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Résumé

Le présent document décrit un procédé de mesure alloréactivité dans une population mixte de cellules T en utilisant la cytométrie de flux d'imagerie.

Résumé

La mesure de la réactivité immunologique à des antigènes du donneur chez les receveurs de greffe est susceptible d'être cruciale pour le succès réduction ou le retrait de l'immunosuppression. La réaction leucocytaire mixte (MLR), limitant les essais de dilution, et le dosage trans-vivo d' hypersensibilité retardée (DTH) ont tous été appliqués à cette question, mais ces méthodes ont une capacité prédictive limitée et / ou d' importantes limitations pratiques qui réduisent leur utilité. écoulement d'imagerie est une technique de cytométrie qui combine les puissances quantitatives multiparamétriques cytométrie en flux avec les capacités d'imagerie de microscopie à fluorescence. Nous approche récemment fait usage d'un de cytométrie de flux d'imagerie pour définir la proportion de cellules T bénéficiaires capables de former des synapses immunitaires matures avec des cellules présentatrices d'antigène donneur (DPR). En utilisant un modèle de greffe de cœur de souris bien caractérisé, nous avons montré que la fréquence des synapses immunitaires in vitro chez T-APC membrévénements de contact ane résultat allogreffe fortement prédit le rejet, la tolérance, et une situation où la survie de la greffe dépend des cellules T régulatrices induites. La fréquence des contacts T-APC augmentait avec les cellules T de souris au cours de rejet aigu et une diminution des cellules T provenant de souris rendues insensibles aux alloantigène. L'addition de cellules T régulatrices dans le système in vitro réduit contacts T-APC prolongées. Critique, cet effet a également été vu avec polyclonale humaine élargie, d'origine naturelle des cellules T régulatrices, qui sont connus pour contrôler le rejet des tissus humains dans les modèles de souris humanisées. La poursuite du développement de cette approche peut permettre une caractérisation plus profonde du compartiment des cellules T allo chez les receveurs de greffe. À l'avenir, le développement et l'évaluation de cette méthode en utilisant des cellules humaines peuvent constituer la base des tests utilisés pour sélectionner les patients pour minimiser immunosuppresseur, et il peut être utilisé pour mesurer l'impact de tolérogèneic thérapies dans la clinique.

Introduction

une transplantation d'organe solide a transformé la prise en charge des patients atteints de maladies en phase terminale du rein, le foie, le cœur et les poumons. En raison des disparités dans les grands et petits antigènes d'histocompatibilité, cependant, allogreffes sont rapidement rejetées par lymphocytes T du receveur si les médicaments immunosuppresseurs ne sont pas utilisés. Ces agents ont de nombreux effets indésirables, y compris les risques pour le cancer et le dysfonctionnement des organes. Un objectif majeur clinique est donc de réduire la dose d'immunosuppression au niveau minimum requis pour éviter le rejet d'allogreffe. Ce niveau est susceptible de varier en fonction du degré d'activation du système immunitaire inné; le degré de non-concordance de alloantigène donneur-receveur; et les différences inter-patient dans la fonction immunitaire, la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et.

Malheureusement, les cliniciens de transplantation n'ont pas des outils pour évaluer avec précision la réactivité des donateurs individuels chez les patients 1. le mélangeréaction leucocytaire (MLR) peut détecter la réactivité des donateurs, mais il ne parvient pas à prédire de façon fiable les résultats de la greffe 2, 3. Limiter les essais de dilution, ELISPOT cytokines, et le dosage trans-vivo , soit de mesurer une gamme limitée de réponses ou ne sont pas 4 pratique, 5, 6, 7, 8 profils d'expression .Gene ont révélé les signatures liées à la tolérance opérationnelle 9, 10, 11, 12 et le rejet 13, 14, 15, mais ceux - ci ne sont pas toujours généralisables au sein des populations 16 et peut en fin de compte ont une utilité limitée chez les patients individuels. analy basée sur la séquenceSSE du récepteur des cellules T (TCR) des cellules T dans le sang périphérique 17 ou proliférer dans la MLR 18 ont également été mis au point , mais nécessitent une validation supplémentaire.

Conceptuellement, il serait souhaitable d'avoir un test qui détecte les premières étapes requises dans les pays bénéficiaires activation des lymphocytes T par un antigène du donneur. Depuis la mise en culture des cellules sur plusieurs jours (comme dans le MLR) peut introduire des objets, un tel test ne nécessite pas idéalement la mesure des événements en aval, tels que la prolifération ou la fonction effecteur. De même, cependant, il serait également souhaitable que le test dépend de certains éléments de la fonction des cellules T, étant donné que des évaluations purement descriptives (Par exemple, le séquençage TCR) peut être incapable de faire la distinction entre les cellules T anergiques et fonctionnelles.

