-thiogalactopyranoside d' isopropyle 1-(IPTG) pendant 3 h à 18 ° C.
   3. Préparer le tampon de lyse (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl et 10% de glycerol). Ajouter 1 mM PTCE immédiatement avant utilisation.
   4. Après 3 h d'induction à 18 ° C, de récolter les cellules par centrifugation pendant 10 min à 4500 x get 4 ° C. Jeter le surnageant, on pèse les cellules récoltées, et les remettre en suspension dans un tampon de lyse à un rapport de 2 ml de tampon de lyse par gramme de cellules.
   5. Lyse des cellules par sonication pulsée (taux de répétition: 4 de l'ON, 4 s OFF) pendant 3 min à 80% d'amplitude.
   6. Centrifuger les lysats pendant 20 min à 49000 xg et 4 ° C. Jeter le culot de cette centrifugation.
   7. Injecter le surnageant dans un 5 mL Ni ⁺ colonne chélatant connecté à un système de chromatographie en phase liquide automatisée de préférence maintenue à 4 ° C.
   8. Avant l'étape d'élution (étape 1.1.9), laver la colonne avec des tampons 1 - 3 ci-dessous pour éliminer toutes les protéines à l'exception du marquage His MSP. Surveiller la teneur en protéines à 280 nm pour suivre le processus de purification; l'enregistrement UV à 280 nm devrait revenir à la ligne de base après chaque lavage.
      1. Laver avec un tampon de lavage 1: 40 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10 mM d'imidazole, et 1% de Triton, pH 8,0.
      2. Laver avec un tampon de lavage 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMDe NaCl, 20 mM imidazole, et le cholate de sodium 50 mM, pH 8,0.
      3. Laver avec un tampon de lavage 3: 40 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl et 50 mM d'imidazole, pH 8,0.
   9. Éluer le MSP avec 40 mM Tris-HCl, 300 mM de NaCl et 500 mM d'imidazole, pH 8,0.
   10. Changer le tampon MSP tampon standard (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM de NaCl et 0,5 mM d' EDTA) par filtration sur gel , ^{8, 35;} le rendement par lot devrait être d' environ 7 mg L ^-1.
2. Préparation de la solution mère de phospholipides
   1. Ajouter 305 pi de 1-palmitoyl-2-oléoyl - sn - glycéro-3-phosphocholine (POPC) dissous dans du chloroforme à une concentration de 25 mg / mL dans un bêcher en verre et on évapore le chloroforme en le purgeant avec un courant doux d'azote . Sécher pendant toute une nuit lipidique dans un dessicateur sous vide. Remarque: Cette étape est réalisée pour éliminer le solvant à partir du lipide, ce qui laisse un film mince de lipide au fond du bêcher en verre.
   2. Remettre en suspension le gâteau de lipides dans 200 ul de tampon standard contenant MSP cholate de sodium 100 mM, vortexer le tube jusqu'à ce que la solution devienne transparente; ceci fournira une solution avec une concentration de 50 mM POPC.
      NOTE: En général, le rapport molaire de lipide au détergent à ce point doit être de 1: 2 (lipides: détergent) ^8. Ce mélange lipide-détergent peut être stocké à -80 ° C pendant environ 2 mois.
3. Préparation de billes hydrophobes pour l'élimination du détergent
   1. Placer 5 g de billes (poids sec) dans un tube de 50 ml.
   2. Laver les billes avec 30 ml de methanol à 100%, puis avec 40 ml d'eau ultrapure.
   3. Laver les billes avec un tampon standard de 10 ml de MSP. Enfin, stocker les perles avec 15 ml de tampon standard MSP à 4 ° C.
4. Nanodisc reconstitution
   1. Distribuer 190 ul de MSP1E3D1 (0,124 mM) dans un tube à centrifuger et ajouter 61,5 pi de solution mère de phospholipides (50 mM POPC) dans le même tube. Incuber le mélange de reconstitution sur de la glace pendant 1 h. NOTE: Ce qui correspond à un rapport molaire de 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
   2. Ajouter des billes hydrophobes à une concentration de 0,5 g de billes par ml de mélange de reconstitution pour lancer le processus d'auto-assemblage. Incuber dans un incubateur rotatif pendant 16 heures à 4 ° C.
   3. Après incubation, on centrifuge pendant 10 min à 13 000 x g et 4 ° C pour éliminer les précipités et les agrégats. Jeter le culot et enregistrez le surnageant.
   4. Equilibrer la colonne de chromatographie d'exclusion stérique (monté sur un système de chromatographie en phase liquide automatisée) avec un tampon de type MSP jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm est stable. Injecter le liquide surnageant dans la colonne et recueillir les fractions de pic.
   5. Mesurer les concentrations de nanodiscs dans les fractions de pic à 280 nm. En utilisant le coefficient d'extinction molaire de MSP1E3D1 (e = 29910 M ^-1 cm ^-1) pour le calcul de la concentration en nanodisc. Noter lanombre de lipides par nanodisc peut être mesurée par une combinaison de lipides radiomarqués et l' analyse des phosphates ⁴ ou par analyse du phosphate seul.

