Préparation et évaluation des<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marquée tridenté chélates de pré-ciblage utilisant Bioorthogonal Chemistry

Résumé

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate ^99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Résumé

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing ^99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with ^99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the ^99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Introduction

^99m Tc reste le radio - isotope dominant utilisé en médecine nucléaire diagnostique, avec plus de 50 millions de procédures d'imagerie effectuées par an dans le monde entier ^{1, 2, 3.} La majorité des agents ^99m Tc utilisés cliniquement sont radiopharmaceutiques de type perfusion. Il y a un nombre limité de composés activement ciblés dans lesquels ^99m Tc est dirigé pour lier un biomarqueur spécifique à travers la ligature à une construction de ciblage. La création de ^99m ciblée radiopharmaceutiques Tc est souvent entravée par l'influence de ^99m complexes Tc-ligand sur la capacité de la molécule de ciblage pour lier le biomarqueur d'intérêt, ou les isotopes demi-vie est pas assez long pour une utilisation avec des biomolécules de poids moléculaire élevé telles que des anticorps. Ce dernier nécessite généralement plusieurs jours avant que les images sont acquises pour que la biomolécule pour effacer de la non-cible tiss ues. Pré-ciblage propose une approche alternative pour surmonter ces défis.

Pré-ciblage combinée avec la chimie bioorthogonal a été montré pour être un moyen efficace de développer de nouvelles sondes d'imagerie moléculaire à la fois pour la fluorescence et la radio-imagerie ^{4, 5, 6, 7, 8.} La réaction de la demande d'électrons inverse de Diels-Alder (IEDDA) entre 1,2,4,5-tétrazine (Tz) et -cyclooctene trans (TCO) , ses dérivés, comme le montre la figure 1, a été montré comme étant particulièrement efficace ^6. La réaction IEDDA avec ces composants peut présenter une cinétique rapide dans du PBS (k ₂ ≈ 6.000 M ^-1 s ^-1) et une sélectivité élevée, le rendant idéal pour des applications in vivo pré-ciblage ^{9, 10.}

e_content "> L'approche la plus couramment utilisée consiste à administrer un vecteur de ciblage TCO dérivés et à la suite d' une période de retard suffisant, un tétrazine radiomarqué est administré. tétrazines radiomarqués sur la base de ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr, et ¹¹¹ en ont été rapporté ^{11, 12, 13, 14, 15.} en revanche, il n'y a qu'un seul rapport d'une ^99mTc marqué Tz, qui a été préparé en utilisant un ligand de type HYNIC nécessitant l'utilisation de co-ligands pour éviter la liaison aux protéines et à la dégradation in vivo , ^16. a titre d'alternative, nous rapportons ici la synthèse de ^99mTc (I) marqué tétrazines en utilisant une famille de ligands qui forment des complexes stables avec un tridentate ^[99mTc (CO) _3] ⁺ noyau.

Figure 1: La réaction IEDDA bioorthogonal entre tétrazine et -cyclooctene trans. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La famille de ligands préparés contiennent des chélates tridentés qui varient en polarité et de la nature du groupe de liaison entre la région de liaison métallique et la Tz (figure 2). L'objectif était d'identifier un ^99m Tc-tétrazine construire qui pourrait efficacement localiser et de réagir avec des sites TCO marqués in vivo et rapidement clair lorsqu'ils ne sont pas liés, afin de produire une valeur cible élevée à non-cible ratios. Pour tester les ligands, un TCO-dérivé d'un bisphosphonate (TCO-BP) a été utilisé ^17. Nous avons montré précédemment que le TCO-BP se localise dans les zones du métabolisme osseux actif et peut réagir avectétrazines radiomarqués in vivo ^18. Il est un réactif commode pour tester de nouveaux tétrazines, car il peut être préparé en une seule étape et les expériences peuvent être effectuées chez des souris normales lorsque la localisation a lieu principalement au niveau des articulations (genoux et des épaules).

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Protocole

Les études animales ont été approuvées par le Comité d'éthique de la recherche animale à l'Université McMaster en conformité avec Conseil canadien de protection des animaux (CCPA) Lignes directrices.

1. Ligands de radiomarquage Tz-tridentate avec ^99mTc

ATTENTION: Les procédures suivantes nécessitent l'utilisation de composés radioactifs. Le travail ne doit être effectué dans un laboratoire agréé par le respect des règles de sécurité et d'élimination. Les réactions à micro-ondes doivent être effectuées dans un four micro-ondes conçu spécifiquement pour la synthèse chimique.

