La purification d'affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

Résumé

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Résumé

La purification de la protéine-protéine active et des complexes protéine-acide nucléique est cruciale pour la caractérisation des activités enzymatiques et la détermination de novo de nouvelles sous - unités et les modifications post-traductionnelles. Les systèmes bactériens permettent l'expression et la purification d'une grande variété de polypeptides simples et complexes protéiques. Cependant, ce système ne permet pas la purification des sous - unités protéiques qui contiennent des modifications post-traductionnelles (par exemple, la phosphorylation et acétylation), et l'identification de nouvelles sous - unités régulatrices qui sont seulement présents / exprimées dans le système eucaryote. Ici, nous fournissons une description détaillée d'un roman, robuste et méthode efficace de purification par affinité en tandem (TAP) en utilisant streptomycine et des protéines FLAG-tagged qui facilite la purification de complexes protéiques avec transitoirement ou exprimé de manière stable des protéines de marquage épitopique à partir de cellules eucaryotes. Ce protocole peut être appliqué pour caractériser protein fonctionnalité complexe, pour découvrir les modifications post-traductionnelles sur des sous-unités complexes, et d'identifier de nouveaux composants réglementaires complexes par spectrométrie de masse. En particulier, cette méthode TAP peut être appliquée à l'étude des complexes protéiques formés par des composants ou eucaryotes pathogènes (virus et bactéries), ce qui donne ainsi un large éventail de possibilités expérimentales en aval. Nous proposons que les chercheurs travaillant avec des complexes de protéines pourraient utiliser cette approche dans de nombreuses façons différentes.

Introduction

Les interactions protéine-protéine (IPP) sont essentiels pour la régulation précise des processus biologiques ^1, et d' autres études sur ces IPP peut indiquer leur fonction ^2. Plusieurs approches ont été mises au point pour l'étude et la caractérisation des IPP, ainsi que pour l'identification de novo de nouveaux composants régulateurs protéiques. En 1989, les champs et les collègues Stanley a signalé la levure à deux hybrides (Y2H) dosage ^3. Cette approche permet l'identification impartiale et complète de interacteurs (proies) pour une protéine d'intérêt définie (appât) dans Saccharomyces cerevisiae. En plus de son utilité pour la découverte remarquable PPIs, le dosage Y2H peut être utilisé pour caractériser des paires de protéines dans des cellules de levure, en définissant des domaines d'interaction minimale, et l'identification des mutations qui suppriment ces interactions. En modifiant le dosage de Y2H, IPP peut également être étudié dans des cellules de mammifèresclass = "xref"> 4. Les variations du dosage Y2H (par exemple, le système à trois hybrides de levure) peuvent également être appliqués à l' étude de protéines et d' ARN interactions ligand organique à petites protéines dans les cellules.

Un autre outil couramment utilisé pour étudier les IPP dans un système homologue est le co-immunoprécipitation (co-IP) dosage ^5. En utilisant un anticorps à immunoprécipiter une protéine d'intérêt, le test de co-IP permet aux chercheurs de surveiller IPP dans le traitement des cellules pour diverses conditions environnementales et des situations expérimentales. L'utilisation de protéines de marquage épitopique (par exemple, FLAG, Myc, STREP, et HA, entre autres) dans la purification d'affinité (AP) méthodes a facilité l'isolement de protéines à partir de mélanges de protéines complexes pour plusieurs essais en aval, y compris western blot, tache d' argent et l'analyse enzymatique. Cependant, aucune de ces approches antérieures permettent l'isolement de grandes quantités de complexes de protéines pour une caractérisation ultérieure in vitro , y compris unssays, découverte de sous-unités régulatrices par spectrométrie de masse, et l'identification des modifications post-traductionnelles. Une version améliorée du procédé est appelé AP AP tandem (TAP), qui est une technique de purification pour l' étude des IPP en créant une protéine de fusion avec deux epitopes qui est purifié par deux points d' accès ultérieurs ^{6, 7.} Dans cet article, nous présentons une variante de la méthode de TAP pour les complexes protéiques de purification dans lequel deux sous-unités sont marqués avec différents épitopes, puis purifiés par deux points d'accès séquentiels (STREP AP suivi par FLAG IP). Nous fournissons d' abord un aperçu de la TAP minimalistic (Figure 1), puis une description détaillée de toutes les étapes expérimentales (Figure 2), de sorte que les chercheurs puissent les appliquer à leur complexe de protéine d'intérêt.