2. Préparation de la protéine monotopiques 5-lipoxygénase ³⁵

1. Préparer une culture de départ pendant la nuit. Supplément de 50 ml de milieu LB avec 100 ug / ml d'ampicilline. Inoculer le milieu avec de E. coli BL21 (DE3) contenant le plasmide du gène de la 5-lipoxygénase (ALOX5). Diluer la culture starter pendant une nuit dans du milieu d'expression contenant 42 mM de Na ₂ HPO ₄ mM KH ₂ PO _4, 9 mM de NaCl, 19 mM de NH ₄ Cl, 1 mM _MgSO4, 0,1 mM _CaCl2, 0,2% de D-glucose 24 0,1 %, 5 uM de FeSO ₄ et 100 pg / ml d' ampicilline. Cultiver les cellules jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ est ~ 0,5 à 25 ° C. Induire l' expression de protéines avec 0,2 mM d' IPTG pendant 16 heures à 20 ° C ^35.
2. Récolte par centrifugation pendant 10 min à 7000 xg et 4 ° C et jeter le surnageant. Peser le culot trouve au fond du tube contenant les cellules récoltées et remettre en suspension des cellules récoltées dans un tampon de lyse (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM de NaCl, 10% de glycerol et 1 mM de TCEP) contenant un inhibiteur de protéase et 0,5 mg / ml ³⁵ de lysozyme à raison de 2 ml de tampon de lyse par gramme de cellules.
3. Lyse des cellules par sonication pendant 5 x 15 s à 80% d'amplitude. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation pendant 10 min à 7000 x g et 4 ° C. Effectuer une précipitation au sulfate d' ammonium à 30-60% de saturation pour précipiter les protéines dans la solution ^35. Centrifugeuse pendant 15 min à 16 000 xg et 4 ° C. REMARQUE: La pastille 5LO peut être rapidement congelée et stockée à -80 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
4. Remettre en suspension le culot avec 20 ml de tampon de lyse et on centrifuge pendant 15 min à 40 000 x g et 4 ° C.
5. Incuber le surnageant sur une colonne d'agarose ATP à 4 ° C pendant 30 min. Laver la colonne une fois avec une colonne volume de tampon de lyse contenant 0,5 M de NaCl. Éluer le 5LO avec 20 mM d' ATP dans un tampon de lyse contenant 10 uM de FeSO ₄ et 20 pg / ml de catalase. Effectuer une Chromatographie par filtration sur gel pour éliminer l'ATP ^35.
   NOTE: Le 5LO est instable et doit être utilisé immédiatement après purification. Dans le cas contraire, il est recommandé de mettre fin à l'étape de précipitation du sulfate d'ammonium (voir la note après l'étape 2.1.3).

3. Préparation du complexe protéine-Nanodisc

1. Préparer un volume total de 100 ul de complexe. Mélanger 0,8 pM ND et 0,8 pM 5LO avec le présent du mM de Ca 1 dans le tampon standard MSP (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 0,5 mM et 1,5 mM de _CaCl2) et incuber pendant 10 min sur la glace. NOTE: L'échantillon peut être stocké pendant jusqu'à un mois à 4 ° C ^35.