1. Synthèse du ^[99mTc (CO) ₃ (H ₂ O) _3] ^{+ 19, 20}
   1. Dans un flacon à micro - ondes, mélanger 8 mg de K ₂ [BH ₃ CO _2], 15 mg de Na ₂ CO _3, 20 mg de Na ₂ B ₄ O ₇ · 10H ₂ O et 25 mg KOCO [CH (OH)]₂ COONa · 4H ₂ O. Purge le flacon pendant 10 minutes avec du gaz argon.
   2. Ajouter 4 ml de ^99m TcO ₄ ^- (~ 1100 MBq, ~ 30 mCi) dans du sérum physiologique à 0,9% au flacon.
   3. Chauffer le mélange réactionnel dans un micro-ondes pendant 3,5 minutes à 110 ° C, après 10 s d'agitation pour assurer un mélange intime des réactifs.
   4. Ajuster le pH de la solution à 3,5-4 à l'aide ~ 400 ul de HCl 1 M. Vérifiez en utilisant du papier pH.
2. Radiomarquage des ligands 1-5 tétrazine
   1. Dissoudre 2 mg de chaque ligand (composés 1-5) dans 250 ul de MeOH ^21.
   2. Ajouter 250 ul de ^[99mTc (CO) ₃ (H ₂ O) _3] ⁺ (~ 74 MBq ~ 2 mCi) à chaque solution.
   3. Chauffer le mélange réactionnel à l'aide d'un four micro-ondes pendant 20 min à 60 ° C.
      REMARQUE: Cette étape est identique pour tous les 5 tétrazines.
   4. Pour les composés 2 à 5, évaporer le solvant et re-dissolve les produits obtenus dans 1 ml de 1: 1 v / v DCM: TFA.
   5. Chauffer les produits réactionnels dissous (2-5) à 60 ° C dans un four micro - ondes pendant 6 min (2-4) ou 10 min (5).
   6. Après refroidissement à température ambiante, évaporer le solvant en utilisant un évaporateur (36 ° C, de 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) et on dissout le composé séché dans 1: 1 d' ACN: H ₂ O ou 1: 1 MeOH: H ₂ O, avant la purification par HPLC.
   7. Purifier les ^99m Tc-composés marqués (1-5), y compris la séparation du produit marqué du ligand tétrazine non marqué, par HPLC (C ₁₈ en phase inverse). Typiquement, en utilisant un gradient d'élution de 30:70 d' ACN: H ₂ O (tous deux avec 0,1% de TFA) à 40:60 d' ACN: H ₂ O de plus de 20 min (18 min) et une colonne 4,6 x 100 mm C ₁₈ analytique. Utilisez les deux UV (254 nm) et la détection gamma.
      1. Prenez un petit échantillon de chaque produit étiqueté et de comparer son temps de rétention HPLC à celle d'un co-injète, non radioactif, norme réétiquetée (0,125 mg dans 20% de méthanol-H ₂ O). La norme de Re-marqué est identifié dans la trace HPLC UV, et éluer en même temps que le ^99m Tc composé marqué dans la trace γ-HPLC. Cette co-injection présente des pics aux temps de rétention comparable, ce qui confirme l'identité du composé ^99m marqué par Tc.
   8. On évapore le solvant des fractions HPLC en utilisant un évaporateur (36 ° C, de 8 mbar, 3 min, 6000 rpm).
   9. Formuler le composé purifié à une concentration de 7,4 kBq / pl dans du PBS contenant 0,5% de BSA et 0,01% de Tween-80.
   10. Pour garantir que les composés marqués sont stables, effectuer une étude in vitro de la stabilité. Incuber le composé formulé à 37 ° C pendant 1, 4 et 6 h, en injectant une petite quantité (3,7 MBq) du mélange sur la HPLC à chaque point de temps pour évaluer la stabilité.

