Fusion Ion Concentration Polarisation entre juxtaposées échangeuses d'ions Membranes pour bloquer la propagation de la Zone Polarisation

Résumé

Le protocole pour une nouvelle polarisation de concentration d'ions (ICP) plate-forme qui peut arrêter la propagation de la zone ICP, quelles que soient les conditions de fonctionnement est décrit. Cette capacité unique de la plate-forme repose sur l'utilisation de la fusion de l'appauvrissement d'ions et d'enrichissement, qui sont deux polarités du phénomène ICP.

Résumé

Le phénomène de concentration d'ions de polarisation (ICP) est l'une des méthodes les plus dominants à préconcentré échantillons biologiques à faible abondance. Le PCI induit une région non invasive pour les biomolécules chargées ( à savoir la zone d'appauvrissement d'ions), et les cibles peut être préconcentré sur cette région frontalière. Malgré les performances de préconcentration élevés avec ICP, il est difficile de trouver les conditions d'exploitation des zones non-propagation de l'épuisement des ions. Pour surmonter cette fenêtre d'exploitation étroite, nous avons récemment développé une nouvelle plate-forme pour préconcentration spatiotemporellement fixe. Contrairement aux méthodes qui utilisent uniquement l' épuisement des ions précédentes, cette plate - forme utilise également la polarité opposée de l'ICP ( par exemple, l' enrichissement d'ions) pour arrêter la propagation de la zone d'appauvrissement d'ions. En confrontant la zone d'enrichissement de la zone d'appauvrissement, les deux zones se confondent et arrêter. Dans cet article, nous décrivons un protocole expérimental détaillé pour construire cette Plat ICP spatiotemporellement définiorm et caractériser la dynamique de préconcentration de la nouvelle plate-forme en les comparant avec celles du dispositif conventionnel. profils de concentration d'ions qualitatives et des réponses en temps actuel capturent avec succès les différentes dynamiques entre l'ICP fusionnée et le PCI autonome. Contrairement à une classique qui peut fixer l'emplacement de préconcentration à seulement ~ 5 V, la nouvelle plate-forme peut produire un bouchon cible condensé à un emplacement spécifique dans les larges gammes de conditions de fonctionnement: tension (0,5-100 V), la force ionique (1-100 mM) et le pH (3,7 à 10,3).

Introduction

La polarisation de concentration d' ions (PIC) se réfère à un phénomène qui se produit au cours de l' enrichissement en ions et de l' appauvrissement d'ions sur une membrane à perméabilité sélective, ce qui entraîne une chute de tension supplémentaire avec des gradients de concentration d'ions ^{1, 2.} Ce gradient de concentration est linéaire, et il devient plus raide qu'une tension élevée est appliquée (régime ohmique) jusqu'à ce que la concentration en ions sur la membrane est proche de zéro (régime de limitation). A cette condition de diffusion limitée, le gradient (et flux d'ions correspondant) a été connu pour être maximisée / saturé ^1. Au - delà de cette conception classique, lorsque la tension (ou courant) est encore augmentée, on observe un courant de overlimiting, avec des zones d'appauvrissement à plat et des gradients de concentration très nettes à la frontière de la zone ^{1, 3.} La zone plane a une concentration d'ions très faible, mais à conduction de surface, de l'électro-osmoti c écoulement (EOF), et / ou électro-osmotique favorisent l' instabilité du flux d'ions et d' induire un courant overlimiting ^{3, 4, 5.} Fait intéressant, la zone d'appauvrissement plat sert de barrière électrostatique qui filtre ^{6, 7, 8, 9} et / ou des pré - cibles ^{10, 11.} Comme il y a une quantité insuffisante d'ions pour dépister les charges de surface des particules chargées (pour électroneutralité satisfaisant), les particules ne peuvent pas passer à travers cette zone d'appauvrissement et donc alignés à sa limite. Cet effet non linéaire ICP est un phénomène générique dans différents types de membranes ^{10, 11, 12, 13,}> 14 et géométries ^{6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21;} ceci est la raison pour laquelle les chercheurs ont été capables de développer différents types de filtration ^{6, 7, 8, 9} et préconcentration ^{10, 11} appareils utilisant l'ICP non linéaire.

Même avec une telle grande flexibilité et robustesse, il est encore un défi pratique de clarifier les conditions de fonctionnement des dispositifs non linéaires ICP. Le régime non linéaire de l'ICP élimine rapidement des cations à travers une membrane échangeuse de cations, ce qui provoque le déplacement d'anions se déplacent vers l'anode. Comme unPar conséquent, la zone de déplétion plat se propage rapidement, ce qui fait penser à un choc propagation ^22. Mani et al. appelé cette dynamique de la désionisation (ou épuisement) choc ^23. À préconcentrer des cibles à une détection de la position désignée, ce qui empêche l'expansion de la zone d'appauvrissement d'ions est nécessaire, par exemple, en appliquant EOF ou du débit commandé par la pression contre l'expansion de la zone ^24. Zangle et al. ²² clarifié les critères de propagation ICP dans un modèle unidimensionnel, et il dépend fortement de la mobilité électrophorétique ^17, la force ionique ^18, pH ^25, et ainsi de suite. Ceci indique que les conditions de fonctionnement appropriées seront modifiées en fonction des conditions de l'échantillon.

Ici, nous présentons la conception détaillée et des protocoles expérimentaux pour une nouvelle plate-forme ICP que préconcentrés cibles dans un spatiotempposition ²⁶ définie par voie orale. L'expansion de la zone d'appauvrissement d'ions est bloquée par la zone d'enrichissement d'ions, en laissant un bouchon de pré-concentration stationnaire à une position assignée, quelle que soit la durée de fonctionnement, la tension appliquée, la force ionique et le pH. Ce protocole vidéo détaillé est destiné à montrer la méthode la plus simple pour intégrer des membranes échangeuses de cations dans des dispositifs microfluidiques et de démontrer la performance de préconcentration de la nouvelle plate-forme ICP par rapport au conventionnel.

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Protocole

1. Fabrication de Cation Exchange Membrane-intégré puces microfluidiques

1. Préparation des maîtres de silicium
   1. La conception de deux types de maîtres de silicium: un pour la formation de motifs d'une résine échangeuse de cations et l'autre pour la construction d'un microcanal avec un polydiméthylsiloxane (PDMS).
      NOTE: La géométrie de détail sera décrit dans les étapes 1.3.1 et 1.4.1.
   2. Fabriquez les maîtres de silicium en utilisant soit la photolithographie classique ou ionique réactive profonde gravure ^27.
   3. Silaniser les maîtres de silicium avec des microélectrodes trichlorosilane (~ 30 ul) dans un récipient sous vide pendant 30 min.
      ATTENTION: Trichlorosilane est un liquide pyrophore qui est inflammable et a une toxicité aiguë (inhalation, ingestion par voie orale).
2. Préparation de moules PDMS
   1. Mélanger une base d'élastomère de silicone avec un agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 et de placer la tasse avec cette PDMS non durcie(30 à 40 ml pour la réplication de microstructures sur un 4-en tranche de silicium) dans une fiole à vide pendant 30 min pour éliminer les bulles.
      REMARQUE: La base de silicone contient des oligomères de siloxanes se terminant par des groupes vinyle et d'un catalyseur à base de platine. L'agent de durcissement de réticulation contient des oligomères ayant trois liaisons silicium-hydrure ^28.
   2. Verser les PDMS non durcis sur les maîtres de silicium, éliminer les bulles d'un ventilateur, et de guérir les PDMS à 80 ° C pendant 2 h dans un four à convection.
   3. Détachez les PDMS durcis par les maîtres de silicium et de façonner les PDMS avec un couteau bien (formes carrées, comme le montre la Figure 2a-b, iv).
3. Modeler les membranes d'échange de cations
   1. Couper la moitié du moule PDMS perpendiculairement aux deux microcanaux parallèles et percer des trous au niveau des extrémités des canaux de PDMS avec une biopsie poinçon de 2,0 mm.
      REMARQUE: le moule PDMS de conformation de la membrane sélective de cations possède deux parmicrocanaux Allel (largeur: 100 um; hauteur: 50 pm; intercanaux distance: 100 um; Figure 1a). La forme originale du moule peut être imaginé par la mise en miroir du moule en tranches le long de la ligne de coupe. microcanaux en forme de L sont recommandés pour poinçonner les deux trous sans se chevaucher.
   2. Nettoyer une lame de verre et le moule PDMS avec du ruban adhésif et un ventilateur et placez le moule sur la lame de verre pour créer fixation réversible entre eux.
   3. Selon la technique microflux de formation de motif ^29, la libération ~ 10 ul d'une résine échangeuse de cations à l'extrémité ouverte du canal qui a été découpé à l' étape 1.3.1 (Figure 1b). Placez la tête de la seringue sur les trous percés et tirer le piston (flèches noires dans la figure 1b); une pression négative douce va tirer la résine échangeuse de cations, et la résine remplira les deux canaux.
      NOTE: Il est recommandé que la hauteur du microcanal est supérieure à 1581; m, parce que la viscosité élevée de la résine nécessite haute pression pour remplir les canaux. D'un autre côté, il est préférable que la hauteur ne dépasse pas 100 um, parce que la membrane sélective d'ions à motif devienne plus épaisse que 1 pm; une telle membrane épaisse peut créer un espace entre la membrane et le canal ¹³ de PDMS.
   4. Détachez le moule PDMS sans toucher la résine à motifs et placer la lame de verre sur le chauffage à 95 ° C pendant 5 min pour évaporer le solvant dans la résine.
      NOTE: L'épaisseur de la membrane à motif est habituellement inférieure à <1 um. Le moule est délicatement détaché par articulation du moule sur le côté ouvert (ligne en pointillés et la flèche dans la figure 1b). Il est préférable de détacher le moule inférieur à 1 min après le remplissage de la résine. Si le moule est détaché quelques minutes plus tard, des membranes plus épaisses pourraient être obtenus, mais ils auraient une forme concave en raison de l'effet capillaire.
   5. Décollez l'inutileune partie de la membrane à motifs avec une lame de rasoir, faisant deux séparés ligne-modèles (Figure 1c).
      NOTE: Le matériau d'échange de cations utilisé ici a perfluorés des groupes, ce qui signifie le motif est pas fortement lié au verre. Par conséquent, la méthode de blading simple peut facilement enlever la partie inutile de la membrane.
4. Intégration du micro - canal et le substrat de membrane à motifs
   1. Poinçonner deux trous aux extrémités des microcanaux et deux autres trous où les motifs de la membrane seront situées après la liaison du canal de PDMS sur le substrat de la membrane fabriquée à motif à l'étape 1.3.
      Note: Les microcanaux PDMS possède un canal (largeur: 50 à 100 um; hauteur: 10 pm), mais elle est collée sur les extrémités du canal (figure 1d) voisine.
   2. Lier le microcanal PDMS sur le substrat de membrane à motifs immédiatement après le traitement par plasma d'oxygène pendant 40 s à 100 W et 50 mTorr.
      NOTE: Placez la membrane à motif perpendiculairement au milieu du microcanal.

2. ICP Préconcentration

1. Préparation pour l'expérience
   1. Préparer différentes solutions d'essai, y compris de 1 à 100 mM de KCl, 1 mM de NaCl (pH ~ 7), le mélange de 1 mM de NaCl et 0,2 mM de HCl (pH ~ 3,7), le mélange de 1 mM de NaCl et 0,2 mM de NaOH (pH ~ 10.3) et 1x solution saline tamponnée au phosphate.
   2. Ajouter un colorant fluorescent chargé négativement (~ 1,55 M) pour les solutions d'essai.
      Remarque: la concentration du colorant ajouté doit être beaucoup plus faible que celle des ions de sel (<10 uM) , de sorte que les colorants chargées ne contribuent pas à un courant électrique ^{30, 31.}
   3. Charger la solution d'échantillon dans un réservoir du canal, et appliquer une pression négative à l'autre réservoir à remplir le canal avec la solution. Connecter les deux réservoirs hydrodynamiquement par releasing une grosse gouttelette afin d' éliminer le gradient de pression le long du canal (figure 2a).
   4. Remplir les deux réservoirs qui sont reliés aux modèles d'échange de cations, avec des solutions tampons (1 M de KCl ou de NaCl 1 M) à l'aide d'une seringue ou une pipette pour compenser l'effet du PCI dans les réservoirs.
   5. Placer les fils au niveau des réservoirs, à travers les deux membranes à motifs (anodiques sur le réservoir gauche et la cathode à droite), et les relier à une unité de mesure de la source (figure 2a).
2. Visualisation du phénomène ICP et ICP préconcentration
   1. Chargez le dispositif ICP sur un microscope à épifluorescence inversé. Appliquer une tension (V 0,5100) et mesurer la réponse en courant avec une unité de mesure de la source.
   2. Capture d' images fluorescentes avec une caméra à dispositif à couplage de charge et d' analyser l'intensité de fluorescence en utilisant un logiciel d'imagerie ^32.

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Résultats

Les étapes de fabrication schématiques d'une membrane de préconcentration microfluidique intégré sont représentés sur la figure 1. Une description détaillée de la fabrication est donnée dans le Protocole. Les dessins et les images de l' appareil du préconcentrateur spatiotemporellement défini ²⁶ sont comparées à celles d'un classique préconcentration ¹¹ (Figure 2). Le phénomène ...

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Discussion

Nous avons décrit le protocole de fabrication et les performances d'un dispositif de préconcentration spatio-temporelle définie dans une plage de la tension appliquée (de 0,5 à cent V), la force ionique (1-100 mM) et le pH (03.07 à 10.03), réalisant un pli 10 000 préconcentration des colorants et des protéines dans les 10 min. Comme comme dispositifs ICP précédents, la performance de préconcentration devient meilleur à tension plus élevée et à une force ionique inférieure. Un paramètre supplémenta...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning
Trichlorosilane	Sigma Aldrich	175552	Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%	Sigma Aldrich	527122
Sodium chloride	Sigma Aldrich	71394
Potassium chloride	Sigma Aldrich	60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20000
Isothiocyanate-conjugated albumin	Sigma Aldrich	A9771
Phosphate buffer saline, 1x	Wengene	LB004-02
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
Epifluorescence microscope	Olympus	IX-71
Charged-coupled device camera	Hamamtsu Co.	ImageEM X2
Source measurement unit	Keithley Instruments	2635A
Covance-MP	Femto Science