De nombreuses études ont montré que le contact prolongé T-APC est nécessaire pour la formation d'une synapse immunitaire, qui est une première essentiellepas dans la réponse des cellules T 19, 20, 21, 22. Nous avons récemment rapporté que, lors dynamique en imagerie laps de temps vitro, environ 5 - 10% des souris des cellules T CD4 + forment des contacts de longue durée avec des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse allogénique (BMDC) 23. La fréquence de contact prolongé a été augmenté chez les animaux qui ont rejeté une greffe, alors que chez les souris préalablement rendue tolérante aux mêmes antigènes, elle est restée à des niveaux observés chez les souris untransplanted 23. Interactions prolongées ont été réduites en présence du bénéficiaire Tregs et augmenté en leur absence, et nous avons observé des phénomènes similaires utilisant des cellules T humaines et allogéniques DCs dérivées de monocytes (MoDCs) 23.

Cependant, l'énumération des contacts prolongés effectué dans un populatio polyclonale des lymphocytes Tn prend du temps et de main-d'œuvre. Nous avons donc fait usage cytométrie de flux d'imagerie pour examiner la formation de synapse allogénique. flux d'imagerie intègre cytométrie les capacités d'acquisition et d'analyse des données multiparamétriques de flux classique cytométrie avec les capacités d'imagerie cellulaire unique de microscopie à fluorescence. Cette technique a été utilisée par d' autres chercheurs pour étudier la formation des synapses immunitaire par des cellules T monoclonales 24, 26, 27 ou en présence de 28 superantigènes. Dans un tel contexte, cependant, la fréquence des cellules T répondantes varie de 30 à 100%, tandis que les cellules T alloréactives sont généralement estimées pour représenter 15.5% du répertoire total de cellules T 29, 30, 31, 32. Il est important, nous avons montré que la cytométrie de flux d'imagerie peut produire avery de mesure comparable de alloréactifs fréquence des lymphocytes T 23 et que les changements de fréquence de synapse au sein d' une population polyclonale de cellules T sont prédictifs de l' issue de la greffe 23. À l' heure actuelle, cette approche a été optimisée pour mesurer la alloréactivité directe des cellules T CD4 +, mais, en principe, il pourrait également être développé pour examiner les cellules T CD8 + et la voie indirecte. Alloréactivité indirecte est considérée de plus en plus pertinent parfois plus post-transplantation 33. Nous développons actuellement cette méthode pour utiliser les cellules humaines, ce qui permettra de tester chez les patients. Ainsi, à l'avenir, l'approche globale peut être utile pour l'évaluation fonctionnelle des réponses des lymphocytes T chez les transplantés avant la transplantation; immédiatement après la transplantation; et à long terme, lorsque la réduction de la drogue devient un objectif important.

Protocole

1. Préparer les réactifs et matériel requis

  1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) ( "tampon de lavage"). Préparer PBS avec 2% de FCS contenant 0,1% de détergent non ionique ( « tampon de lavage permanente », voir le tableau des matériaux). Préparer PBS avec 1,5% de formaldéhyde.
    REMARQUE: ATTENTION! Formaldéhyde est corrosif et potentiellement cancérigène et doit être manipulé avec des équipements de protection individuelle approprié.
  2. Préparation du PBS contenant 2% de FBS et 0,5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour la séparation magnétique de cellules ( "MCS tampon").
  3. Préparer 50 pg / ml d'isothiocyanate de fluorescéine phalloïdine-(phalloïdine-FITC) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparer un 1 mg / ml de colorant nucléaire (par exemple , 1 mg / ml 7-aminoactinomycine D (7-AAD) dans du DMSO ou un colorant bis-benzimide; voir le tableau des matériaux) dans du DMSO. Préparer des anticorps marqués par un fluorochrome approprié pour les cellules d'intérêt etl'imagerie cytomètre en flux.
  4. Obtenir des tissus animaux (par exemple, les ganglions lymphatiques et la rate) en tant que source de cellules T et les tissus animaux allogénique (par exemple, la rate et la moelle osseuse) comme source de cellules présentant l' antigène ou de progéniteurs.
  5. Préparer un milieu de culture cellulaire (par exemple, rpmi (RPMI) 1640 ou Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de FBS), 50 uM de 2-mercaptoéthanol, de la pénicilline et de la streptomycine et obtenir 24- et / ou 96- bien des plaques de culture cellulaire.

2. Préparer les cellules présentatrices d'antigène

NOTE: En théorie, pourrait être examiné une population APC avec cette méthode. souris immatures de moelle osseuse dérivées de cellules dendritiques (CD) comme des APC ont été poursuivis dans ce cas. De nombreux protocoles existent pour la génération de ces cellules (par exemple, les références 34 et 35). En bref, le protocole suivant a été utilisé.

  1. Rincer la moelle de fémurs et tibias en RPMJe 1640 ou DMEM.
  2. Passer les cellules en suspension à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les petits morceaux d'os et de débris.
  3. Pellet les cellules par centrifugation et ensuite lyser les globules rouges en utilisant un tampon de chlorure d'ammonium pendant 5 min à température ambiante.
  4. Pellet les cellules par centrifugation (400 x g, 5 min) et remettre en suspension le culot cellulaire.
  5. Laver les cellules dans 5-10 ml de tampon de lavage, culot par centrifugation (400 x g, 5 min), et remettre en suspension le culot cellulaire.
  6. Enrichir précurseurs hématopoïétiques sur une colonne de séparation de cellules par marquage des cellules avec biotinylé anti-CD3 (5 ug / ml), anti-B220 (5 ug / ml), anti-classe II du CMH (1 pg / ml) et anti-CD11b (5 pg / ml) d'anticorps.
  7. Pellet les cellules par centrifugation (400 x g, 5 min) et remettre en suspension le culot cellulaire.
  8. Incuber les cellules avec des microbilles magnétiques anti-biotine (voir la Table des Matières) à 4 ° C pendant 10 min.
  9. Laver et un culot cellulaire (400 xg, 5 min) et re-suspend eux dans 1 ml de tampon MCS avant de retirer les cellules marquées en utilisant une large sélection positive (LS) colonne de séparation magnétique de cellules amorcées avec 3 ml de tampon MCS et placé dans son aimant. Laver la colonne 3 fois avec 3 ml de tampon MCS; l'écoulement contiendra les cellules souhaitées.
  10. Culture des cellules qui passent à travers la colonne pendant 6 jours dans du milieu RPMI 1640 ou DMEM complété avec 2 ng / ml de facteur recombinant stimulant les colonies de granulocytes-macrophages de souris (GM-CSF) et 2 ng / ml de β1 recombinant de facteur de croissance transformant humain (TGFβ1) . Remplacez la moitié du milieu tous les 2 jours avec un milieu complet frais contenant 2 ng / ml de GM-CSF et TGFβ1.
    NOTE: TGFβ1 humaine a une activité dans les cellules de souris. Les données ont été générées à l'aide de ces CD immatures. D' autres cellules (par exemple, les cellules B et CD matures) peuvent convenir que , mais n'ont pas VBTT été testés dans cet essai.
  11. Cryoconservation DC dans 90% de sérum / 10% de DMSO et stocker dans l'azote liquide; récupérer surle jour d'utilisation. Avant l'utilisation, compter le nombre de contrôleurs de domaine viables dans un hémocytomètre en utilisant l'exclusion du bleu trypan. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du milieu de culture à la densité appropriée (voir étape 4.1) avant utilisation dans la section 4.

3. Préparer les cellules T

  1. Utiliser des méthodes de sélection négative pour éviter de transmettre des signaux d'activation par inadvertance ou inhibiteurs sur les cellules.
    NOTE: Dans cet exemple, les cellules T CD4 + sont préparés pour l' analyse.
    1. Pour préparer des cellules T CD4 + de la rate de la souris, écraser la rate à travers un tamis cellulaire de 70 pm en utilisant le piston d'une seringue. Laver le filtre cellulaire avec le tampon de lavage.
    2. Pellet les cellules en suspension par centrifugation (400 xg, 5 min) et ensuite lyser les globules rouges par remise en suspension du culot dans un tampon de chlorure d'ammonium pendant 5 min à température ambiante.
    3. Pellet les cellules par centrifugation (400 x g, 5 min) et remettre en suspension le culot.
    4. Laver la cellules dans 5 - 10 ml de tampon de lavage et le culot par centrifugation (400 x g, 5 min). Remettre en suspension le culot.
    5. Colorer les cellules avec des anticorps biotinylés à CD8, classe majeure d'histocompatibilité II (CMH II, 1 ug / mL), et CD19 (5 ug / mL). Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
    6. Laver les cellules dans 10 ml de tampon de lavage et le culot par centrifugation (400 xg, 5 min). Remettre en suspension le culot.
    7. Incuber les cellules avec des microbilles magnétiques anti-biotine (voir la Table des Matières) selon les instructions du fabricant.
    8. Laver les cellules dans 10 ml de tampon de lavage et le culot par centrifugation (400 x g, 5 min); remettre en suspension le culot.
    9. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon MCS et d' enrichir les cellules T CD4 + sur une colonne de séparation magnétique de cellules amorcées avec 3 ml de tampon MCS sur un aimant. Laver la colonne 3 fois avec 3 ml de tampon MCS. La colonne accréditive contiendra les cellules T enrichies.
  2. Par débit standard cytomeessayer, évaluer la pureté des lymphocytes T en utilisant une aliquote des cellules sélectionnées négativement. Colorer les cellules en utilisant un conjugué de fluorochrome-streptavidine (pour identifier les cellules marquées à la biotine qui auraient dû être retirés de la colonne) et un anticorps ou des anticorps pour identifier la population de cellules T d'intérêt (CD4 dans ce cas); une pureté de ≥85% est 23 acceptable.
    1. Compter les cellules T dans un hémocytomètre par exclusion au bleu trypan (viabilité ≥90% est acceptable).
      REMARQUE: tampon MCS contient de l' EDTA, qui doit être retiré avant l'essai. Pour ce faire, sédimenter les cellules par centrifugation (400 x g, 5 min) et laver dans 1 ml de tampon de lavage. Sédimenter les cellules à nouveau (400 xg, 5 min) et remettre en suspension dans un milieu de culture à la densité appropriée (voir étape 4.1).

4. Co-cellules T et laisser incuber les CD

  1. des cellules de semences T et DCS à 2: 1 T: rapport DC dans un 24 puits ou à 96 puits d'une plaque de culture cellulaire. Veiller à ce que le volume de culture final est ≤500 uL pour des plaques à 24 puits ou ≤50 uL pour des plaques à 96 puits.
    NOTE: Des volumes plus petits favorisent les interactions entre cellules et permettent l' espace pour le tampon de fixation ultérieure.
    1. Ajuster le nombre de cellules précises de manière empirique, mais en tant que guide général, en utilisant 1 x 10 6 cellules T et 0,5 x 10 6 DC par puits (plaque 96 puits). Ceux-ci devraient être considérés comme le nombre minimum de cellules, car en utilisant moins de cellules fait l'énumération des synapses immunitaires difficiles.
      1. Pour augmenter le nombre de cellules, mettre en place des puits et piscine répétés après l' étape 5 (fixation).
        REMARQUE: Lors de la mise en place des puits réplicats, il est conseillé de semences dans tous les contrôleurs de domaine des puits d' abord, puis les cellules T de semences dans tous les puits; ce qui minimise les écarts de temps d'incubation entre les puits.
  2. Incuber la plaque pendant 4 h à 37 ° C dans une atmosphère à 5% de CO 2.
e_title "> 5. Fixer des cellules en plaque

  1. Ajouter 3 fois le volume de culture de 1,5% de formaldehyde dans du PBS à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 30 min; tt est important de fixer les cellules avant de les retirer de la plaque afin de minimiser la perturbation des interactions entre cellules.
  2. Transférer les cellules dans la plaque à tubes pour le lavage ultérieur et la coloration. A ce stade, mettre de côté des cellules supplémentaires pour le contrôle unique tache. En dehors de ces contrôles, toute la culture doit être colorée avec le cocktail d'anticorps (voir étape 4.1.1).

6. Les cellules Stain

  1. cellules de tache dans 100 pi de tampon de lavage contenant un cocktail d'anticorps conjugués à un fluorochrome souhaités pendant 30 min à température ambiante, à l'abri de la lumière.
    NOTE: Le cocktail comprend des anticorps T spécifiques de cellules et spécifiques APC. Fluorochromes doivent être choisis de telle sorte qu'ils peuvent être distingués en utilisant la configuration de l'imagerie cytomètre en flux. en til expérimente représenté ici, conjugué à un fluorophore bleu CD11b (5 ug / mL, voir le tableau des matériaux) et CD90.2 APC conjugué (5 pg / ml) ont été utilisés.
  2. Laver les cellules dans 1 ml de tampon de lavage et centrifugation pendant 5 min à 400 x g. Décanter le surnageant. Re-suspendre les cellules dans un tampon de lavage contenant perm-FITC de la phalloïdine à de 0,05 à 0,5 ug / ml et incuber pendant 30 min à température ambiante à l'abri de la lumière.
    NOTE: Les concentrations phalloïdine FITC d'environ 0,1 ug / mL bien pour les cellules de souris, mais la concentration appropriée devrait varier en fonction du fournisseur, le type de cellule, et l' imagerie cytomètre en flux.
  3. Laver les cellules dans 1 ml de perm / tampon de lavage et centrifugation pendant 5 min à 400 x g. Décanter le surnageant. Re-suspendre les cellules dans un tampon Perm / cycle de lavage contenant un colorant nucléaire à la concentration appropriée (par exemple, environ 25 pg / ml de 7-AAD) et incuber pendant 30 min à température ambiante à l' abri de la lumière.
  4. Laver la cellules dans 1 ml de perm / tampon de lavage et centrifugation pendant 5 min à 400 x g. Décanter le surnageant. Laver les cellules une fois dans du tampon de lavage, d'une pastille, et remettre en suspension dans 50 - 100 pi de tampon de lavage, le transfert des cellules à de petits tubes de microcentrifugation coiffés.
  5. Procéder à l'acquisition de données immédiatement ou stocker les cellules à 4 ° C à l'abri de la lumière pendant plusieurs jours avant l'acquisition de l'image cytomètre en flux.
    NOTE: Les cellules ont été stockées avec succès dans cette voie jusqu'à 7 jours. Un stockage prolongé peut être possible, mais n'a pas été testé.

7. Acquérir les connaissances

  1. Initialiser et configurer le flux d'imagerie cytomètre selon les instructions du fabricant. Assurer la stabilité de l'âme d'écoulement avant la collecte des données.
  2. Réserver un canal d'acquisition d'images de fond clair. Acquérir des données de contrôle unique tache avec le canal de fond clair éteint.
    1. Cliquez sur le bouton « Charger » et inseTA un tube contenant un échantillon entièrement coloré (un échantillon qui a été coloré avec tous les fluorochromes requis) dans le support.
    2. Dans la fenêtre « espace de travail », sélectionner et créer un nouveau diagramme de dispersion avec le rapport d'aspect au cours des singulets de la zone et de grille, où le rapport d'aspect est proche de 1. Créer un nouveau diagramme de dispersion pour chaque canal utilisé (intensité du canal dans l'axe horizontal) .
    3. Pour chaque fluorochrome, vérifiez la population positive et, le cas échéant, ajuster la tension du laser dans la case « Illumination ».
    4. Décharger le tube et charger le premier tube unique teinté.
    5. Dans la zone « Paramètres d'acquisition », tapez le nom de l'échantillon et définir le nombre d'événements qui doivent être collectées; si elle est une tache unique (pour les contrôles de compensation), 1000 - 2000 événements suffisent.
    6. Dans la zone « Canaux », sélectionnez les canaux que chaque échantillon a été teinté avec. Pour les commandes mono-tache, tous les canaux doivent être sélectionnés avec brightfield et la diffusion latérale hors tension. Cliquez sur le bouton « Enregistrer » sous la zone « acquisition »; lorsque le nombre d'événements atteint le seuil spécifié, l'acquisition s'arrêtera automatiquement.
    7. Cliquez sur le bouton « Retour » pour décharger le tube. Répétez les étapes 7.2.4 - 7.2.6 pour chaque commande unique tache. Selon le cytomètre et le logiciel, il peut ne pas être possible de régler toutes les portes représentées sur la figure 1 lors de l' acquisition (gating plus précis est effectué lors de l' analyse, voir la section 8).
  3. Acquérir des échantillons que pour des échantillons individuels teinté (à l'étape 7.2), mais dans la case « Chaînes », sélectionner tous les canaux qui sont nécessaires, y compris le canal de fond clair.
    1. Avant l'enregistrement des données, vérifier pour confirmer que l'intensité du canal est approprié pour identifier les populations de cellules souhaitées. Sinon, réglez les paramètres laser et des contrôles simple tache ré-enregistrement à l'aide des nouveaux paramètres, comme décrit à l'étape 7.2.
    2. Pour chaqueéchantillon, acquérir plusieurs dizaines de milliers d'événements.
      NOTE: Dans la plupart des conditions, des événements de contact cellulaire cellulaire sont une petite minorité du nombre total de cellules ( la plupart sont des cellules individuelles). En général, il est souhaitable de disposer d'au moins 100 événements dans la grille de contact de la membrane finale.

8. Analyser les données

  1. Analyser les données acquises sur le flux d'imagerie cytomètre en utilisant un logiciel d'analyse disponible gratuitement sur le site Web du fabricant (un compte d'utilisateur doit être créé, voir la table des matières).

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Figure 1. Stratégie gating pour identifier allo Utilisé immunitaire synapses. A. En mise au point des événements sont déclenchés de tous les événements en examinant des images de cellules en fonction de la racine carrée moyenne du taux de changement du profil d'intensité d'image (RMS gradient) en utilisant le chan fond clairnel (Channel 4, CH04), tel que décrit dans le texte. B. Parmi les événements de mise au point, doublets se distinguent des cellules individuelles en traçant le rapport d'aspect par rapport à la zone du canal à fond clair. Les cellules individuelles sont regroupées à proximité du rapport d'aspect de 1 et ont une surface plus petite, tandis que les doublets sont proches de 0,5 et ont une plus grande surface. C. L'intensité de fluorescence de l'APC (dans ce cas, un marqueur des cellules dendritiques [DC], CD11c) est ensuite tracée en fonction de l'intensité de fluorescence du marqueur de cellules T (dans ce cas, CD90.2), et les événements à double positifs sont fermée. Les frontières de la porte peut être affinée en examinant des images d'événements à proximité des frontières. D. T-APC doublets sont ensuite affinés afin qu'ils ne contiennent qu'un seul APC en traçant le rapport d'aspect par rapport à la zone du marqueur APC (CD11c, Ch02). E. Ces doublets mono-APC sont ensuite affinés de manière qu'elles contiennent seulement une cellule T en traçant le rapport d'aspect par rapport à la zonedu marqueur de cellules T (CD90.2, CH06). F. Enfin, les événements ne contenant que deux noyaux sont choisis en traçant un histogramme du nombre de spots sur le canal de colorant nucléaire (7-AAD, CH05) et déclenchement d' événements qui ne contiennent que deux spots 7-AAD-positifs (c. -à noyaux). Les événements de cette porte sont analysés pour le contact de la membrane et la formation des synapses, comme décrit sur la figure 2. Les données ont été analysées de façon aveugle en ce qui concerne l' affectation de traitement et sont d'une expérience déjà publié 23. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

NOTE: La stratégie de gating est décrite dans la présente section et est représenté sur la figure 1. L'analyse du flux de données d'imagerie par cytométrie doit être réalisée en aveugle par rapport à l'affectation du traitement. Bien que nous croyions que les synapses immunitaires et non synaptic contacts sont généralement faciles à distinguer (voir ci - dessous et les figures 2 et 3), aveuglant doivent minimiser le biais résultant de la subjectivité inhérente à l' analyse de l' image.

  1. Générer une matrice de compensation en chargeant les fichiers de données de contrôle unique tache dans l'assistant de compensation. Après le chargement des fichiers individuels tachés, sélectionnez les canaux fluorescents utilisés dans l'expérience.
    REMARQUE: Le logiciel génère automatiquement une matrice de compensation, mais cela doit être validée manuellement pour faire en sorte que les populations positives correctes ont été sélectionnées.
    1. Double-cliquez sur une valeur dans la matrice et ajouter le graphique à la zone d'analyse. Créer une nouvelle porte si nécessaire d'exclure les cellules mortes / doublets / faux positifs; cette nouvelle population positif raffinée peut être sélectionnée dans la zone de matrice dans le menu déroulant pour chaque canal.
    2. Répétez cette opération pour chaque canal. Cliquez sur « Terminer » pour enregistrer le compensatiomatrice de n (fichier .ctm).
  2. Obtenir un fichier d'analyse de données (.daf) à partir du fichier brut (.rif) en chargeant le fichier .rif dans un logiciel d'analyse et en appliquant la matrice de compensation.
  3. Une fois que les données sont chargées, effectuer déclenchement pour identifier les événements de contact cellule T-APC.
    NOTE: Une stratégie de déclenchement typique implique l' identification de mise au point des événements, en sélectionnant doublets sur la base de critères de taille (la zone par rapport à rapport d' aspect de l'événement), et la sélection de cellule T-APC doublets comme des événements qui sont à double positif pour la cellule T et marqueurs APC (Figure 1A-C).
    NOTE: Le rapport d'aspect est le rapport de la largeur d'un événement à sa hauteur, ce qui permet la discrimination des cellules individuelles (rapport voisin de 1) à partir de doublets (rapport voisin de 0,5).
  4. Identifier dans les événements de mise au point en traçant la moyenne quadratique de la vitesse de changement du profil d'intensité d'image (RMS gradient) dans le canal à fond clair (figure 1A). Cliquez sur ee gradient RMS histogramme pour afficher les événements cellulaires dans des bacs individuels, puis placer une grille à l'exclusion hors du foyer événements.
  5. Tracer la zone en fonction du rapport d'aspect du canal à fond clair et tracer une grille qui identifie doublets basé sur la forme et la taille événement (figure 1B). Examen des images d'événements juste à l'intérieur et à l'extérieur de la frontière de cette porte peut aider l'analyste à affiner la taille de la porte et la position. Ensuite, construire un terrain de ces événements doublet dans lequel l'intensité du marqueur de cellules T apparaît sur un axe et l'intensité du marqueur APC apparaît sur l'autre. Dessiner une grille de doublet T-APC contenant des événements positifs pour les deux marqueurs.
  6. Parmi les événements doublets cellule T-APC, sélectionner des événements qui ne contiennent que une cellule T et une APC.
    1. Pour ce faire , en traçant le rapport d'aspect par rapport à la zone pour le marqueur APC et par déclenchement sur doublets contenant un seul APC (Figure 1D). Tracer le rapport d'aspect par rapport à la zone de la marque T-celler et porte sur doublets contenant une seule cellule T (Figure 1E).
      REMARQUE: Affinement peut être obtenue en traçant un histogramme de la fonction de comptage spot appliqué à la fluorescence de tache nucléaire et gating sur les événements avec seulement deux points (figure 1F).
  7. Dans certains cas, les deux cellules dans un doublet ne seront pas en contact; pour identifier les cellules en contact avec l'autre, définir des masques d'objet pour les APC et les cellules T.
    1. Utilisez l'option « Masques » dans le menu d'analyse pour ouvrir le gestionnaire des masques et définir un nouveau masque. Tapez un nom, tel que « masque d'objet T-cellulaire. » Cliquez sur le bouton « Fonction », et dans la boîte de dialogue, choisissez « Objet. »
    2. Sélectionner le canal dans lequel le marqueur de cellules T est détectée (par exemple, CH06). Cliquez sur "OK".
      REMARQUE: « Objet (M06, CH06, serré) » est affiché dans la zone de fonction. Ce masque d'objet par défaut habituellement works bien, mais peut nécessiter l'optimisation.
    3. Répéter ce processus pour créer un masque d'objet APC dans le canal approprié.
  8. Après avoir identifié les APC et les masques de cellules T, déterminer le contact membrane en traçant l'intensité de fluorescence marqueur des cellules T dans le masque d'objet APC contre l'intensité de la fluorescence APC dans le masque d'objet de cellule T. Sur cette parcelle, dessiner une porte qui ne comprend que les cellules en contact avec l'autre.
    NOTE: En règle générale, il y a assez claires populations doubles positives et négatives double (figure 2A). La frontière entre les populations double positives et négatives double peut être réglé en examinant des images de cellules dans fond clair la région frontalière afin d'assurer que les cellules en contact sont à la porte et que les cellules ne sont pas en contact sont exclus.
  9. A ce stade, examiner manuellement les images FITC de phalloidin d'événements dans cette porte pour distinguer les synapses immunitaires matures de simple contact cellule-cellule. Utilisez la fonction « images tag » pour marquer ces images.
    REMARQUE: peut être utilisé comme un indice de alloréactivité directe dans la population de cellules T à l'étude , le pourcentage d'événements marqués immunitaires (synapses) à l' intérieur de cette porte.

Résultats

Cette méthode a été utilisée pour étudier CD4 + alloréactivité des cellules T chez des souris rendues tolérantes à des alloantigènes de donneur avant la transplantation hétérotopique d'allogreffe cardiaque. Souris CBA (H-2 k) ont reçu un protocole inductrice de tolérance consistant en un donneur spécifique (H-2 B6, b) la transfusion sanguine associée à un anticorps CD4 non appauvrissant la couche d' un mois avant la réception d' une transplantation cardiaque B6. Ce protocole conduit à la survie de l' allogreffe de longue durée qui dépend de Foxp3 + cellules T régulatrices 36, 37. Sept jours après la transplantation, la rate des cellules T CD4 + ont été obtenus à partir rendues tolérantes et destinataires non rendues tolérantes des allogreffes cardiaques B6 et ont été co-incubées avec B6 dérivées de moelle osseuse DC selon ce protocole. La figure 2 montre des données représentatives de cette expérience. La grille de contact de la membrane est représentée sur la Figure 2A, avec collimateur verts placés sur un événement synaptique (panneau de gauche, 1) et en un événement non-synaptique (panneau de droite). La figure 2B montre les canaux de fluorescence fond clair et pour cet événement. Pour réduire le biais, les données ont été analysées par un observateur aveugle à l' affectation de traitement 23. Comme représenté sur plusieurs exemples dans la figure 3, à la fois non rendues tolérantes (Figure 3A-B) et rendues tolérantes (Figure 3C-D) destinataires ABC de coeurs B6, les synapses sont faciles à distinguer des contacts synaptiques non par la présence d'une crête dense FITC-positif à l'interface T-APC. Ces résultats montrent que la détection visuelle des synapses immunitaires faites par lymphocytes T du receveur des pistes avec le degré de alloréactivité chez le receveur.

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Figure 2. Identification des T-APC doublets avec membraneContact et création de la synapse. Événements dans la grille de doublet final (figure 1F) sont analysés. A. fluorescence du marqueur de cellules T dans le masque d'objet APC est tracée en fonction de fluorescence du marqueur APC dans le masque d'objet en courant continu. Certains événements ont un doublet APC et une cellule T sans contact entre cellules et apparaissent dans le coin inférieur gauche de la parcelle (images non représenté). Une grille de contact de la membrane peut donc être établie qui ne comprend que des doublets dans lequel les cellules T et les APC sont en contact. Les images de chaque événement dans cette porte sont passés en revue les preuves de réorganisation du cytosquelette d'actine dans le canal phalloïdine-FITC et peuvent être étiquetés à l'aide du logiciel d'analyse. Le panneau de gauche indique un événement de synapse immunitaire (marqué 1 et désigné par réticule vert), alors que le panneau de droite indique un événement de contact avec la membrane, sans formation de la synapse immunologique (marquée 2 et indiqué par réticule vert). La détermination de la formation des synapses nécessite un examen manuel de cesimages, représenté sur B. B. La rangée supérieure montre des images en fond clair et canal de fluorescence pour un doublet avec une synapse immune (correspond à l' événement 1 en A); la rangée du bas montre un doublet à membrane mais manquant de contact formation des synapses (ce qui correspond à l'événement 2 en A). Les données ont été analysées de façon aveugle en ce qui concerne l' affectation de traitement et sont d'une expérience déjà publié 23. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3. Des exemples de formation Synapse T-APC. Souris CBA ont reçu des allogreffes cardiaques provenant de donneurs B6 après chaque pas de pré-traitement (AB) ou après l' induction de tolérance avec du sang entier B6 sous le couvert d'un anticorps anti-CD4 non-déplétant ( rong> CD). Au bout de 7 jours, spléniques cellules T CD4 + ont été testés pour la formation des synapses avec B6 contrôleurs de domaine. A. Trois exemples de doublets non-synaptiques avec membrane contact d'un animal non rendues tolérantes. B. Trois exemples de synapses immunitaire d'un animal non rendues tolérantes. C. Trois exemples de doublets non-synaptiques avec membrane de contact d'un animal rendues tolérantes. D. Trois exemples de synapses immunitaire d'un animal rendues tolérantes. Formation des synapses est indiquée par la présence d'une arête vive, FITC-positif à l'interface T-APC (CH03). Les données ont été analysées de façon aveugle en ce qui concerne l' affectation de traitement et sont d'une expérience déjà publié 23. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

ays "> Anticorps / colorant fluorochrome Canal Concentration CD11c eF450 CH02 5 ug / mL, de manière empirique titrer CD90.2 APC CH06 5 ug / mL, de manière empirique titrer phalloidin FITC CH03 0,05 à 0,5 ug / mL 7-AAD - CH05 25 ug / mL

Tableau 1. Anticorps et colorants utilisés dans cette étude. anticorps conjugué à un fluorochrome, les colorants, les fournisseurs et les concentrations recommandées sont présentées dans le tableau. Le flux d'imagerie cytomètre de canal qui a été utilisé pour détecter chaque fluorochrome est également montré dans le tableau.

Discussion

Écoulement d'imagerie a été utilisée pour démontrer la cytométrie de formation de la synapse immune entre les cellules T et les APC ou monoclonaux en présence de superantigènes 24, 25, 26, 27, 28. Ce procédé tire parti du fait que , après un contact de cellule T-APC productive, la cellule T réarrange son cytosquelette d'actine, il polarisant vers le site de contact 21. Cette réorganisation ne se produit pas sans signalisation TCR, et il est donc un corrélat début de l' activation des lymphocytes T 19, 20, 21. La méthode présentée ici adapte cette approche à la mesure de la fréquence allo des lymphocytes T dans les populations polyclonaux T-cellules. En tant que tel, il peut servir à l'avenir comme base pour le développement de tests pour Réactifs des donateurs ty dans la transplantation clinique.

Bien que les comparaisons directes n'ont pas encore été fait, la détection des allo synapses immunitaires semble avoir une puissance supérieure prédictive que le MLR classique. Par exemple, des travaux antérieurs ont montré que, dans le protocole décrit ci - dessus tolérisation, les résultats d'une MLR ne parviennent pas à établir une corrélation entre de manière fiable avec le résultat de la greffe 2.

Un certain nombre d'essais ont été mis au point pour l'état opérationnel de tolérance chez l' homme 9, 10, 11, bien que ceux - ci ne mesurent pas la fonction des cellules effectrices en réponse à alloantigène. En revanche, l' IFNy ELISPOT dosages 8 mesure effecteur fonction des cellules T mais ne peut pas capturer le spectre complet de la sécrétion de cytokines qui peuvent être pertinentes pour le rejet d'allogreffe aigu et chronique, telle que l' IL-17 38,> 39. L'essai de dilution limite 4, qui est un travail intensif, et le test trans-vivo 6, ce qui nécessite des souris, ont des limites pratiques importantes qui entraveraient leur application dans un cadre clinique. Les récentes améliorations sur l'analyse des cellules qui prolifèrent en utilisant l' analyse de la séquence TCR des lymphocytes T répondant dans le MLR peuvent être utiles, mais comme l'analyse présentée ici, il faudra une validation plus poussée dans les études cliniques 18, 40.

Poursuite du développement du test de détection de synapse exigera qu'un certain nombre de questions importantes répondre. Tout d'abord, l'essai tel que développé ne mesure alloréactivité directe. La voie directe comporte la présentation de complexes CMH / peptide sur les APC allogéniques dérivées du donneur. Ces derniers sont généralement éliminés rapidement après la transplantation, et encore la présentation allo est carried par les APC de destinataire présentant intact donneur de CMH (voie semi-directe) ou des antigènes du donneur traités sur l'autonomie du CMH (voie indirecte). La voie indirecte est un important facteur de rejet d'allogreffe chronique 33, 41.

En principe, il devrait être possible de détecter synapses indirecte immunitaire en utilisant ce test, mais indirectement allo les lymphocytes T ont une fréquence beaucoup plus faible que les 42, 43 directs, ce qui signifie que l'analyse d'un plus grand nombre d'événements sera nécessaire. Une deuxième considération est que nous avons seulement testé ce test en utilisant des cellules T CD4 +, tandis que les cellules CD8 + T sont également un élément important de la réponse anti-donneur. Encore une fois, il devrait être possible de détecter synapses T CD8 + cellules APC à l' aide de cette méthode. Une autre limitation est que la méthode nécessite l'examen manuel et l'analyse des images de cellules dans la memb finaleporte de contact Rane, et nous travaillons actuellement sur l'automatisation de cette étape.

Enfin, la méthode nécessite des tests et le développement chez les sujets humains, et des études préliminaires avec des échantillons humains sont actuellement en cours d'exécution. Une analyse plus poussée du sous - ensemble des lymphocytes T phénotypiques (c. -à- effecteur, de la mémoire, de régulation, etc.) en combinaison avec la détection des synapses immunitaires chez les transplantés représenterait une approche puissante pour caractériser le répertoire des cellules T allo et sera un point important pour travail futur.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

SCJ a été soutenu par une société internationale de coeur et de bourses de recherche de transplantation pulmonaire et un Collège royal des médecins et chirurgiens du Canada Detweiler Fellowship.SM a été soutenu en partie par une Société internationale de transplantation cardiaque et pulmonaire bourse de perfectionnement professionnel (à SCJ). SS a été soutenue par les National Institutes of Biomedical Research Oxford Health Research Centre.JH est le récipiendaire d'un rein Research UK Senior Fellowship non-clinique. Ce travail a été financé par les subventions suivantes à AB et KW: une subvention du programme Wellcome Trust (082519Z07Z), un programme de British Heart Foundation Grant (PG / 10 / 62,28504) et le programme-cadre de l'UE 7 (une étude, BioDRIM). Les auteurs tiennent à remercier Michael Parsons et le Fonds de base à l'cytométrie en flux Lunenfeld Research Institute-Tanenbaum, du système de santé Sinai, Toronto pour fournir l'accès et le soutien à l'instrument Mark X ImageStream.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate-buffered salineVariousVaries
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificAM9260G
Triton X-100 nonionic detergentSigma-AldrichX100
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
FormaldehydeSigma-AldrichF1635Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore sizeFisher Scientific08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichP5282
7-aminoactinomycin DThermo Fisher ScientificA1310Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2eBioscience17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11beBioscience48-0112Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3eBioscience13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class IIeBioscience13-5321
Biotinylated anti-mouse B220eBioscience13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8eBioscience13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19eBioscience13-0193
Anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
MidiMACS magnetic cell separatorMIltenyi Biotec130-042-302
recombinant mouse GM-CSFPeprotech315-03
recombinant human TGFβ1Peprotech100-21Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/AImaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/AFree download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium VariousVaries
Fetal bovine serumVariousVaries
Cell culture platesVariousVaries

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