2. Les études Bio-distribution de pré-ciblés

1. Préparation des animaux
   1. Utilisation de vieux 7-9 semaine souris Balb / c, femelles (n = 3), administrer TCO-BP formulé dans une solution saline (20 mg / kg) (5 ug / ul), par injection de queue veineuse.
   2. Placez la souris dans le dispositif de contrainte physique, et d'identifier les veines situées sur les surfaces latérales de la queue et essuyer avec un tampon imbibé d'alcool. À environ 2 cm de l'extrémité de la queue, à insérer une aiguille de calibre 30 à un angle faible, parallèlement à la veine. Appuyer lentement sur le piston pour injecter, retirer l'aiguille et appliquer éponge propre et de gaze sur le site d'injection avec une légère pression jusqu'à ce que le saignement cesse.
   3. À 1 h après l' injection de TCO-BP, administrer ~ 0,74 MBq (20 uCi) de ^{99mTc-tétrazine} formulés dans 100 ul de 0,5% de BSA, 0,01% de Tween-80 dans du PBS, par injection de la veine de queue.
2. Études Bio de distribution
   1. Au point de temps désiré (t = 6 h), anesthésier les souris en utilisant 3% d'isoflurane et le mélange de gaz d'oxygène de 2%. Démontrer àe pincée retrait sur la souris anesthésiée pour assurer qu'ils sont sous plan chirurgical de l'anesthésie.
   2. Recueillir du sang (1 ml) par ponction cardiaque en utilisant une seringue pré-traitée avec de l'héparine. Placez la souris sur le dos avec le nez dans le cône de nez pour l'anesthésie continue et de localiser le processus xiphoïde sur l'animal.
      1. Insérez une aiguille G 25, légèrement à gauche de la ligne médiane de l'animal dans le cadre du processus xiphoïde, à un angle de 20 °. Insérez complètement l'aiguille et tirez lentement sur le piston pour voir le sang dans le moyeu de l'aiguille si le cœur a été perforé. Légèrement réajuster l'aiguille tout en maintenant le piston si nécessaire, pour percer le cœur. Aspirez lentement le sang dans la seringue.
   3. Euthanasier l'animal par dislocation cervicale, alors que sous anesthésie.
   4. Placez chaque animal dans un sac en plastique et utiliser un calibrateur de dose ^(99m Tc de réglage) pour mesurer l'ensemble du niveau d'activité du corps.
   5. Recueillir les tissus et les fluides suivants en pré-peséeed compter tubes: le sang, les os (genou et de l'épaule), la vésicule biliaire, les reins, le foie, l'estomac (avec le contenu), l'intestin grêle (avec contenu), gros intestin et le caecum (avec contenu), de la thyroïde et de la trachée, de la vessie avec de l'urine , et la queue.
   6. Rincer les tissus appropriés (à l'exclusion du sang, de la vésicule biliaire et de la vessie) dans PBS pour éliminer le sang et le sécher avant de placer les tissus dans des tubes de comptage appropriés.
   7. Placez la carcasse de l'animal dans un sac en plastique et mesurer l'activité du corps entier résiduel en utilisant un calibrateur de dose.
   8. Peser chaque tube contenant un échantillon de tissu. Soustraire poids initial du tube pour obtenir la masse du tissu.
   9. Utiliser un calibreur de dose ^(99m de réglage Tc) pour mesurer la quantité d'activité dans un échantillon d'essai (100 ul) au moment de l' injection pour chaque souris.
      REMARQUE: Cet échantillon d'essai est égal au volume d'injection, ce qui donne le compte de l'activité au moment de l'injection.
   10. Au moment de la mesure de tissu, unliquot 5 ul de l'échantillon d'essai utilisé précédemment. Utilisez un compteur gamma multi-détecteur ^(99m de réglage Tc) et compter pour obtenir le nombre par minute (CPM) pour l'échantillon d'essai de 5 pi.
   11. Utilisez les deux valeurs obtenues en 2.2.9 et 2.2.10 pour calculer l'activité et la relation CPM en utilisant l' équation 1 pour obtenir un facteur de conversion (CPM uCi ^-1).
       (1)
   12. Utiliser le compteur de rayons gamma pour mesurer la quantité de radioactivité dans chaque échantillon de tissu ou de fluide.
   13. Utiliser l'équation 1 pour calculer la quantité d'activité dans chaque tissu ou de liquide au moment de la mesure par rapport à la dose totale injectée. Cette valeur est ensuite normalisée en fonction du poids des organes et rapportée comme dose injectée par gramme pour cent ( par exemple,% ID / g) de tissu.
   14. Suivez les étapes 2.1.2 à 2.2.13 pour mener une expérience de contrôle négatif en utilisant les ^99m Tc marqué ligands tétrazine dans le Absence du TCO-BP. Sacrifice des souris (n = 3) après l'injection de 0,5, 1, 4 et 6 h, et d'obtenir un tissu ou d'un fluide tel que décrit ci-dessus.

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Résultats

Les ligands ont été synthétisés en utilisant différents agents de liaison et des chélateurs via une stratégie simple d'amination réductrice (figure 2), suivie par le couplage du produit à un tétrazine disponible dans le commerce ^{22, 23.} Le radiomarquage a été réalisé en utilisant la même méthode que pour tous les composés et a été hautement reproductible. Le processus a été optimisé en f...

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Discussion

Une collection de tridentes chélates tétrazine liés de différentes polarités a été préparé, et l'utilité de leurs complexes ^99m Tc dans la réaction IEDDA avec un dérivé TCO in vivo a été évaluée. Un procédé de marquage ^99mTc efficace et reproductible a été développée pendant cinq tétrazine chelates, où la concentration de ligand était de 10 ^-3 M. L'étape de marquage est suivie par une déprotection des groupes butyle T- (pour les compo...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon gas	Alphagaz	---	---
Na2CO3	EMD Millipore	106395	---
Na2B4O7·10H2O	Anachemia	S9640	---
KNaC4H4O6·4H2O	Anachemia	217255	---
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	---	Source of 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	---	To elute generator
1 M HCl	Lab Chem	---	---
MeOH	Caledon	---	---
ACN	Caledon	---	HPLC grade
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	---
DCM	Caledon	---	---
TFA	Caledon	---	---
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1x
BSA	Sigma Aldrich	A7906	---
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	---
Isoflurane	CDMV	108737	Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	---
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serial # V1041	---
Dose calibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	---
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	---
Animal room scale	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	---
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL