Mise à l'échelle de l'ingénierie vasculaire Greffes Utilisation 3D Printed Guides et Méthode d'empilage Anneau

Résumé

les vaisseaux sanguins d'ingénierie évolutive permettrait d'améliorer l'applicabilité clinique. Utilisation des guides 3D imprimés facilement considérables, anneaux de muscle lisse vasculaire ont été créés et empilés en une forme tubulaire, formant un greffon vasculaire. Greffes peuvent être dimensionnés pour répondre à la gamme de dimensions des artères coronaires humaines en changeant simplement la taille de la 3D-imprimé guide.

Résumé

La maladie coronarienne reste une cause majeure de décès, touchant des millions d'Américains. Avec le manque de greffons vasculaires autologues disponibles, les greffes d'ingénierie offrent un grand potentiel pour le traitement des patients. Cependant, les greffes vasculaires d'ingénierie ne sont généralement pas facilement modulable, ce qui nécessite la fabrication de moules sur mesure ou tubes de polymère afin de personnaliser différentes tailles, ce qui constitue une pratique chronophage et coûteuse. artères humaines varient en diamètre de lumière d'environ 2,0 à 38 mm et une épaisseur de paroi d'environ 0,5 à 2,5 mm. Nous avons créé une méthode, appelée "Ring Méthode d'empilage», dans lequel des anneaux de taille variable de tissu du type cellulaire souhaité, montré ici avec des cellules musculaires lisses vasculaires (CML), peut être créé à l'aide des guides de montants centraux pour contrôler le diamètre lumen et coques extérieures de dicter l'épaisseur de la paroi du vaisseau. Ces anneaux de tissu sont ensuite empilées pour créer un produit d'assemblage tubulaire, imitant la forme naturelle d'un vaisseau sanguin. La longueur du navire peut be conçue par l'empilement simplement le nombre de cycles nécessaires pour constituer la longueur nécessaire. Avec notre technique, les tissus de formes tubulaires, semblable à un vaisseau sanguin, peuvent être facilement fabriqués dans une variété de dimensions et longueurs pour répondre aux besoins de la clinique et le patient.

Introduction

Dans le traitement de la maladie coronarienne (CAD), propres vaisseaux sanguins d'un patient sont prélevés en tant que matériau de greffe pour la chirurgie de pontage. Cependant, souvent, les malades ne sont pas des navires viables pour faire un don à eux-mêmes, et dans les cas où ils le font, le site donneur provoque des dommages supplémentaires considérables et a un risque sérieux d'infection. ¹ greffes vasculaires Engineered pourraient combler ce besoin. Évolutivité est d'une importance capitale pour les navires d'ingénierie afin de répondre à la vaste gamme de besoins des patients de la taille des navires. Cependant, les méthodes actuelles pour les navires d'ingénierie ne sont pas facilement extensible, et nécessitent généralement refabrication de moules complexes ou échafauds polymères. La plupart des greffons conçus soit utilisent un échafaudage tubulaire en polymère qui est ensemencé avec des fibroblastes musculaires lisses vasculaires ou des cellules endothéliales; ou roulage d'une feuille de cellules autour d'un mandrin pour créer un tube de tissu. Deux greffes vasculaires d'ingénierie dans des essais cliniques sont basés sur une decellularized plateforme polymère ECM. ^{2, 3, 4} greffes polymères disponibles pour une utilisation dans la réparation vasculaire sont déjà connus pour avoir des problèmes avec la perméabilité, ce qui pourrait se poser comme un problème majeur avec l' application à long terme d'une greffe avec une présence de polymère durable. Moules tubulaires ont été utilisés pour fabriquer complètement vaisseaux cellulaires, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13} quelles procédures auraient besoin de conception supplémentaires et la fabrication d'outils pour moules personnalisés afin de produire des navires dans une variété de tailles .

Le procédé décrit dans ce document comprend une nouvelle technique permettant de créer facilement extensible vasculaire machinégreffes utilisant des inserts personnalisables 3D imprimés et des plaques de culture traditionnelles. ¹⁴ Les cellules sont ensemencées dans des plaques avec des inserts d'un poste central et enveloppe extérieure. Les contrôles post diamètre de la lumière et permet à la monocouche cellulaire à l'auto-assembler en un anneau de tissu. L'extérieur des commandes shell épaisseur de l'anneau, et donc l'épaisseur de la paroi du récipient final. anneaux de tissu remplis sont ensuite empilés pour former un tube, la greffe vasculaire. L'avantage de cette méthode, dite "Ring Méthode d'empilage» est que tout type de cellules adhérentes peut être ensemencée dans la configuration de la plaque et les anneaux ou tubes de toute dimension nécessaire à l'application souhaitée des tissus peuvent être générés par simple modification des inserts de guidage. Techniques comparatives en tissus Création d'ingénierie anneaux de tissu restent difficiles à l' échelle, ^{15, 16} nécessitant refabrication de moules pour chaque taille souhaitée. En outre, des greffes vasculaires faites en utilisant cette méthode peut être produired en 2-3 semaines, plusieurs semaines plus rapide par rapport à d'autres navires d'ingénierie. ⁶ Pour la clinique, cette fois différence peut faire une différence significative dans le traitement d'un patient se détériore.

Protocole

1. Culture cellulaire Préparation

1. Utiliser des cellules musculaires lisses aortiques humaines de muscle achetés dans le commerce.
2. Maintenir les cellules dans le muscle lisse des milieux de croissance cellulaire composée de 88,6% 231 médias, 0,1% chacun d'insuline humaine recombinante (rh-insuline), le facteur de croissance fibroblastique humain recombinant (rh-FGF), le facteur de croissance épidermique humain recombinant (rh-FGF), et l'acide ascorbique; et 5% chacun de sérum bovin fœtal (FBS) et de la L-glutamine; et 1% d'antibiotique / antimycotique.
   NOTE: Chaque facteur de croissance, de FBS et L-glutamine sont achetés sous forme de kit de croissance des médias vasculaire.
3. médias Changer toutes les 48 heures jusqu'à ce que les cellules sont environ 90% de confluence et prêt pour l'ensemencement des tissus.
4. Stocker les piles dans un incubateur entre les changements des médias pour l'expansion.

2. Préparation de la 3D Printed Inserts et personnalisé en silicone moulé Plaques

1. Utilisez une imprimante 3D commerciale (par exemple, Replicator Mini) pour 3D imprimer les inserts de plaque.
   1. Utilisez open source de logiciel de conception 3D tels que Blender pour créer les modèles 3D des extérieurs coquilles et des postes imprimés.
   2. Exporter le fichier du pilote du modèle via un format .stl permettant la portabilité au logiciel de l'imprimante 3D.
   3. Produire des messages imprimés et des coquilles extérieures à l'aide de filaments de poly (acide lactique) (PLA) chargé dans l'imprimante 3D.
   4. À la suite de l'impression, effectuer un trempage de 30 minutes dans 70% -100% de solution d'éthanol pour stériliser chaque insert.
2. Préparer un agent de durcissement 01:10 à la base du mélange polymère de silicone polymère poly (diméthylsiloxane) (PDMS) et permettre au mélange de dégazer à la température ambiante pendant 10 min.
   1. Définir les tailles de boîtes de Pétri utilisés en tant que petit (35 mm), intermédiaire (60 mm) et de grande taille (100 mm).
   2. Ajouter 2 ml, 4 ml et 6 ml de silicone non durci à chaque petite plaque intermédiaire et grande, respectivement, et de créer une couche mince à travers tout le fond de la boîte de Pétri.
   3. Créer des postes pour la petite plaque en versant PDMS dans un100 mm plaque à une hauteur de 7 mm et laisser durcir sur une plaque chauffante à 60 ° C pendant environ 2-3 heures. Ensuite, utilisez une biopsie poinçon de 5 mm pour perforer les messages cylindriques. Utilisez une petite quantité de PDMS non durcies pour fixer chaque PDMS cylindre et au centre de chaque petite assiette.
   4. Les plaques intermédiaires et grands, avant le durcissement complet du PDMS au fond de la plaque, placer les articles imprimés 3D 10 mm et 20 mm de diamètre au centre dans chacune des plaques intermédiaires et grandes, respectivement. Pour les grandes plaques, placer en outre une 3D imprimée enveloppe extérieure d'environ 66,7 mm de diamètre équidistance du poste.
      1. Permettre à chaque plat à durcir à l'air libre sur une plaque chauffante à 60 ° C pendant environ 2-3 heures, ce qui permet 18 heures pour le dégazage du polymère. Fixer des composants imprimés sur la plaque dans la région et l' orientation correcte comme on le voit sur la figure 1.
   5. Ajouter une solution de 70% d'éthanol avec 30% d'eau distillée pendant 30 minutes à l'intérieur de toutes les plates pour la stérilisation puis couvrent chaque plaque.
   6. Aspirer soigneusement l'éthanol à partir de chaque plaque et laisser sécher à l'air.
   7. Dresser chaque assiette dans une enceinte de sécurité biologique (BSC) à côté de son couvercle, face vers le haut. Exposer assiettes et couvercles à la lumière UV sous le BSC pendant 30 minutes pour effectuer la stérilisation. La technique stérile est réalisée avec chaque étape après l'exposition aux UV.

3. Préparation de fibrine Hydrogel, Ensemencement avec des cellules musculaires lisses et entretien des plaques

1. Mélanger une solution de gel de fibrine contenant du milieu de croissance + 0,01% de TGF-β1 dans des quantités de 0,5 ml, 1,1 ml et 1,81 ml pour les petites et grandes tailles intermédiaires de plaques, respectivement.
   1. Ajouter 40 ul, 88,4 pi et 145 pi de thrombine, à partir d'un stock de 100 U / ml, pour les médias de chaque petit, intermédiaire et grande plaque, respectivement. Remuer doucement chaque plaque à la main pour veiller à ce que la thrombine soit homogène au sein des médias.
   2. Ensuite, ajoutez 1601; L, 354 pi et 580 pi fibrinogène, à partir d'un stock de 20 mg / ml, goutte à goutte circulairement au mélange thrombine-médias à chaque petit, intermédiaire et grande plaque, respectivement. Remuer doucement à la main pour assurer le mélange et la distribution de l'hydrogel en une couche régulière.
   3. Laisser hydrogel durcir pendant 10-15 minutes à la température ambiante.
2. Trypsiniser les cellules musculaires lisses élargies en 150 mm des plaques de culture cellulaire et centrifugation selon les protocoles standards. Le culot résultant doit être remis en suspension dans 3 ml de milieu de différenciation consistant en 98% - 231 médias, 1% de FBS et 1% d'antibiotique / antimycotique.
   1. Mélanger vigoureusement les cellules par titration de haut en bas avec une pipette de 2 mL pour briser les amas cellulaires. Nombre de cellules avec un hémocytomètre et créer une suspension de cellules de 2 x 10 ⁶ cellules / ml, 1,0 x 10 ⁷ cellules / ml et 1,4 x 10 ⁷ cellules / ml pour les petites et les grandes plaques intermédiaires, respectivement.
   2. Ajouter 1 mL de chaque int suspension cellulaireoa 50 ml conique correspondant marqué petite, intermédiaire et grande. Mettre en place un supplément de 50 ml conique de cette manière pour chaque anneau de tissu supplémentaire souhaité.
   3. Ajouter un média de différenciation à chaque conique pour obtenir des volumes d'ensemencement final de 2 ml, 4 ml et 5 ml pour chaque petit, intermédiaire et grand vaisseau, respectivement. Ensuite, pipeter soigneusement la solution cellulaire goutte à goutte sur le dessus de l'hydrogel préparé dans chaque plaque correspondante.
   4. Placer les plaques dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
3. Changer les médias de différenciation toutes les 48-72 heures pour chaque plaque. Dans le cas de la plus grande plaque, changer de support initialement après 24 heures, puis le changer tous les 48-24 heures pour compenser la grande densité d'ensemencement des cellules.
   1. Après 2-4 jours que les anneaux ont complètement contractée vers le poste, ajouter 10 pi, 20 pi et 35 pi de TGF-β1 à chaque petit, intermédiaire et grand anneau, respectivement. Après l'exposition au TGF-β; 1 pendant au moins 24 heures, les anneaux sont prêts à être manipulés.

4. Assemblée des Vascular construire et d'entretien

1. Avant la fabrication de la construction finale vasculaire, un conteneur spécialisé est créé pour maintenir le récipient rempli.
   1. Pour le petit navire, créer une plaque haute pour l'anneau d'empilage en coupant une section de 2 pouces sur le dessus d'un polycarbonate ml tube de 50 conique, puis PDMS coller le bord découpé dans une plaque de 35 mm. Utilisez le couvercle conique, comme le couvercle de la plaque.
   2. Pour le vaisseau de haut anneau intermédiaire et grand empilement de plaques, couper un diamètre tube de polycarbonate de 1,75 pouces dans 2,5 sections pouces de la longueur pour servir les murs de la plaque de hauteur. Pour le fond de la plaque de hauteur, couper une feuille de polycarbonate de 0,125 pouce d'épaisseur en 2 pouces morceaux de cercle de diamètre. Utilisation de ciment acrylique solvant, lier la section de tube de polycarbonate à la pièce de découpe circulaire. Utilisez le couvercle d'une boîte de Pétri de 60 mm que le couvercle pour la plaque de hauteur.
   3. 3D pmessages de Rint 5, 10 et 20 mm de diamètre et 50 mm de longueur.
   4. Ajouter 10 ml de silicone non durci à chaque récipient. Avant le durcissement complet du PDMS, placer au centre de chaque poste créé à l'étape 4.1.3 dans chaque petite, intermédiaire et grand récipient.
   5. Laisser sécher sur un ensemble de plaque chaude à 60 ° C pendant 2-3 heures.
   6. Stériliser avec une solution d'éthanol à 70% avec 30% d'eau distillée pendant 30 minutes.
   7. Aspirer soigneusement l'éthanol à partir de chaque récipient, puis laisser sécher à l'air dans le BSC. Ensuite, organiser les conteneurs dans la hotte avec chaque plaque placée à côté de son couvercle, face vers le haut. Exposer des conteneurs à la lumière UV sous le BSC pour 30 minutes supplémentaires pour stérilisation supplémentaire. Utiliser une technique stérile avec chaque étape après l'exposition aux UV.
2. En utilisant des pinces très fines, retirez soigneusement chaque anneau d'hydrogel de muscle lisse roulées à partir de son poste et transférer à son grand récipient, correspondant aux grands postes.
   1. Utilisez une paire deforceps dans chaque main et soulever un côté de l'anneau du poste, puis l'autre. Soyez prudent pour protéger et maintenir la lumière.
   2. Effectuer le transfert avec ce procédé à deux mains, glissant premier côté, puis de l'autre côté de l'anneau sur le grand poteau. En utilisant, les mouvements progressifs doux, et de travailler de manière circonférentielle, pousser lentement l'anneau vers le bas sur le grand poteau. empiler ensuite les anneaux de tissu jusqu'à ce que la longueur de la cuve souhaitée a été obtenue, chaque anneau ajoutant environ 1-2 mm de longueur pour la construction terminée.
3. Avec la pile de l'anneau positionné sur les 3D imprimés messages grands, tourner la plaque de sorte que le poste est parallèle à la surface de travail.
   1. À l'aide d'une micropipette, ajouter 40, 80 et 160 ul de thrombine à une concentration de 100 U / ml en douceur à la surface extérieure de chaque petit, moyen et gros vaisseaux, respectivement. Tout en ajoutant de la thrombine, tourner lentement la plaque pour assurer une couverture uniforme de toutes les surfaces de la construction.Ce sera la base pour la colle de fibrine utilisé pour sécuriser la construction de la pile de l'anneau dans les premiers jours après la construction.
   2. Ensuite, ajouter 40, 80 et 160 ul de fibrinogène à une concentration de 20 mg / mL à chaque petite, intermédiaire et grande construction, respectivement, à l'aide d'une micropipette, tout en faisant tourner rapidement le produit d'assemblage. La thrombine et le fibrinogène rapidement mis dans un gel ferme une fois mélangé. En raison du temps de durcissement courts, appliquer le fibrinogène aussi rapidement et uniformément que possible.
4. Ajouter 20 ml de milieu de différenciation pour chaque récipient contenant le produit d'assemblage. Placer les vaisseaux dans un incubateur à 37 ° jusqu'à ce que nécessaire. Changer les médias tous les 3-5 jours.

Résultats

Démontrée ici est la fabrication de 3 tailles différentes d' ingénierie vasculaire de greffe (figure 1), ce qui montre que la Méthode d' empilage Ring (RSM) est évolutive. Pour prouver l' applicabilité, les 3 tailles de navires différents choisis corrélat la taille réelle du vaisseau humain pour l'artère descendante antérieure gauche (petite; diamètre de la lumière = 4 mm) ^17, aorte descendante (intermédiaire; lumiè...

Discussion

La Méthode d'empilage Anneau présente de multiples avantages par rapport aux techniques actuelles vasculaires de l'ingénierie tissulaire construct. Le RSM peut être adapté pour créer des vaisseaux humains de toute taille en personnalisant simplement les dimensions de poste et de coquille extérieure. Notre méthode permet le développement de navires d'ingénierie sans polymères composés uniquement de cellules humaines et de dégradation rapide matériau de support trouvé dans le processus de cicatr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody