Évaluation de la viabilité neuronale à l'aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

Résumé

Ce protocole décrit comment mesurer avec précision la viabilité neuronale à l'aide de la diurétate de fluorescéine (FDA) et de la double coloration à l'iodure de propidium (PI) dans des neurones de granules cérébelleux cultivés, une culture neuronale primaire utilisée comme modèle in vitro dans les recherches en neuroscience et neuropharmacologie.

Résumé

Les neurones de granules céréaliers cultivés primaires (CGN) ont été largement utilisés comme modèle in vitro dans les recherches en neurosciences et neuropharmacologie. Cependant, la coexistence de cellules gliales et de neurones dans la culture CGN pourrait entraîner des biais dans l'évaluation précise de la viabilité neuronale. Le diacétate de fluorescéine (FDA) et la double coloration à l'iodure de propidium (PI) ont été utilisés pour mesurer la viabilité cellulaire en évaluant simultanément les cellules viables et mortes. Nous avons utilisé la double coloration FDA-PI pour améliorer les sensibilités des tests colorimétriques et pour évaluer la viabilité neuronale dans les CGN. En outre, nous avons ajouté des taches d'ADN fluorescentes bleues ( p. Ex. Hoechst) pour améliorer la précision. Ce protocole décrit comment améliorer la précision de l'évaluation de la viabilité neuronale en utilisant ces méthodes dans la culture CGN. En utilisant ce protocole, le nombre de cellules gliales peut être exclu en utilisant une microscopie à fluorescence. Une stratégie similaire peut être appliquée pour distinguer le gli indésirableAl-cellules de neurones dans diverses cultures de cellules mixtes, telles que la culture corticale primaire et la culture de l'hippocampe.

Introduction

Les tests de cytotoxicité colorimétrique, tels que le dosage du bromure de 3- (4, 5-diméthyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphényl-2-H-tétrazolium (MTT), sont couramment utilisés pour mesurer la viabilité cellulaire in vitro . Les neurones de granules céréaliers cultivés primaires (CGN) provenant de rats sont sensibles à diverses neurotoxines, y compris l'ion 1-méthyl-4-phénylpyridinium, le peroxyde d'hydrogène et le glutamate ^{1 , 2} . Par conséquent, les cultures CGN peuvent être utilisées comme un modèle in vitro dans le domaine des neurosciences. Les cultures de CGN peuvent contenir une variété de cellules, y compris les neurones et les cellules gliales, qui peuvent représenter environ 1% des cellules totales dans la culture CGN. Cependant, les cellules gliales répondent différemment aux neurotoxines par rapport aux neurones, conduisant à un biais dans la viabilité neuronale mesurée par des analyses colorimétriques ³ .

Dans les cellules viables, le diacétate de fluorescéine (FDA) peut être converti en fluorescéine par l'esterase.L'iodure de propidium (PI) peut interagir avec l'ADN après avoir pénétré des cellules mortes et peut être utilisé pour indiquer l'apoptose dans la culture. Par conséquent, la double coloration FDA-PI peut évaluer simultanément des cellules viables et des cellules mortes, ce qui suggère que la viabilité cellulaire peut être mesurée plus précisément en combinant les deux méthodes colorimétriques. De plus, en ajoutant Hoechst, une coloration fluorescente bleue pour les noyaux, la précision de la viabilité cellulaire pourrait encore être améliorée. Le protocole présenté ici décrit la coloration double FDA-PI et la coloration triple FDA-PI-Hoechst, qui peut être utilisée pour analyser avec précision la viabilité neuronale dans les CGN cultivés primaires.

Ce protocole profite de la visualisation et de la distinction des CGN et des cellules gliales par leurs différentes tailles et formes. Après la coloration, le nombre de neurones viables et de neurones morts est compté à partir d'images représentatives prises par microscopie fluorescente. Les cellules gliales de grande taille sont exclues par la comparaison des CGN typiques tAken sous le mode fluorescent avec ceux pris sous le mode de contraste de phase. Une stratégie similaire peut être réalisée pour mesurer la viabilité neuronale dans des cultures cellulaires mixtes contenant des neurones et des cellules gliales, telles que des cultures corticales primaires et des cultures d'hippocampes.

Protocole

Toutes les procédures ont suivi le Guide National des Instituts de Santé (NIH) pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire (Publications des NIH n ° 80-23, révisé en 1996) et ont été approuvés par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) à l'Université de Ningbo ( SYXK-2008-0110).

1. Préparation des solutions et des médias culturels

Remarque: Les réactifs et les stocks doivent être préparés dans des conditions stériles. Stérilisez en filtrant à l'aide d'un filtre avec une taille de pore de 0,22 μm.

1. Préparez la solution mère de Poly-L-Lysine (PLL) en ajoutant 5 mg de PLL à 10 ml d'eau double-distillée (ddH ₂ O). Stérilisez en filtrant. Aliquotez et stockez la solution stock PLL à -20 ° C pendant plusieurs mois.
2. Préparer le tampon de Krebs en ajoutant 7,25 g de NaCl, 0,4 g de KCl, 0,14 g de NaH ₂ PO ₄ , 2,6 g de D-glucose et 5,94 g d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazineéthanesulfonique à 100 ml de DdH _{2 <}/ Sub> O. Stérilisez en filtrant. Conservez la solution tampon Krebs à 4 ° C pendant un maximum d'un mois.
3. Préparer 3,82% de solution de Mg ₂ SO ₄ en ajoutant 3,82 g de Mg ₂ SO ₄ à 100 ml de ddH ₂ O. Stériliser en filtrant. Conservez la solution de Mg ₂ SO ₄ à 4 ° C pendant plusieurs mois.
4. Préparer 1,2% de solution de CaCl ₂ en ajoutant 1,2 g de CaCl ₂ à 100 ml de ddH ₂ O. Stériliser en filtrant. Conserver la solution de CaCl ₂ à 4 ° C pendant plusieurs mois.
5. Préparez une solution de 2M KCl en ajoutant 15 g de KCl à 100 mL de ddH ₂ O. Stérilisez en filtrant. Conservez la solution de KCl à 4 ° C pendant plusieurs mois.
6. Préparer la solution mère de D-glucose en ajoutant 1,8 g de D-glucose à 100 ml de ddH ₂ O. Stériliser en filtrant. Aliquotez et rangez la solution de D-glucose à 4 ° C pendant un maximum d'un mois.
7. Préparer le solde de stock de cytosine β-D-Arabinofuranoside (Ara-C)En ajoutant 0,24 g d'Ara-C à 10 ml de ddH ₂ O. Stérilisez par filtrage. Aliquoter et stocker la solution mère Ara-C à 4 ° C pendant plusieurs mois.
8. Préparez 250 ml de milieu de culture (pour 25 à 30 chiots) en utilisant 25 mL de sérum bovin fœtal (FBS), 2,5 mL de glutamine 100x, 2,78 ml de solution de KCl 2 M et 2,5 ml d'antibiotiques 100 fois dans l'aigle moyen basal (BME) . Réglez le volume à 250 mL et stérilisez en filtrant.
9. Préparer un milieu 25K en utilisant 2,5 mL de glutamine 100x, 2,78 ml de solution de KCl 2M et 2,5 mL d'antibiotiques 100x dans BME. Réglez le volume à 250 mL et stérilisez en filtrant.
10. Préparez un milieu 5K en utilisant 2,5 mL de glutamine 100x et 2,5 mL d'antibiotiques 100X dans BME. Réglez le volume à 250 mL et stérilisez en filtrant.
    REMARQUE: Le milieu de culture, le milieu 25K et le milieu 5K doivent être préparés à la fraicheuse
11. Préparer la solution mère de la FDA en ajoutant 5 mg de FDA à 1 ml d'acétone. Conservez la solution stock FDA à 4 ° C pour un stockage à long terme.
12. Préparer la solution mère PI en ajoutant 1 mg de PI à 1 ml de ddH ₂ O. Conserver la solution mère PI à 4 ° C pendant plusieurs mois.
13. Préparer la solution mère Hoechst en ajoutant 5 mg de Hoechst 33342 à 1 ml de ddH ₂ O. Conserver la solution mère Hoechst à 4 ° C pendant plusieurs mois.

2. Préparation des solutions de dissection

REMARQUE: faites ceci 1 jour avant la dissection.

1. Préparer la solution de dissection en ajoutant 15 ml de tampon de Krebs, 1,2 ml de solution de 3,82% de Mg ₂ SO ₄ et 0,45 g d'albumine de sérum bovin (BSA) à 150 ml de ddH ₂ O. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH.
2. Étiquetez les tubes 5 x 50 mL comme suit: 1, 2, 3, 4 et 5.
3. Placer 40 ml de solution de dissection dans une seringue de 50 ml avec un filtre. Filtrer 30 ml d'une solution de dissection dans le tube 1 et 2 mL à plusieurs plats de culture cellulaire de 35 mm, qui seront utilisés pour traiter les tissus.
4. À tUbe 2, ajouter 12,5 mg de trypsine dans 50 ml de solution de dissection. Mélanger complètement en vortexing. Stérilisez en filtrant.
5. Au tube 3, ajouter 1,2 mg de DNAse I, 7,8 mg d'inhibiteur de trypsine de soja et 150 μL de solution de 3,82% de Mg ₂ SO ₄ dans 15 ml de solution de dissection. Mélanger complètement en vortexing. Stérilisez en filtrant.
6. Au tube 4, ajouter 5 ml de la solution du tube 3. Ajouter 10,5 ml de solution de dissection. Stérilisez en filtrant.
7. Au tube 5, ajouter 100 μL de solution de 3,82% de Mg ₂ SO ₄ et 15 μL de solution de CaCl _{2 à} 1,2% dans 12,5 ml de solution de dissection. Mélanger complètement en vortexing. Stérilisez en filtrant.
8. Conservez tous les tubes à 4 ° C avant utilisation.

3. Revêtement des plaques de culture cellulaire

REMARQUE: faites ceci 1 jour avant la dissection.

1. Ajouter 1 mL de solution mère PLL à 100 mL de ddH ₂ O (concentration finale: 5 μg / mL). Manteau en plastiqueDes plaques de culture cellulaire à 6 puits ou à 12 puits (2 ml par puits pour des plaques de culture cellulaire à 6 puits ou 1 ml par puits pour des plaques de culture cellulaire à 12 puits) en ajoutant 5 ug / ml de solution de poly-L-lysine.
2. Incuber à température ambiante pendant 1 jour (ou à 37 ° C pendant 2 h). 1-2 heures avant la dissection, retirer la solution à l'aide d'une pipette. Laver une fois avec ddH ₂ O et sécher dans le capot de culture cellulaire.

4. Traitement des tissus pour les rats Sprague-Dawley de 8 jours.

1. Mettez un plat de 100 mm sur de la glace. Décapiter les chiots de rat dans le plat en utilisant une paire de ciseaux stérilisés.
2. Insérez les ciseaux dans le foramen magnum et coupez les deux côtés du crâne, des oreilles aux yeux. Soulevez le crâne à l'aide d'une pince. Assurez-vous que tout le cerveau est dans le crâne. Isoler le cervelet et le mettre dans le plat de 35 mm précité à l'aide d'une pince.
3. Travailler sous un microscope à dissection. Retirer les méninges et les vaisseaux sanguins avec deux paires de pince.
4. Coupez les tissus avec une lame. Mettez les tissus dans le tube 1. Centrifugez pendant 5 min à la RT et 1 500 x g.
5. Aspirer le surnageant. Sauver la pastille.
6. Ajouter la solution dans le tube 2 à la pastille. Ressusciter en secouant doucement.
7. Placer le tube dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Secouez doucement toutes les 3 min.
8. Ajouter la solution dans le tube 4 à cette solution. Agiter et centrifuger pendant 5 min à la RT et 1 500 x g.
9. Aspirer le surnageant. Sauver la pastille.
10. Ajouter la solution dans le tube 3 pour remettre en suspension la pastille.
11. Préparez deux tubes de 15 mL. Placez la moitié des cellules dans chaque tube. Pipeter vers le haut et vers le bas 60-70x à l'aide d'une pipette Pasteur tamponnée de coton pour homogénéiser les cellules.
12. Ajouter 3 ml de la solution dans le tube 5 à chaque tube de 15 ml. Laissez-les reposer à la température ambiante pendant 10 min, puis retirez soigneusement le surnageant avec une pipette Pasteur en coton. Placer le surnageant dans de nouveaux tubes de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à la RT et 1,500 x g.
13. UNESpirate le surnageant. Sauver la pastille.
14. Ajouter un milieu de culture dans la pastille pour obtenir une densité cellulaire d'environ 1,5 x 10 ⁶ cellules / mL (environ 100 mL pour 10 chiots).
15. Mettre les cellules dans des plaques de culture et les cultiver dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO ₂ .

5. Ajout de Ara-C et D-glucose pendant la culture

1. Après 24 h, ajouter une solution mère Ara-C (10 μl / puits pour les plaques de culture cellulaire à 12 puits ou 20 μL / puits pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits, concentration finale: 1 mM) pour inhiber la croissance des cellules gliales.
2. Le jour 7, ajouter 50 μL de solution mère de D-glucose par puits pour des plaques de culture cellulaire à 12 puits ou 100 μL par puits pour des plaques de culture cellulaire à 6 puits de sorte que la concentration finale soit de 1 mM.

6. La coloration double FDA-PI et la coloration triple FDA-PI-Hoechst dans la culture CGN

1. Préparer la solution de travail FDA-PI en ajoutant 20 μL de solution mère FDA (Concentration finale: 10 μg / mL) et 50 μL de solution mère PI (concentration finale: 50 μg / mL) dans 10 ml de PBS. Mélangez en vortexing et placez-le sur la glace.
   1. Pour la solution de travail FDA-PI-Hoechst, ajoutez 20 μL de solution mère FDA (concentration finale: 10 μg / mL), 50 μL de solution mère PI (concentration finale: 50 μg / mL) et 10 μL de solution stock Hoechst (Concentration finale: 5 μg / mL) dans 10 ml de PBS. Mélangez en vortexing et placez-le sur la glace.
      REMARQUE: Préparez délicatement la solution de travail FDA-PI et la solution de travail FDA-PI-Hoechst juste avant l'utilisation.
2. Retirez la plaque de culture cellulaire de l'incubateur. Mettez-le sur la glace.
3. Aspirer le milieu de culture et le remplacer par du PBS froid.
   REMARQUE: Le changement de solution doit être effectué lentement et soigneusement. Évitez de toucher les cellules avec des pointes de pipettes.
4. Aspirer le PBS froid et le remplacer par une solution froide FDA-PI ou FDA-PI-Hoechst (500 μL / nousLl pour les plaques de culture cellulaire à 12 puits ou 1 mL / puits pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits). Quitter sur la glace pendant 5 min.
5. Aspirer la solution de travail FDA-PI ou FDA-PI-Hoechst et ajouter du PBS froid (100 μL / puits pour les plaques de culture cellulaire à 12 puits ou 50 μL / puits pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits).
   REMARQUE: les cellules ne doivent pas être séchées lors de l'utilisation d'images.
6. Prenez des images en utilisant une microscopie fluorescente. Utilisez un filtre d'excitation avec une bande passante de 450 à 490 nm. Détecter les émissions de fluorescence pour FDA, PI et Hoechst à 520, 620 et 460 nm, respectivement. Dans les mêmes conditions, prenez une image sous une lumière normale en utilisant le mode de contraste de phase de la microscopie fluorescente.
   REMARQUE: Prenez des images dans les 15 minutes suivant la coloration FDA-PI ou FDA-PI-Hoechst. Le temps d'exposition est de 100 à 300 ms et le gain analogique est de 2,8x.

7. Évaluation de la viabilité neuronale

1. Pour la double coloration FDA-PI, recouvrez les images des cellules détectées après le filtragePar différents filtres de fluorescence en faisant glisser la couche positive de la FDA sur la couche PI-positive dans un logiciel d'éditeur graphique.
   1. Réglez l'opacité de la couche positive de la FDA en entrant "50%" dans le champ "Opacité" du panneau "Calques". Fusionnez deux couches en cliquant sur le bouton "Fusionner Visible" dans le menu "Layer". Réglez le contraste des images superposées en entrant "50" dans le champ "Contraste" sous "Image" | "Ajustement" | "Le contraste de luminosité." Assurez-vous qu'il n'y a pas de cellule double-positive FDA et PI dans les images superposées.
2. Pour la coloration triple FDA-PI-Hoechst, recouvrez les images des cellules détectées après avoir filtré différents filtres fluorescents en faisant glisser la couche positive de la FDA sur la couche PI-positive dans un logiciel d'éditeur graphique. Ajustez l'opacité de la couche positive de la FDA en entrant "50%" dans le champ "Opacité" des "Calques & #34; panneau.
   1. Fusionnez deux couches en cliquant sur le bouton "Fusionner Visible" dans le menu "Layer". Faites glisser la couche positive Hoechst sur le calque fusionné. Réglez l'opacité de la couche positif Hoechst en entrant "50%" dans le champ "Opacité" du panneau "Calques". Fusionnez les deux couches en cliquant sur le bouton "Fusionner Visible" dans le menu "Couche".
3. Distinguer visuellement les grandes cellules gliales irrégulières des CGN en comparant les images prises sous le mode fluorescent avec celles prises en mode de contraste de phase - les cellules ayant des diamètres trois fois plus grandes que les CGN sont considérées comme des cellules gliales et devraient être exclues.
4. Comptez le nombre de neurones viables et de neurones morts, respectivement, en utilisant un plugin de compteur de cellules dans un programme de traitement d'image ( p. Ex., ImageJ) ⁴ .
   1. Pour la double coloration FDA-PI, marque manuellement les petites cellules positives à la FDANeurones viables. Marquer manuellement les cellules PI-positives comme neurones morts. Pour la coloration triple FDA-PI-Hoechst, marquer manuellement les petites cellules positives FDA et Hoechst comme neurones viables. Marquer manuellement les cellules PI-et Hoechst-double-positives comme neurones morts.
5. Calculer le pourcentage de viabilité neuronale en utilisant l'équation suivante:% de viabilité neuronale = [nombre de neurones viables / (nombre de neurones morts + nombre de neurones viables)] x 100%. Pour chaque puits, choisissez cinq champs aléatoires et moyennez le pourcentage de viabilité neuronale.

Résultats

La double immunocoloration de GAP43 (rouge) et GFAP (vert) a été utilisée pour analyser la forme des neurones et des cellules gliales, respectivement ^{2 , 5} . Les neurones et les cellules gliales sont présents dans la culture CGN. Les cellules gliales positives au GFAP sont grandes et de forme irrégulière, comme le montrent les flèches dans les images ( figure 1 ). Les tests traditionnels pour la vitalité ...

Discussion

Ce protocole a été modifié à partir de procédures décrites précédemment ^{6 , 7} . Les chercheurs ont passé du temps à essayer de réduire la croissance des cellules non neuronales en améliorant les conditions lors de la culture des neurones primaires in vitro ⁸ . Cependant, même avec des conditions de culture améliorées, certaines cellules gliales restent. De plus, des cellules non neuronales sont nécessaires dans le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100x glutamine	Gibco	25030081
100x antibiotics	Gibco	15240062
Basal Medium Eagle (BME)	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate (FDA)	Sigma	F7378
Propidium Iodide (PI)	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 mL	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 mL	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image processing software	NIH	ImageJ