Blessure à la gorge aortique murine: une efficacité<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de prolifération des cellules musculaires lisses et fonction endothéliale

Résumé

La restéose après les interventions cardiovasculaires (chirurgie de pontage, angioplastie ou stent) est un problème important qui réduit la durabilité de ces procédures. Une thérapie idéale inhiberait la prolifération des cellules musculaires lisses (VSMC) tout en favorisant la régénération de l'endothélium. Nous décrivons un modèle pour l'évaluation simultanée de la prolifération de VSMC et de la fonction endothéliale in vivo.

Résumé

La reconstruction artérielle, qu'il s'agisse d'une angioplastie ou d'une chirurgie ponctuelle, implique un traumatisme iatrogène causant une perturbation endothéliale et une prolifération de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). Les modèles murins communs étudient de petits vaisseaux tels que les artères carotide et fémorale. Dans ce cas, nous décrivons un système in vivo dans lequel la prolifération de VSMC et la fonction de barrière endothéliale peuvent être évaluées simultanément dans un grand vaisseau. Nous avons étudié la réponse de l'aorte infrarénale aux blessures chez les souris C57BL / 6. L'aorte a été blessée de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique par 30 écrasements transmuraux de 5 secondes avec un applicateur à pointe de coton. Les changements morphologiques ont été évalués avec une histologie conventionnelle. L'épaisseur de la paroi de l'aorte a été mesurée de la surface luminal à l'adventice. L'intégration EdU et le contre-coloration avec DAPI et alpha-acttin ont été utilisés pour démontrer la prolifération de VSMC. L'activation de ERK1 / 2, un modérateur connu de formation d'hyperplasie intimale, a été dissuadéeExtraite par l'analyse Western Blot. L'effet de l'inflammation a été déterminé par l'immunohistochimie pour les cellules B, les lymphocytes T et les macrophages . Les sections en face de l'endothélium ont été visualisées avec microscopie électronique à balayage (SEM). La fonction de barrière endothéliale a été déterminée avec une coloration Evans Blue. Les lésions transmissibles ont entraîné un épaississement de la paroi aortique. Cette blessure a induit la prolifération de VSMC, plus en évidence à 3 jours après la blessure, et une activation précoce de ERK1 / 2 et une diminution de l'expression de p27 kip1. Les lésions n'entraînaient pas une augmentation de l'infiltration des cellules B, des lymphocytes T ou des macrophages dans la paroi du vaisseau. Les lésions ont provoqué une dénudellation partielle de cellules endothéliales et une perte de contact cellulaire. Les blessures ont entraîné une perte significative de la fonction de barrière endothéliale, qui est revenue à la ligne de base après sept jours. Le modèle de blessure aortique émoussée transmural murine fournit un système efficace pour étudier simultanément la prolifération de VSMC et la fonction de barrière endothéliale dans un grand vaisseau.

Introduction

La rhinésie Les procédures cardiovasculaires (bypass chirurgical, angioplastie ou stent) constituent un problème important qui réduit la durabilité de ces procédures. Toutes les procédures de revascularisation sont en proie à la resténose. Les stratégies actuelles pour prévenir la resténose (stents à élution médicamenteuse et ballons enduits de médicaments) inhibent à la fois la cellule musculaire lisse vasculaire (VSMC) et la prolifération des cellules endothéliales (EC). Par conséquent, ces interventions empêchent la resténose médiée par VSMC, mais empêchent également la régénération de l'endothélium. Sans un endothélium intact, les patients doivent être sur des agents antiplaquettaires puissants pour diminuer le risque de thrombose in situ au risque de complications saignantes. Une thérapie idéale inhiberait la prolifération de VSMC tout en favorisant la régénération de l'endothélium. Ainsi, il est nécessaire d'étudier simultanément la prolifération de VSMC et la fonction de barrière endothéliale i n vivo .

À l'heure actuelle, il y a desTous les modèles de souris de resténose ¹ . Ces modèles comprennent la ligature de la carotide et l'altération du fil de l'artère fémorale ² . Les modèles aortiques comprennent le placement de stent ³ , la blessure par ballonnet ⁴ et l'allogreffe aortique ⁵ . Tous les modèles actuels sont limités. La ligature carotidienne génère une lésion neointimale médiée par un flux et n'a pas de lésion endothéliale. De plus, les artères carotides et fémorales ont beaucoup moins de couches cellulaires que les vaisseaux humains, ce qui limite leur valeur de traduction. L'aorte de la souris, d'environ 1,3 mm de diamètre, est le seul vaisseau qui se rapproche d'une artère humaine (coronaire) cliniquement pertinente (3).