Pour démontrer l'applicabilité de la méthode TAP, nous avons choisi une cycline-CDK bien caractérisé complexe (appelé PTEFB kinase), qui est composé de la cycline T1 de sous - unité régulatrice (CycT1) et une kinase (CDK9), et est impliqué dans la régulation de la transcription par l' ARN polymérase II (Pol II) ^{8, 9, 10.} P-TEFb phosphoryle le domaine C-terminal de Pol II et ses associés des facteurs d'élongation négative, ce qui soulage pause de la transcription au niveau du promoteur et facilite ainsi la transcription d' allongement ^{11, 12, 13.} Avec cette interaction connue à l'esprit, STREP-tagged CycT1 et CDK9 FLAG marqués étaient surexprimés dans les cellules HEK293T. Une expérience TAP réciproque a été réalisée avec CDK9 et étiquetée FLAG étiquette strep CycT1 pour valider en outre que l'interaction des protéines est indépendante des épitopes utilisés. Les cellules ont été recueillies et lysées 48 heures après transfection. Le lysat soluble a été purifié par TAP (STREP AP suivie par FLAGIP). D' entrée et de protéines purifiées ont été analysées par Western Blot et coloration à l' argent (figure 3).

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Protocole

1. Cellules Placage

1. Un jour avant la transfection, la plaque de 3,5 x 10 ⁶ cellules HEK293T dans 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% (v / v) de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml stock) par boîte de 100 mm. Planche 3 - 5 boîtes de 100 mm par expérience / la condition pour assurer la récupération des protéines suffisante.
   REMARQUE: Le nombre de plaques doit être déterminé pour chaque expérience / condition, qui reposera sur les niveaux d'expression et de la solubilité du complexe de protéine d'intérêt. Par ailleurs, si la purification à plus grande échelle est nécessaire, les lignées cellulaires peuvent être adaptées pour se développer dans des suspensions dans des flacons spinner ^2, mais cette méthode ne fonctionnera pas pour les transfections transitoires.

2. transfection de cellules ou Induire lignées cellulaires stables

1. Le lendemain, vérifier les cellules au microscope. Les cellules doivent être de 70 - 80% confluentes avant proceeding.
2. Transfecter les cellules avec un mélange total de 7 pg d'ADN de plasmide et 21 ul de réactif de transfection par boîte de 100 mm. Transfecter des cellules avec un vecteur exprimant la GFP (Tableau 1) en tant que contrôle pour l' efficacité de la transfection.
   Remarque: Si l'on utilise un HEK293 T-Rex ou une ligne semblable cellulaire stable qui induit l'expression de deux ou plus complexes des sous - unités en réponse à la doxycycline ^{14, 15,} l'inducteur devra être ajouté aux cellules et incubé pendant 48 heures. De même, une lignée cellulaire stable qui induit l'expression de la GFP lors de l'addition de l'inducteur serait également requis à des fins de validation. Passez à l'étape 2.7.
3. Préparer le mélange de transfection par boîte de 100 mm. Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 500 pi de DMEM non supplémenté avec 7 pg d'ADN plasmidique totale (correspondant à deux ou plusieurs plasmides). Dans un tube de microcentrifugeuse, mélanger 500 pi de DMEM non supplémenté wie 21 pi du réactif de transfection. Répétez l'opération pour chaque réaction de transfection.
4. Pipeter la solution de réactif de transfection dans la solution d'ADN du plasmide (ne solutions dans l'ordre inverse de mélange). Mélanger par pipetage au moins 4 fois.
5. Faire incuber ce mélange à la température ambiante pendant 10 à 15 minutes, mais pas plus de 15 min.
6. Inclinez la plaque pour créer un réservoir de médias et de la pipette le mélange de transfection goutte à goutte sur le côté intérieur de la plaque sans déranger les cellules avec soin. Remettre le plat à sa position originale plat et agiter doucement pour distribuer le mélange.
7. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié de culture cellulaire avec 5% de CO ₂ (cette condition est appelé ci - après "incubateur de culture tissulaire»). Remplacer les médias 5 heures après la transfection (en option).

3. Vérification Transfection ou Induction efficacité

1. À 24 h post-transfection, visualiser les cellules sous une grippemicroscope orescent pour vérifier l'efficacité de transfection (ou l'induction de contrôle HEK293T-REx lignée cellulaire stable exprimant la GFP). Incuber pendant 24 h.

4. STREP Affinity Purification (STREP AP)

1. La collecte des cellules
   1. A 48 heures post-transfection, retirez le support et ajouter 8 ml de solution saline 1x froide tamponnée au phosphate (PBS). Pipeter vers le haut et vers le bas pour détacher les cellules de la plaque.
   2. Recueillir et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 ml et tourner les cellules vers le bas à 800 g pendant 4 min à 4 ° C.
   3. Retirer le surnageant PBS. Répéter la rotation vers le bas (800 g pendant 1 min à 4 ° C) pour éliminer tout PBS résiduel. Stocker le culot cellulaire à -80 ° C pour une utilisation ultérieure ou suivez la procédure ci-dessous pour continuer la purification des protéines.
2. Lyser les cellules
   1. Remettre en suspension les culots cellulaires à l'aide de 5 x le volume du culot cellulaire (~ 250 ul par plaque) de tampon de lyse passive(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1,5 mM de _MgCl2, 1 mM de DTT, de la protéase comprimé inhibiteur de cocktail, 5% v / v glycérol et 1,0% de NP-40) et à transférer la suspension cellulaire à un 1,5 ml de tube de microcentrifugeuse.
   2. vortex brièvement la suspension et nutation pendant 30 min à 4 ° C.
   3. Isoler la suspension cellulaire à 10.000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
   4. Transférer les lysats solubles dans un nouveau tube de 1,5 ml et jeter les culots cellulaires. Économisez 10% du volume final du lysat soluble "STREP AP entrée." Conserver à 4 ° C.
3. Équilibrant les perles de STREP
   NOTE: perles Utilisez STREP pour la première étape AP! Complexes tiré vers le bas avec des perles de STREP récupérer beaucoup plus de protéines que celles tiré vers le bas avec des perles de FLAG.
   1. Sortez (n × 40 pi) + n pl de la STREP perle bouillie à 50% (n = nombre d'échantillons) et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C.
      REMARQUE: Utilisez l'échelle mconseils outhed à perles de pipette.
   2. Retirer le surnageant et ajouter 500 pi de PLB aux billes. Nutation le mélange des perles pendant 5 min à 4 ° C. Isoler à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C.
      1. Répétez l'opération pour un total de 3 lavages. Remettre en suspension les billes dans PLB à un volume final de 40 ul nx.
   3. Ajouter 40 ul de 50% STREP bourrelet suspension pour chaque échantillon de lysat cellulaire et nutation pendant 2 heures à 4 ° C.
4. STREP AP
   1. Isoler solution à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C.
   2. Retirer le surnageant et le magasin comme «STREP AP accréditives (FT)" à 4 ° C.
   3. Ajouter 500 pi de tampon de lavage STREP AP I (Tris-HCl 20 mM , pH 7,5, 250 mM de NaCl, 1,5 mM de _MgCl2, 1 mM de DTT, 5% de glycerol et 0,2% de NP-40) pour les billes. Nutation le mélange des perles pendant 5 min à 4 ° C et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
      1. Répétez l'opération pour un total de 4 lavages.
         NOTE: Avant le quatrième lavage, transférer la solution de perles à un nouveau tube de 1,5 ml pour réduire l'arrière-plan de la protéine. Cette étape est essentielle.
   4. Ajouter 500 pi de tampon de lavage II (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM et EDTA 1 mM) et équilibrer les billes en inversant les tubes. Isoler à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
   5. Éluer la protéine d'intérêt avec 50 pi de tampon d'élution STREP (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM et 2,5 mM desthiobiotine). Vortex à 800 rpm pendant 15 min à 4 ° C.
   6. Isoler les perles à 1500 g pendant 1 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant. Cette fraction correspond à l'échantillon "STREP AP Elution».
   7. Enregistrer la fraction de perles à 4 ° C pendant une deuxième élution, ce qui pourrait conduire à la moitié de la quantité de protéine obtenue avec la première élution. Aliquote de 10% du PA STREP Elution pour la coloration d'argent et / ou le transfert de western^16.
5. Équilibrant les perles FLAG
   1. Sortez (nx 16 pi) + n pl de solution de perles de FLAG (n = nombre d'échantillons) et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C.
      REMARQUE: Utilisez des conseils à large ouverture à des billes de pipettes.
   2. Eliminer le surnageant et ajouter 500 pi de tampon de lavage FLAG (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM et 0,1% de NP-40) pour les billes. Isoler à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Répétez l'opération pour un total de 3 lavages.
   3. Resuspendre les perles dans un tampon de lavage FLAG à un volume final de 16 ul nx.
   4. Ajouter 16 ul du FLAG bourrelet suspension pour le reste élution STREP AP et nuit nutation à 4 ° C.

5. FLAG IP

1. Isoler la suspension des perles de FLAG à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Enregistrez le surnageant et stocker le «FLAG IP accréditives" (FT) à 4 ° C.
2. Ajouter 50081; l de lavage FLAG tampon à la solution. Nutation pendant 5 min à 4 ° C et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Répétez l'opération pour un total de 4 lavages et retirer le surnageant après chaque lavage.
   NOTE: Avant le quatrième lavage, transférer la solution de protéines-billes à un nouveau tube de 1,5 ml pour réduire fond. Cette étape est essentielle.
3. Retirer le surnageant de l'essorage final et ajouter 30 pi de tampon de lavage FLAG contenant 200 ng / ul de peptide FLAG dans les perles. Vortex à 800 rpm pendant 2 heures à 4 ° C.
4. Isoler la suspension à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Récolter le surnageant et conserver à 4 ° C comme le "FLAG Elution IP."
   REMARQUE: Les échantillons d'élution peut être confirmée par coloration à l' argent et / ou Western Blot en utilisant des protocoles standard ^16, et sont prêts pour d' autres essais de protéines. Lors de la mise en place d'un western blot, exécutez tous les échantillons suivants: (1) STREP AP Entrée, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutisur, (4) FLAG IP FT, et (5) FLAG IP Elution. Les volumes chargés devront être déterminées pour chaque expérience. Tous les échantillons collectés et billes peuvent être conservées à 4 ° C pour le stockage à court terme et à -80 ° C pour le stockage à long terme. Des échantillons de TAP peuvent être analysés par spectrométrie de masse pour vérifier l'identité de leurs composants, afin d' identifier de nouvelles modifications post-traductionnelles (PTM) et / ou pour découvrir toute nouvelle interaction de la protéine purifiée avec le complexe ^{2, 17.} A cet effet, après l'exécution d'un gel ou d'argent Coomassie, les bandes peuvent être excisées à partir du gel en utilisant un scalpel propre. Plusieurs excellentes critiques qui traitent des méthodes de spectrométrie de masse ont déjà été publiés ^{18, 19.}

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Résultats

Dans cet article, nous démontrons l'applicabilité de la méthode TAP pour la CycT1-CDK9 bien caractérisé complexe (également connu sous le nom P-TEFb kinase).

Plasmides codant pour la cycline T1-STREP (CycT1: S) et CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) et cycline T1-FLAG (CycT1: F) (tableau 1), ont été transfectées dans des cellules HEK293T . Les contrôles négatifs inclus transfections ave...

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Discussion

Le protocole décrit ici pour l'expression et l'isolement des complexes de protéines à partir de cellules eucaryotes ne se limite pas à la caractérisation biochimique de ces assemblages moléculaires, mais il peut également être utilisé pour l'identification de nouveaux interacteurs et les modifications post-traductionnelles qui pourraient réguler leur fonctionnement. L'utilisation de marqueurs d'affinité ne se limite pas à ce qui est mentionné dans ce protocole; mais notre expérience mon...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicillin/Streptomycin	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
STREP-tag elution buffer	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
48 hole micro tube foam rack	Fisher Scientific	02-215-386
Labquake shaker rotisserie	Thermo	415110