ove_title "> 4. L'analyse des échantillons

1. L'électrophorèse sur gel
   1. électrophorèse non dénaturante
      1. Mélanger 15 ul de l'échantillon avec 5 pi de tampon de charge (mM BisTris 50, 6 N HCl, 50 mM de NaCl, 10% (p / v) de glycerol et 0,001% de Ponceau S, pH 7,2) ⁴⁹ et le charger sur un 4 - 16% de gel Bis-Tris pour effectuer l'électrophorèse.
      2. Remplir le réservoir de cathode avec un tampon lumière de cathode (50 bis mM de Tris; mM Tricine 50, pH 6,8 et 0,002% de Coomassie G-250) et le réservoir d'anode avec un tampon (50 mM de Bis Tris mM Tricine 50, pH 6,8) en cours d'exécution. Commencez la séparation en utilisant une tension constante à 150 V.
      3. Arrêter la séparation électrophorétique lorsque le front arrive à la fin de Coomassie du gel.
      4. Colorer le gel avec un protocole bleu norme Coomassie.
   2. électrophorèse dénaturant
      1. Mélanger 40 ul de l'échantillon avec 10 pl de tampon de charge contenant du SDS (0,05% (p / v) de bleu de bromophénol, 0,2 M de Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) de glycerol; 10% (p / v) de SDS; et 10 mM de 2-mercaptoéthanol) et le charger sur une 4 - gel à 20% de Tris glycine pour effectuer une électrophorèse.
      2. Remplir les réservoirs d'anode et de cathode avec un tampon de roulement (25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM de glycine et 0,1% (p / v) de SDS). Commencez la séparation en utilisant une tension constante à 150 V.
      3. Arrêter la séparation électrophorétique lorsque le front de chargement du colorant arrive à la fin du gel.
      4. Colorer le gel avec un protocole bleu norme Coomassie.
2. Préparation de la solution NaPT
   1. Dissoudre 1 g de sel phosphotungstate de sodium dans 50 ml d'eau par agitation à la température ambiante pour donner une 2% (p / v) de solution acide.
   2. Ajuster le pH à 7,4 avec 1 M de NaOH. Enlever les particules en utilisant un filtre à seringue de 0,22 um. Conserver la solution à la température ambiante ou à 4 ° C.
3. Préparation de l'échantillon pour l'analyse TEM
   1. Glow-décharge des grilles de cuivre revêtues de carbone (400 mesh) pendant 20 s à 30 mA pour rendre hydrophiles les grilles avant l'adsorption de l'échantillon. Placer 3,5 ul de l'échantillon (0,8 uM par rapport aux nanodiscs) sur la grille et laisser incuber pendant 30 s. NOTE: Le volume appliqué peut varier entre 2,5 et 5 pl, en fonction de la concentration de l'échantillon. Une gamme de concentration appropriée pour nanodiscs est de 0,5 - 1 uM.
   2. Éponger solution excédentaire en utilisant du papier filtre.
   3. Immédiatement tacher la grille avec une baisse de 2% NaPT pendant 30 s. Éponger l'excès de solution et de laisser la grille sécher à l'air.
   4. Évaluer les grilles par TEM. Un microscope à 120-200 keV tension d'accélération suffit d'estimer l'ampleur de l'empilement. NOTE: Pour le présent protocole, un microscope électronique à transmission calibré a été utilisé, équipé d'une émission de champ canon de 200 keV.
   5. Enregistrez les images TEM. Pour les images montrant de longues piles, ne traite pas plus loin; images montrent le complexe de nanodiscs, avec une protéine extrinsèque qui peut contenir quelquesshort stacks, mais la plupart des particules sont dans le complexe. Enregistrer plusieurs images et processus ces selon les méthodes standard pour obtenir la classe-moyenne et basse résolution, 3 modèle tridimensionnel du complexe.
      NOTE: Pour la collecte de données négatives-taches, les grilles ont été faites sur au moins trois jours différents. Pour chaque jour, incubations des échantillons frais (comme dans l'étape 3.1) ont été faites avant que la tache négative a été appliquée.

Résultats

La méthode que nous proposons dépend de la préparation de nanodiscs pour fournir la surface de la membrane pour la liaison protéine-membrane monotopique. Comme il n'y a pas de protéine transmembranaire incorporé dans la bicouche nanodisc lipidique, les nanodiscs sont ici désignés comme «nanodiscs vides» (figure 2A). Ceux - ci ont un poids moléculaire calculé de 256 kDa , pour une composition de deux protéines d'échafaudage et MSP1E3D1 environ 260 mo...

Discussion

La méthode peut être séparée en trois parties: la reconstitution de nanodiscs vides, la préparation de complexes protéine-nanodisc, et la coloration négative pour le TEM de ces complexes. Chaque partie sera traitée séparément en ce qui concerne les limites de la technique, des étapes critiques, et des modifications utiles.

Reconstitution des nanodiscs vides. étapes et les limites critiques dans la production et l'utilisation de nanodiscs.

Pour la pr?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid: POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate			500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock			50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer			20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer			In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer			In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth			Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL. Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.