Différenciation efficace de pluripotentes cellules souches à NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; pancréatiques progéniteurs

Résumé

Nous décrivons ici un protocole 4 étapes pour différencier les cellules souches embryonnaires humaines à NKX6-1 ⁺ progéniteurs pancréatiques in vitro. Ce protocole peut être appliqué à une variété de lignées de cellules souches pluripotentes humaines.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes ont la capacité d'auto renouveler et de se différencier de multiples lignées, elles une source intéressante pour la production de cellules progénitrices pancréatiques qui peuvent être utilisés pour l'étude et le traitement futur du diabète de décision. Cet article décrit un protocole de différenciation à quatre étages conçu pour générer des cellules progénitrices pancréatiques à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Ce protocole peut être appliqué à un certain nombre de cellules souches pluripotentes humaines (lignes HPSC). L'approche adoptée pour générer des cellules progénitrices pancréatiques est de différencier les CSEh pour modéliser avec précision les étapes clés du développement du pancréas. Ceci commence par l'induction de l'endoderme définitif, qui est atteint par la mise en culture des cellules en présence d'activine A, le facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) et CHIR990210. En outre la différenciation et la structuration avec Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) et Dorsomorphin génère des cellules ressemblant à la foregut postérieure. L'ajout de RetinOïque, NOGGIN, SANT-1 et FGF10 différencie les cellules de l'intestin antérieur postérieur dans des cellules caractéristiques de l'endoderme pancréatique. Enfin, la combinaison du facteur de croissance épidermique (EGF), le nicotinamide et NOGGIN conduit à la génération efficace de PDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 cellules. La cytométrie en flux est réalisée pour confirmer l'expression de marqueurs spécifiques à des étapes clés du développement du pancréas. Les Pdx1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 progénitrices pancréatiques à l'issue de l' étape 4 sont capables de générer des cellules bêta matures lors de la transplantation chez des souris immunodéficientes et peuvent être en outre différenciés pour générer des cellules productrices d'insuline in vitro. Ainsi, la génération efficace de PDX1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ progéniteurs pancréatiques, comme l'a démontré dans ce protocole, est d' une grande importance car elle fournit une plate - forme pour étudier le développement du pancréas humain in vitro et fournit une source de cellules ayant le potentiel de se différencier en les cellules bêta qui pourraient Eventually être utilisé pour le traitement du diabète.

Introduction

La prévalence du diabète augmente et selon l'Association canadienne du diabète, il est estimé que plus de 11 millions de personnes au Canada sont diabétiques ou prédiabétiques, avec 5-10% de ces personnes ayant le diabète de type 1 (DT1) ^1. DT1 est une maladie auto-immune qui est provoquée par la destruction des cellules ß produisant de l'insuline qui sont situées dans les îlots de Langerhans. Actuellement, les personnes vivant avec le DT1 nécessitent des sources exogènes de l' insuline ^2. Malgré les progrès de la thérapie à l'insuline, les patients DT1 continuent d'avoir un moment difficile la régulation de leurs niveaux de glucose dans le sang et continuent de souffrir à la fois hypo- et hyperglycémie. Une forme prometteuse de traitement pour restaurer normoglycémie dans DT1 est l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), qui pourraient être utilisés pour générer une offre illimitée de cellules productrices d' insuline ß la fois in vivo et in vitro ^{3, 4, 5, 6, 7. Différencier CSEh à ß-like cellules pourraient permettre d'étudier le diabète in vitro, permettant l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le diabète de type 2 et de fournir des cellules pour la transplantation chez des patients DT1.}

La tentative la plus réussie de générer des cellules productrices d'insuline à partir de cellules hES in vitro est de récapituler les événements embryonnaires qui se produisent au cours du développement du pancréas ^{4, 5.} Cela implique la manipulation des voies de signalisation distinctes pour modéliser avec précision les étapes clés du pancréas en développement. Le développement du pancréas commence par l'induction de l'endoderme définitif, qui est caractérisé par l'expression de CXCR4 et CD117 (c-KIT) , ^{8, 9.} Régulation précise de definitive organisation endoderme est nécessaire pour la formation du tube intestinal, qui subit alors antéro-postérieur à patterning et ventrale-dorsale. Dorsale et ventrale du pancréas bourgeons sortent de la zone de l'intestin antérieur , postérieur , qui exprime le gène à homéoboîte pancréatique et duodénal (Pdx1), qui est nécessaire pour le développement du pancréas ^10. Le fusible dorsale et ventrale pour former les bourgeons du pancréas, qui est ensuite soumis à un remodelage epithelial et d' expansion ^11. Engagement envers le endocrines et exocrines lignée est accompagnée par la production de cellules souches multipotentes (PPM) qui expriment, entre autres, les facteurs de transcription Pdx1, et Nkx6.1 Ptf1a ^{12, 13.} PPMs qui deviendront des cellules endocrines et canalaires continuent d'exprimer Nkx6-1 tout en diminuant l' expression Ptf1a. Contrairement à cela, les cellules de la lignée exocrines vont perdre expression de Nkx6-1 et maintenir l' expression Ptf1a ^12.

Le facteur de transcription Nkx6-1 a un rôle clé dans le développement du pancréas, en particulier au cours de la différenciation des cellules progénitrices endocrines à ß cellules. Comme décrit précédemment, la suppression des résultats Nkx6-1 dans la formation altération des cellules ß du pancréas ¹⁴ au cours du développement. Par conséquent, la génération de cellules bêta productrices d' insuline in vitro et in vivo nécessite l'induction efficace des Nkx6-1.

Nous avons récemment développé un protocole pour générer efficacement Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ progéniteurs pancréatiques de hPSCs. Ces progéniteurs pancréatiques HPSC dérivés génèrent des cellules ß matures sur la transplantation dans des souris immunodéficientes ^3. Le protocole de différenciation peut être divisé en 4 étapes caractéristiques: 1) endoderme définitif induction, 2) foregut postérieure patterning, 3) la spécification du pancréas et 4) induction NKX6-1. Ici, nous fournissons une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée.

Protocole

1. Préparation des solutions et des médias

NOTE: Préparer tous les médias pour la culture cellulaire dans un environnement stérile. Médias doit être fabriqué et utilisé immédiatement. Détails des réactifs sont fournis dans le tableau des matériaux.

1. Différenciation des médias
   1. Préparer jour 0 Différenciation Médias: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml activine A, 10 ⁴ M MTG.
   2. Préparer Jour 1-2 Différenciation Média: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 100 ng / ml d' activine A, 10 ⁴ M MTG, 5 ng / ml de bFGF, acide 50 pg / ml Ascorbique.
   3. Préparer Jour 3-5 Différenciation Média: RPMI Medium avec 1% de glutamine, 1% B27, 10 ⁴ M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
   4. Préparer Jour 6-7 Différenciation Médias: DMEM avec 1% de glutamine, 1% B27, 50 pg / ml d'acide ascorbique, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM d'acide rétinoïque, 50 ng / ml NOGGIN.
      NOTE: rétinoïqueAcid devrait être ajouté aux médias dernier et les médias devraient être protégés de la lumière pour empêcher la dégradation oxydative ^15.
   5. Préparer Jour 8-12 Différenciation Média: DMEM avec 1% de glutamine, 1% de B27, 50 pg / ml d'acide ascorbique, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml de hEGF mM de nicotinamide 10.
2. Préparer un tampon FACS: 10% de FBS dans du PBS, moins le calcium et le magnésium.

2. HESC Différenciation

REMARQUE: Les cellules souches embryonnaires humaines sont décongelées, repiquées et étendu sur des fibroblastes embryonnaires de souris irradiées en présence d'un milieu à base KOSR additionné de ¹⁶ bFGF. CSEh sont prêts pour la différenciation lorsque les cellules atteignent 80-95% de confluence. À ce moment , les colonies doivent être grandes avec des frontières définies et une «forme de dôme" structure (figure 1A). Toute la culture cellulaire est effectuée en fond plat, des plaques de culture traitées de tissus revêtus de gélatine à 0,1%. Typiquement, les cellules sont cultivées en 6 ouplaques à 12 puits, dans des volumes de supports de 2 ml ou 1 ml, respectivement.

1. Le jour 0, commencer la différenciation par le remplacement du média-KOSR avec Jour 0 Différenciation Media.
2. Les jours 1 et 2, secouez doucement la plaque pour éliminer toutes les cellules mortes de la monocouche avant d'aspirer. Remplacer par jour 1-2 Différenciation Media.
3. Au jour 3, les cellules de récolte pour la cytométrie de flux. Si les cellules expriment plus de 90% CXCR4 ⁺ / CD117 ^+, passez à l' étape 2.4.
4. Les jours 3 et 5, secouez doucement la plaque pour éliminer toutes les cellules mortes de la monocouche avant aspiration. Remplacer par Jour 3-5 Différenciation Media.
5. Les jours 6 et 7, remplacer par jour 6-7 Différenciation Media.
6. Les jours 8, 10 et 12, remplacer par jour 8-12 Différenciation Media.
7. Le jour 13, les cellules de récolte pour cytométrie en flux pour déterminer PDX1 et d'expression NKX6-1.

3. Les cellules de récolte pour l'analyse de cytométrie en flux

1. Dissocier les cellules avecune solution de trypsine commerciale 1x selon le protocole du fabricant et on incube à 37 ° C pendant 3 min.
2. Enlever la solution de trypsine commerciale et resuspendre cellules individuelles dans 1000 ul FACS tampon avec 30 ul DNase I.
3. cellules de filtrage en utilisant un filet de nylon tamis cellulaire de 35 pm et transférer dans un tube à centrifuger.
4. Centrifuger les cellules à 455 g pendant 5 min. Préparer les cellules soit pour la coloration en direct ou fixe.

4. Coloration pour cytométrie de flux

1. Débit préparation pour la coloration en direct le jour 3
   1. Resuspendre les cellules dans 1000 ul FACS tampon. Transfert 200 pi (environ 1-3 x 10 ⁵ cellules) dans deux puits d'une plaque à 96 puits (pour les deux échantillons non colorés et colorées).
   2. Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque.
   3. Colorer avec des anticorps primaires conjugués, CXCR4: APC et CD117: PE (voir M atières Table) pour 30 min à température ambiante à l'abri de la lumière.
   4. Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque.
   5. échantillons Resuspendre dans 100 pi de tampon FACS.
   6. Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque.
   7. Resuspendre chaque échantillon et le transfert dans un volume total de 300-500 ul FACS tampon à 1 ml de tubes à essai micro ou 5 ml tubes à fond rond.
   8. Échantillons sur Exécuter dans le cytomètre de flux ^17. Si les échantillons ne peuvent pas être exécutés immédiatement, conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière.
2. Débit préparation pour la coloration fixe le jour 13
   1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution de fixation / de perméabilisation commerciale pendant 24 heures à 4 ° C.
   2. Centrifuger l'échantillon à 455 g pendant 5 min. Remettre en suspension dans 400 ul solution Perm / Wash.
   3. Transférer 200 pi de l'échantillon (environ 0,5-1 x 10 ⁶ cellules) à two puits d'une plaque à 96 puits (pour le contrôle IgG et PDX1 / NKX6-1 coloration). Centrifuger à 931 g pendant 2 min.
   4. Remettre en suspension les culots cellulaires dans une solution Perm / Wash 100 pi contenant l' anti-PDX1 et des anticorps anti-NKX6-1 de commande primaire ou de l' isotype (voir tableau des matériaux). Incuber une nuit à 4 ° C.
   5. Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque. échantillons Resuspendre dans 100 pi de solution Perm / Wash.
   6. Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque.
   7. Remettre en suspension les échantillons dans 100 ul de Perm / Wash contenant des anticorps secondaires à température ambiante pendant 1 heure, à l'abri de la lumière.
   8. Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque.
   9. échantillons Resuspendre dans 100 pi de Perm / Wash Solution.
   10. Centrifuger la plaque à 931 g pendant 2 min. Retirer le surnageant en retournant la plaque.
   11. Représentantmanger étape 4.2.9 et 4.2.10.
   12. Resuspendre chaque échantillon et le transfert dans un volume total de 300-500 ul FACS tampon à 1 ml de tubes à essai micro ou 5 ml tubes à fond rond.
   13. Échantillons sur Exécuter dans le cytomètre de flux ^17. Si les échantillons ne peuvent pas être exécutés immédiatement, conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière.

Résultats

Génération efficace de progéniteurs du pancréas repose sur la croissance et le maintien des cellules indifférenciées , suivie par l'addition précise des molécules de signalisation spécifiques au cours du protocole de différenciation, comme cela est illustré dans le schéma de la figure 1A. Au jour 0, les cellules non différenciées devrait être de 80 à 95% de confluence et les colonies doivent avoir des bords définis (figure 1A). Au co...

Discussion

Générer avec succès NKX6-1 ⁺ progéniteurs pancréatiques de hPSCs in vitro repose sur l'utilisation de cultures de haute qualité de hPSCs et la différenciation dirigée impliquant la régulation précise des voies de signalisation spécifiques qui régissent les étapes clés du développement au cours du développement du pancréas. Bien que ce protocole peut être utilisé pour induire l' expression robuste de NKX6-1 à travers une variété de lignes comme indiqué précédemment HPS...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD  Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419