Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

Résumé

Hippocampe organotypiques (CSST) représentent un modèle in vitro qui simule la situation in vivo très bien. Nous décrivons ici une base vibratome amélioré tranchage protocole pour obtenir des tranches de haute qualité devant servir à évaluer le potentiel neuroprotecteur de substances nouvelles ou le comportement biologique des cellules tumorales.

Résumé

Dans l’hippocampe organotypiques (CSST), les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des neurones et de cellules gliales sont bien conservés. Ce modèle est adapté pour répondre aux questions de recherche différentes qui impliquent des études sur la neuroprotection, expériences électrophysiologiques sur les neurones, les réseaux neuronaux ou invasion tumorale. L’architecture de l’hippocampe et l’activité neuronale dans les circuits de multisynaptic sont bien conservées dans CSST, même si la procédure de trancher elle-même initialement des lésions et conduit à la formation d’une cicatrice gliale. La formation de cicatrices modifie sans doute les propriétés mécaniques et le comportement de diffusion de petites molécules, etc.. Tranches de permettent le suivi des processus dépendants du temps après traumatisme crânien sans chirurgie animale et les études sur les interactions entre les divers types de cellules encéphales, nommément astrocytes, la microglie et les neurones sous tant physiologiques que pathologiques conditions. Un aspect ambivalent de ce modèle est l’absence de flux sanguin et immunitaire des cellules sanguines. Au cours de la progression de la lésion neuronale, la migration des cellules immunitaires d’après la pièce de sang un rôle important. Comme ces cellules manquent en tranches, on peuvent observer les processus intrinsèques dans la culture sans ingérence extérieure. En outre, à la CSST la composition de l’environnement du milieu extérieur est contrôlée avec précision. Un autre avantage de cette méthode est la diminution du nombre d’animaux sacrifiés par rapport aux préparations standards. Plusieurs CSST peut provenir d’un animal permettant des études simultanées avec des traitements multiples chez un animal. Pour ces raisons, la CSST sont bien adaptés pour analyser les effets de nouvelles thérapeutiques de protection après des lésions tissulaires ou au cours de l’invasion tumorale.

Le protocole présenté ici décrit une méthode de préparation de la CSST qui permet de générer très reproductible, bien conservé les tranches qui peuvent être utilisés pour une variété de recherches expérimentales, comme études invasion neuroprotection ou une tumeur.

Introduction

CSST sont un modèle bien caractérisés in vitro pour étudier les propriétés physiologiques et pathologiques des neurones, les astrocytes et les cellules microgliales¹. Il est facile de contrôler l’environnement extracellulaire et de surveiller les changements morphologiques et cellulaires après divers stimuli. L’Organisation des neurones de l’hippocampe et leurs connexions sont bien conservées après préparation^2,3. De plusieurs avantages, CSST permettent la surveillance de l’invasion de lésions et tumeurs cérébrales sans chirurgie animale. Six à huit CSST peut être obtenues d’un seul cerveau de rongeur. CSST contribue ainsi à considérablement réduire le nombre d’animaux et permettent de tester plusieurs concentrations du médicament, des manipulations génétiques ou modèles de lésion différents chez le même animal. Dans les essais axés sur la tranche, conditions expérimentales peuvent être contrôlées avec précision. En outre, temps de développement dépendant d’états pathologiques comme dommages secondaires peuvent facilement être surveillés par imagerie de Time-lapse.

Dans le protocole donné, initialement créé par Stoppini et al. ⁴, les étapes de préparation sont décrites et morphologiques marquants pour la sélection des tranches appropriées sont mises en évidence. Nous vous recommandons la préparation des jours après la naissance, 7-9 rats ou des souris postnatal jour 4-5. Dans ces périodes, la CSST montrent une solide résistance aux traumatismes mécaniques et un potentiel élevé pour la réorganisation des circuits neuronaux. En revanche, préparations des rats adultes ou embryonnaires rapidement modifient leur structure et perdent leur morphologie organotypique pendant la culture et sont donc moins adaptées pour l’étude des processus à long terme dans la recherche fondamentale^{5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}. un autre point critique pour la survie de la CSST est l’épaisseur de la tranche lui-même comme la diffusion et donc l’apport en nutriments sont limitées^12,13,14.

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Protocole

des expérimentations animales ont été effectuées conformément à la politique d’éthique et de la politique sur l’utilisation des animaux dans la recherche en neurosciences, tel qu’approuvé par l’européen collectivités Conseil Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil de l’Union européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

1. préparation des Instruments et des milieux de Culture

1. pour la préparation de la CSST, utiliser l’ensemble des instruments suivants : deux petits ciseaux, deux pinces courbées, une pince à épiler avec une pointe fine, trois lames (deux de taille 11, une de taille 15), trois titulaires de bistouri, tour de papier-filtre (diamètre : 35 mm), agar, une lame de rasoir, un non modifié de pipette Pasteur et une pipette Pasteur sans une pointe de modification. Stériliser tous les matériaux dans un autoclave avant utilisation ( Figure 1).
2. Peser 5 g de gélose et dissoudre dans 100 mL d’eau distillée. Stérilisez la solution pendant 20 min à 121,7 ºC à 210,8 kPa en autoclave. Distribuer le 3 mL de solution d’agar liquide dans des plats de Pétri de 60 mm à l’aide d’une pipette de verre stériles, autorisez-le à solidifier pendant 5 h, pellicule de paraffine en plastique pour éviter toute contamination et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure. Blocs de gélose sont nécessaires pour stabiliser le cerveau au cours de la procédure de tranchage.
3. Media
   1. faire 200 mL du milieu préparation (pH 7,35) constitué d’un milieu essentiel minimal (MEM) 198 mL et 2 mL de solution de L-glutamine (concentration finale de 2 mM). Préparer la solution le jour de la préparation des médias et de conserver à 4 ° C.
   2. Préparer 100 mL de milieu de culture composée de 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' balanced solutions salines (HBSS), 25 mL (v/v) de sérum de cheval normal (NHS), 1 mL de solution de L-glutamine (concentration finale de 2 mM), 100 µg d’insuline, glucose de 120 mg, streptomycine 10 mg , 10 000 U la pénicilline et 800 µg vitamine C comme indiqué précédemment. Chauffer le milieu (37 ° C), ajuster le pH à filtre pH 7,4 et stérile (taille des pores 0,2 µm). Répéter la procédure (échauffement, ajustement du pH, etc..) tous les deux jours avant de changer le support. Utiliser le support au plus une semaine lorsqu’il est conservé à 4 ° C.
4. Remplir une boîte de Petri 35 mm avec support de préparation pour stocker le cerveau. Placer deux boîtes de Pétri vide pour recueillir le tissu sur un paquet de refroidissement dans la zone de travail.

2. Préparation et trancher avec un Vibratome

1. utilisation cerveaux de rats vieux de 7 à 9 jours ou 4 à 5 jours des souris âgées pour la préparation de la CSST selon Stoppini et al.. ⁴ après décapitation d’animaux, enlever la peau du crâne avec des ciseaux.
2. Introduire la lame de ciseaux fine dans le trou occipital et ouvrir le crâne en coupant l’axe caudal rostral (retour) (avant). Faire deux coupes perpendiculaire au premier, pour que les ciseaux pointent vers l’oreille gauche et droite, respectivement (" T-incision ").
3. Ouvrir avec précaution le crâne avec une pince fine, attention ne pas à blesser le cerveau. Utiliser un scalpel (taille de lame 11) pour couper la partie rostrale plus du pôle frontal et le cervelet.
4. Au moyen d’une spatule, enlever le cerveau et le placer soigneusement dans la boîte de Pétri remplie de moyen de préparation ( Figure 2). Positionner le cerveau sur le porte-échantillon et le fixer avec de la colle cyanoacrylate médicale. Utilisez les pièces de gélose pour assurer la stabilisation mécanique.
5. Disséquer les tissus horizontalement en 350 µm CSST épaisse à l’aide d’un coulissant vibratome.
6. Évaluer les tranches optiquement à l’aide d’un microscope binoculaire. Jeter immédiatement CSST de piètre qualité. Il est important de prendre seulement ces tranches avec intact cytoarchitecture isolée de la partie médiane de l’hippocampe (voir Figures 3 et 4) entre la dorsale et l’hippocampe ventral.
7. Séparer la région de l’hippocampe et le cortex entorhinal, à l’aide d’un scalpel (tour de taille de lame 15 ; la figure 3). Le cortex entorhinal et de voie de perforante doit être préservé.
8. Six à huit CSST sont prélevés sur chaque cerveau. 2-3 tranches de transfert dans l’insert de culture d’une seule cellule (pore taille 0,4 µm) et le placer dans une cupule d’une boîte de 6 puits culture contenant 1 mL de milieu de culture par puits.
9. Incuber les paraboloïdes 6 à 35 ° C dans une atmosphère complètement humidifiée avec 5 % (v/v) de CO ₂ et changer le milieu de culture cellulaire chaque deuxième jour.
   Remarque : Effectuer vos expériences au jour 6 in vitro (div). Des réactions inflammatoires associées à la procédure de tranchage disparaissent par jour 6. À ce stade, les cellules microgliales réafficher une morphologie ramifiée et connexions synaptiques ont mûri.

3. Évaluation de la qualité des tissus

1. Fixation, étiquetage et visualisation de la dégénérescence des neurones en CSST
   1. après avoir effectué les expériences, incuber le CSST avec 5 µg/mL d’iodure de propidium (PI) pendant 2 h avant la fixation, dans ordre de colorer les noyaux de neurones dégénérescentes.
      ATTENTION : PI est une substance cancérogène, portez toujours des équipement de protection individuelle (EPI) tel que des gants.
   2. Laver le CSST avec tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) et fixez-les avec une solution à 4 % (v/v) de paraformaldéhyde (PFA) pendant 24 h.
      ATTENTION : PFA est un cancérogène toxique et suspects. Travailler sous hotte aspirante et porter les EPI.
   3. Laver le CSST à inserts avec 1 mL de PBS et utilisez une brosse de gréeur pour séparer les tranches de la membrane.
   4. Label le CSST avec colorant ₄ IB dans une plaque 24 puits ( Figure 5).
2. Conduction d’expériences d’invasion tumorale à l’aide de fluorescent étiqueté monocellules
   1. 24h avant le début d’une expérience, numéroter les cellules tumorales en utilisant le colorant fluorescent carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester (CFDA SE).
   2. Détacher et compter les cellules de la tumeur en utilisant une chambre Neubauer.
   3. Remettre en suspension les cellules dans un milieu, telle que 10 µL de suspension contient le nombre de cellule désiré (normalement 50 000 ou 100 000 cellules).
   4. Appliquer 10 µL de la suspension de cellules dans la culture de la tranche et laisser les cellules d’envahir pendant 3 jours.
   5. à la fin de l’expérience, fixer les cultures de la tranche à l’aide de 4 % (v/v) : PFA pendant 24 h et étiqueter les co-cultures avec PI un autre 24 h à visualiser la cytoarchitecture.
      ATTENTION : PFA est un cancérogène toxique et suspects. Travailler sous hotte aspirante et porter les EPI.
   6. Monter les co-cultures sur une lamelle couvre-objet pour une analyse plus approfondie à partir du support de montage.

4. Évaluation des expériences de la CSST

analyser le CSST avec un confocal laser scanning microscope (CLSM). Détection de PI étiqueté, dégénérescence des neurones ou le PI étiqueté cytoarchitecture utiliser une lumière monochromatique de la longueur d’onde λ = 543 nm et une bande d’émission passent de filtre pour les longueurs d’onde λ = 585-615 nm. Pour le CFDA mention des cellules tumorales ou IB ₄ cellules microgliales, utiliser une longueur d’onde d’excitation de λ = 488 nm. Pour les deux types expérimentaux, enregistrer une z-pile avec 2 tranches optique µm et utilisé pour l’évaluation.

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Résultats

Études de Neuroprotection : Pour déterminer les dommages neuronaux, le nombre de noyaux positifs PI et IB₄ positif la microglie dans chaque troisième section optique de la couche de cellules de granules (GCL) du gyrus denté (DG) a été comptée. Pour des expériences d’invasion tumorale, la z-projection d’intensité maximale de la pile a été utilisée pour calculer la superficie couverte par les cellules tumorales, en guise d’invasion et de visual...

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Discussion

Le présent protocole décrit la préparation de la CSST. Ce modèle permet de tester les capacités intrinsèques et les réactions du tissu cérébral après l’application de stimuli physiologiques et pathologiques. En plus des analyses des paramètres électrophysiologiques, CSST peut être lésé, et les effets de dégâts sur tous les types de cellules peuvent être déterminés. Traitement avec différentes matières, la description détaillée des procédés de lésion ou de guérison en l’absence des macropha...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well	Falcon	35-3046
Agar	Fluka	5040
Autoclav	Systec	DX-45
CFDA	Thermo Fisher	V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700	Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium	Invitrogen	32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Labs	FL-1101
Glucose	Merk	1083371000
Glutamin	Invitrogen	25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)	Invitrogen	24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)	Invitrogen	14170-138
Insulin	Sigma Aldrich	I5500
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960
L-Glutamin	Invitrogen	25030-024
LN229	Cell-Lines-Service	300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)	B.Braun	1050052
Millicell Culture Inserts	Millipore	PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid	Sigma Aldrich	M3262
Normal Horse Seum	Invitrogen	26050-088
Penicillin Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Petri dishes (all sizes)	Greiner	627160/664160/628160
PFA	Roth	0335.1	toxic
Propidium iodid (PI)	Sigma Aldrich	81845-25MG	toxic
U138	ATCC	HTB-14
Vibratome	Leica	Leica VT 1200