Malgré le potentiel de traduction des modèles aortiques murins de la maladie, les modèles actuels ont des limites. Ces modèles nécessitent des compétences microchirurgicales avancées et des équipements spécialisés tels que les ballons et stents d'angioplastie. Nous présentons iciUne nouvelle technique reproductible pour induire simultanément la prolifération de VSMC et perturber la fonction de barrière endothéliale.

Protocole

Déclaration d'éthique: les protocoles pour la manipulation des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Maryland (numéro de protocole 0416009) et ont été conduits selon les normes AAALAC-International.

1. Procédure chirurgicale

1. Technique anesthésique
   1. Stériliser tous les instruments utilisés dans la chirurgie de survie avec stérilisation à la vapeur à 121 ° C pendant 30 min.
   2. Induire l'anesthésie par un réservoir d'induction avec 100% O ₂ et 2,5% d'isoflurane livré par vaporisateur de précision. Après l'induction, arrêter l'isoflurane et rincer la chambre avec O ₂ . Maintenir l'anesthésie avec 1,5-2% d'isoflurane par masque facial et 1 L / min O ₂ par inhalation.
   3. Fixez à la fois la chambre d'induction et le masque facial à un abatteur de charbon pour l'adsorption des gaz d'échappement pour protéger le personnel. Assurer un plan anesthésique adéquat par démonstrationEn ce sens qu'il n'y a pas de réponse aux stimuli nocifs (pincement de l'orteil).
   4. Créez un champ opératoire composé d'un bac chirurgical avec un tampon isotherme pour fournir un support thermique pendant la chirurgie. Un coussin isotherme supplémentaire fournira un support thermique aux animaux dans leur cage de récupération.
2. Préparation animale
   1. Effectuer l'enquête suivante sur des souris C57BL / 6 mâles de 10 à 12 semaines.
   2. Retirer les cheveux sur la surface ventrale abdominale de l'animal du sternum à la région inguinale avec un agent dépilatoire ou une tondeuse électrique avec une lame numéro 40.
      1. En cas d'agent dépilatoire, appliquer ce composé dans la zone chirurgicale pendant 2-3 min, puis retirer avec du coton. Nous utilisons un composé d'hydroxyde de calcium et d'hydroxyde de sodium disponible dans le commerce.
   3. Préparer la zone sur l'épaule avec 70% d'alcool et injecter par voie sous-cutanée du carprofène (5 mg / kg) avec une aiguille de calibre 25 ou plus petite. CeLe traitement offrira une analgésie postopératoire pour l'animal.
   4. Transférer l'animal sur le champ chirurgical et le positionner en recule dentaire.
   5. Préparez le site chirurgical en éliminant 8-12% de providone-iodé avec un applicateur de coton propre ou une gaze de coton. Puis rincer la peau deux fois avec 70% d'alcool.
   6. Placez le lubrifiant oculaire dans les deux yeux pour réduire l'incidence de la dessiccation de la cornée. Couvrez le site chirurgical avec un drap stérile.
3. Technique opérationnelle
   1. Faire une incision médiane de laparotomie abdominale d'environ 2 à 2,5 cm de longueur avec un scalpel commençant immédiatement le processus de xiphoïde caudal et s'étendant vers le bassin.
   2. Mobiliser l'intestin grêle et le duodénum et réfléchir latéralement vers la droite. Enrouler une bande de coton stérile gazée et trempée avec une solution saline stérile pour injecter pour permettre l'emballage des viscères afin d'améliorer l'exposition.
   3. Avec l'intestin grêle mobilisé sur le côté droit de laAbdomen, exposer le retroperitoneum et exposer l'aorte abdominale de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique ( figure 1 ).
   4. Avec un applicateur stérile à pointe de coton, livrer 30 écrasements consécutifs, chaque cinq secondes de durée.
   5. Retirez l'emballage et permettez aux viscères de revenir à leur position native.
   6. Faisceau fermé avec une suture monofilament absorbable 4-0 (polydioxanone). La peau est fermée avec une suture de monofilament non-absorbable 6-0 (nylon).
4. Recouvrement et soins post-procédure
   1. Après la procédure, placez l'animal dans une cage de récupération avec un linge de lit propre sur un tampon isotherme pour continuer le support thermique jusqu'à ce que l'animal puisse ambuler normalement. Ne laissez pas l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il démontre la capacité de maintenir le recul sternal.
   2. Surveiller l'animal toutes les heures pour les 4 premières heures après la chirurgie. Une fois que l'animal est en ambulance, il retourne normalement i T à la salle d'élevage assignée. L'animal ne sera pas logé en compagnie d'un autre animal jusqu'à ce qu'il soit totalement récupéré.
   3. Surveiller l'animal deux fois par jour pendant les 72 premières heures après la chirurgie et au moins 3 fois par semaine par la suite. La surveillance comprend la pesée de l'animal trois fois par semaine.
   4. Administrer le carpofen (5 mg / kg) par voie sous-cutanée deux fois par jour pendant les 72 premières heures après l'intervention chirurgicale.

2. Approvisionnement en tissu

1. Méthode de l'euthanasie
   1. Éuthaniser les animaux à des points de temps prédéterminés.
   2. Induire l'anesthésie par un réservoir d'induction avec 100% O ₂ et 2,5% d'isoflurane livré par vaporisateur de précision.
      1. Pour étudier l'intégrité de l'endothélium, administrer le colorant bleu Evans à l'animal.
         NOTE: Evans Blue est un colorant azoïque chargé négativement avec une forte affinité de liaison pour l'albumine et ne peut colorer que les vaisseaux sanguins en l'absence d'un endothélium intactS = "xref"> 6.
      2. Pour les études d'intégrité endothéliale, au moment de l'euthanasie, perfuser les animaux avec 5 ml de colorant Evans Blue 0,3% suivi de 5 ml de PBS à la pression physiologique pendant 5 min. L'animal est maintenu dans un plan chirurgical d'anesthésie pendant la procédure de perfusion.
   3. Après avoir atteint un plan anesthésique profond, ouvrez la poitrine avec une sternotomie. Faire une lacération dans l'oreillette droite pour permettre le drainage du sang de l'animal et accéder au ventricule gauche est accessible avec une aiguille de 21 G et injecter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu'à ce que l'effluent de l'oreillette droite soit dégagé.
   4. Après perfusion avec PBS, entre dans l'abdomen par une incision de la ligne médiane.
   5. Encore une fois, mobiliser l'intestin grêle sur le côté droit de l'abdomen exposant l'aorte infrarouge, disséquer fortement l'aorte des tissus adjacents et l'accise de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique.
   6. Conserver l'aorte excisée dans un paraformald à 4%Solution d'ehyde jusqu'à ce que le traitement du tissu se produise.
      1. Pour les études d'intégrité endothéliale, ouvrez l'aorte longitudinalement et fixez-la sur une feuille de cire exposant l'intégralité de la surface luminaire ⁶ . Effectuer une évaluation qualitative de l'intégrité endothéliale par degré de coloration avec du colorant Evans Blue ⁶ .
      2. Pour d'autres analyses histologiques, sectionnez l'aorte transversalement et insérez-la dans des composés optimaux de température de coupe (OCT) selon la méthode histologique à utiliser ⁷ .

Résultats

Les sections transversales aorte encastrées dans OCT ont été sectionnées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine, puis contre le coloris avec Verhoeff-Van Gieson (VVG) pour identifier la lame élastique interne et externe ⁷ . L'épaississement de la paroi aortique induit un épaississement de la paroi aortique par rapport aux aortas des animaux traités avec une procédure simulée (laparotomie et mobilisation intestinale seule). L'...

Discussion

Nous avons caractérisé les effets d'un modèle de blessure aortique murine qui se traduit par une hyperplasie médiale et un dysfonctionnement de la barrière endothéliale. Le détachement partiel de CE le long de l'intima de l'aorte a accompagné la perte de contact cellulaire et l'amélioration des protrusions cellulaires. De manière correspondante, la fonction de barrière endothéliale a été considérablement altérée, ce qui a stimulé les voies de signalisation sensibles aux mitogènes, entr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis