Profilage Redox cellulaire utilisant une microscopie haute teneur

Résumé

Cet article présente un flux de travail de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, ainsi que le potentiel de la membrane mitochondriale et la morphologie - communément appelée morphofonction mitochondriale - dans les cellules adhérentes vivantes en utilisant les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules 5- (et- 6) -chlorométhyl-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescéine diacétate, ester acétylique (CM-H2RFDA) et tétraméthylrhodamine méthylester (TMRM).

Résumé

Les espèces réactives d'oxygène (ROS) régulent les processus cellulaires essentiels, y compris l'expression des gènes, la migration, la différenciation et la prolifération. Cependant, les niveaux excessifs de ROS induisent un état de stress oxydatif, qui s'accompagne de dommages oxydatifs irréversibles à l'ADN, aux lipides et aux protéines. Ainsi, la quantification de ROS fournit une procuration directe pour l'état de santé cellulaire. Étant donné que les mitochondries sont parmi les principales sources et cibles cellulaires des ROS, l'analyse conjointe de la fonction mitochondriale et de la production de ROS dans les mêmes cellules est cruciale pour mieux comprendre l'interconnexion dans les pathologies physiopathologiques. Par conséquent, une stratégie basée sur la microscopie à haut contenu a été développée pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, du potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨ _m ) et de la morphologie mitochondriale. Il est basé sur la microscopie de fluorescence automatisée à large champ et l'analyse d'image de cellules adhérentes vivantes, cultivées dans des plaques multi-puits, et StaineD avec les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules CM-H ₂ DCFDA (ROS) et TMRM (ΔΨ _m et la morphologie mitochondriale). Contrairement à la fluorimétrie ou à la cytométrie en flux, cette stratégie permet de quantifier les paramètres subcellulaires au niveau de la cellule individuelle avec une résolution spatiotemporelle élevée, avant et après la stimulation expérimentale. Fait important, la nature basée sur l'image de la méthode permet d'extraire des paramètres morphologiques en plus des intensités de signal. Le jeu de caractéristiques combinées est utilisé pour l'analyse de données multivariées exploratoire et statistique pour détecter les différences entre les sous-populations, les types de cellules et / ou les traitements. Ici, une description détaillée de l'analyse est fournie, ainsi qu'un exemple d'expérience qui prouve son potentiel de discrimination sans équivoque entre les états cellulaires après une perturbation chimique.

Introduction

La concentration de ROS intracellulaire est méticuleusement régulée par un jeu dynamique entre les systèmes ROS produisant et ROS désactivant. Le déséquilibre entre les deux provoque un état de stress oxydatif. Parmi les principales sources de ROS sont les mitochondries ¹ . Compte tenu de leur rôle dans la respiration cellulaire, ils sont responsables de la majeure partie des molécules intracellulaires de superoxyde (O ₂ ^{• -} ) ² . Cela résulte principalement de la fuite d'électrons vers O ₂ au complexe 1 de la chaîne de transport d'électrons dans des conditions de potentiel de membrane mitochondrial interne négatif fort (Δψ _m ), c'est-à-dire l' hyperpolarisation mitochondriale. D'autre part, la dépolarisation mitochondriale a également été corrélée avec une augmentation de la production de ROS indiquant de multiples modes d'action ^{3 , 4 , 5 ,}> 6 ^{, 7 , 8} . En outre, grâce à des modifications rédox dans les protéines de la machine de fusion de fission, les ROS co-régulent la morphologie mitochondriale ^9. Par exemple, la fragmentation est corrélée avec l'augmentation de la production de ROS et l'apoptose ^{10 , 11} , alors que les mitochondries filamenteuses ont été liées à la famine et la protection des nutriments contre Mitophagie ¹² . Compte tenu de la relation complexe entre les ROS cellulaires et la morphofonction mitochondriale, les deux devraient idéalement être quantifiés simultanément dans les cellules vivantes. Pour ce faire, un test d'imagerie à contenu élevé a été développé sur la base d'une microscopie à large champ automatisée et d'une analyse d'image de cultures de cellules adhérentes colorées avec les sondes fluorescentes CM-H ₂ DCFDA (ROS) et TMRM (mitochondrial Δψ _m et morphologie). L'imagerie à contenu élevé se réfère à l'extraction de spDes informations sur les phénotypes cellulaires à l'aide de multiples marqueurs complémentaires et des analyses d'images automatisées (notamment un grand nombre d'éléments descriptifs). Lorsqu'ils sont combinés avec un microscope automatisé, de nombreux échantillons peuvent être criblés en parallèle ( c.- à-d. Débit élevé), ce qui augmente la puissance statistique du dosage. En effet, un atout principal du protocole est qu'il permet une quantification simultanée de plusieurs paramètres dans la même cellule, et ceci pour un grand nombre de cellules et de conditions.

Le protocole est divisé en 8 parties (décrites en détail dans le protocole ci-dessous): 1) ensemencement de cellules dans une plaque à 96 puits; 2) Préparation de solutions stock, solutions de travail et tampon d'imagerie; 3) Mise en place du microscope; 4) Chargement des cellules avec CM-H ₂ DCFDA et TMRM; 5) Première image en direct pour mesurer les niveaux de ROS basaux et la morphofonction mitochondriale; 6) Deuxième cycle d'imagerie en direct après addition de tert -butylePeroxyde (TBHP) pour mesurer les niveaux de ROS induits; 7) Analyse d'image automatisée; 8) Analyse des données, contrôle de la qualité et visualisation.

Le test a été développé à l'origine pour les fibroblastes cutanés humains normaux (NHDF). Étant donné que ces cellules sont grandes et plates, elles sont bien adaptées pour évaluer la morphologie mitochondriale dans les images 2D widefield ^{13 , 14} . Cependant, avec des modifications mineures, cette méthode s'applique à d'autres types de cellules adhérentes. De plus, à côté de la combinaison de CM-H ₂ DCFDA et TMRM, le flux de travail est conforme à une variété de paires de colorants fluorescents avec différentes spécificités moléculaires ^{1 , 15} .

Protocole

Le protocole ci-dessous est décrit comme étant effectué pour les cellules NHDF et avec l'utilisation des plaques multi-puits spécifiées dans le fichier de matériaux. Voir la figure 1 pour une vue d'ensemble du flux de travail.

1. Préparation des réactifs

1. Préparez le moyen complet en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% v / v de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 UI / mL de pénicilline et 100 UI / ml de streptomycine (PS). Pour 500 ml de milieu complet, ajouter 50 mL de FBS et 5 mL de PS à 445 mL de DMEM.
2. Préparer le tampon d'imagerie HBSS-HEPES (HH) en complétant la solution salée équilibrée de Hank (avec du magnésium et du calcium, mais sans rouge phénol) avec HEPES 20 mM. Pour 500 ml de HH, ajouter 10 mL de solution mère HEPES 1M à 490 mL de HBSS. Vérifier le pH et, le cas échéant, ajuster à pH 7,2.
3. Préparer une solution stock de DCFDA CM-H _{2 1} en dissolvant 50 pg de poudre lyophilisée CM-H ₂ DCFDA en 86,5 &# 181; L DMSO anhydre. Mélanger en vortexant ou en pipetant vers le haut et vers le bas et faire des aliquotes de 20 μL dans des tubes de microcentrifugation marron. Conserver dans l'obscurité à -20 ° C et utiliser dans 1 semaine. Si stocké sous N _{2, la} durée de conservation de l'antenne peut être augmentée jusqu'à au moins 1 mois.
   1. Préparer une solution mère de TMRM 1 mM en dissolvant 25 mg de poudre de TMRM dans 50 ml de DMSO anhydre. Mélanger en vortexant ou en pipetant vers le haut et vers le bas et faire des aliquotes de 10 μL dans des tubes de microcentrifugation marron. Conserver dans l'obscurité à -20 ° C. Cette solution est stable depuis au moins un an.
4. Préparez une fraction aliquote de stock de peroxyde de tert -butyle (TBHP) (~ 7 M) pour chaque expérience en pipettant directement un volume de la solution mère à 70% (plaque de 10 μL / 96 puits). Gardez cette aliquote à 4 ° C jusqu'à l'utilisation ultérieure.
5. Préparez la solution de traitement des anticorps (AB) en diluant deux anticorps secondaires (Alexa Fluor 488 doigt anti-lapin et CY3 anse anti-lapin) 1000 fois dans 1x HH-buFfer.

2. Mise en place du microscope et du protocole d'acquisition (± 15 min)

REMARQUE: L'acquisition d'image est réalisée avec un microscope à champ large équipé d'un système automatisé et d'un volet, et d'un système autofocus basé sur le matériel utilisant un objectif corrigé par plan aérien 20X (NA = 0.75) et une caméra EM-CCD. Lors de la mise en place de l'analyse pour la première fois, une plaque d'essai contenant des cellules témoins, colorées selon les instructions du protocole, sert à étalonner le stade XY et à optimiser les paramètres d'acquisition. Si les paramètres d'acquisition ont déjà été déterminés, l'étalonnage peut être effectué à l'aide d'une plaque vide.

1. Abaissez l'objectif au niveau de base absolue et étalonne le XY-stage en suivant les instructions du logiciel.
2. Assurez-vous que les cubes de filtre corrects sont installés. Pour visualiser CM-H ₂ DCFDA, utilisez un cube de filtre GFP standard avec un filtre passe-bande d'excitation 472/30 nm, un dichro de coupure de 495 nmIc mirror et un filtre à émission de bande passe 520/35 nm. Pour TMRM, utilisez un cube de filtre pour TRITC avec un filtre d'excitation bande passante de 540/25 nm, un miroir dichroïque de coupure de 565 nm et un filtre à émission de bande passante de 605/55 nm.
3. Créez un protocole d'imagerie en utilisant le logiciel d'acquisition.
   1. Sélectionnez le type correct de plaque multi-puits (fabricant et code) à partir de la liste des plaques disponibles fournies dans le logiciel. Vous pouvez également définir votre propre format de plaque à plusieurs trous à l'aide de la plaque et des dimensions des puits.
   2. Alignez la plaque de puits en fonction des instructions du logiciel, par exemple en définissant deux coins des quatre puits d'angle extérieurs. Cette étape couvre les variations d'orientation de l'appareil photo.
   3. Sélectionnez les puits qui doivent être acquis. Si cette option n'est pas disponible dans le logiciel, utilisez un ensemble de sites XY définis manuellement qui correspondent aux puits sélectionnés.
   4. Optimisez les paramètres d'acquisition (temps d'exposition, intensité de la lampe, gain EM) pourE deux canaux séparément en utilisant la plaque d'essai. Minimiser l'exposition et l'intensité, car la lumière d'excitation de la fluorescence induit des ROS. Mais, assurez-vous que le rapport du signal au fond est d'au moins 2 pour le DCFDA basal CM-H ₂ et 3 pour le TMRM avant le traitement TBHP et qu'il n'y a pas de saturation après le traitement TBHP. Les paramètres d'acquisition dépendent grandement de la configuration de microscopie et du type de cellule utilisé, mais comme référence, les paramètres indicatifs lors de l'utilisation d'une ampoule à halogénures métalliques de 130 W en tant que source de lumière et les cellules NHDF colorées selon les instructions du protocole sont les suivantes: pour CM- H ₂ DCFDA et TMRM, un temps d'exposition de 200 ms et un filtre ND 8 sont utilisés, combinés à un gain EM de 15 (13 MHz, 14 bits) et 4 (27 MHz, 14 bits) respectivement. Une fois optimisé pour une certaine configuration et un type de cellule, cette étape peut être ignorée.
      REMARQUE: il est essentiel que les paramètres d'acquisition restent identiques tout au long du processus d'imagerie. Pour les expériences à grande échelle, multi-jours, lamp staUne garantie régulière de qualité devrait être justifiée.
   5. Définir un protocole d'acquisition, consistant en une acquisition séquentielle lambda (longueur d'onde). Sélectionnez le canal DCFDA CM-H ₂ à acquérir d'abord, afin de minimiser l'exposition à la lumière avant la mesure.
   6. Définissez une boucle bien formée pour acquérir 4 images non chevauchées régulièrement espacées positionnées autour du centre de chaque puits de la sélection du puits en utilisant le protocole d'acquisition défini au 2.3.4. Choisissez l'acquisition de l'image méandre, c'est-à-dire d' abord de gauche à droite, du puits B02 à B11, puis de l'arrière, de droite à gauche, du puits C11 à C02 et ainsi de suite ( Figure 2A ). Cela permet d'économiser du temps par rapport à l'acquisition de l'image de gauche à droite. Si cette option n'est pas disponible dans le logiciel, ajustez l'ensemble personnalisé des emplacements XY créés en 2.3.3 pour prendre ce modèle d'image.
   7. Enregistrez les coordonnées XY des positions d'imagerie ( p. Ex. Dans un fichier xml séparé), afin de faciliter la révisionNg en cas de recalibrage du microscope. Ceci est particulièrement important si la lecture de ce dosage doit être corrélée avec une coloration post-hoc d'immunofluorescence (IF) pour les mêmes cellules.

3 . Cellules de semis dans une plaque à 96 puits (45 à 90 min, en fonction du nombre de lignes cellulaires différentes)

1. Travailler dans un environnement stérile tel qu'un coffre de biosécurité de classe 2 et porter des gants.
2. Décontaminer toutes les surfaces et tous les matériaux en utilisant de l'éthanol à 70% v / v dans de l'eau distillée.
3. Prenez un flacon de culture cellulaire avec une culture cellulaire confluente à 90% de l'incubateur et placez-le dans l'armoire de sécurité biologique.
4. Lavez les cellules deux fois avec PBS 1x.
5. Ajouter la quantité appropriée de solution de trypsine-EDTA à 0,05% sur les cellules, en vous assurant que la surface cellulaire complète est couverte ( p. Ex. , 1 mL pour un flacon T25) et incuber pendant 2 min à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
6. Si toutes les cellules sont détachées (vérifier au microscope ), Ajouter un milieu de culture (DMEM + 10% FBS + 1% de pénicilline-streptomycine, ± 4 mL dans un flacon T25) pour inactiver la solution trypsine-EDTA.
7. Centrifuger pendant 5 min à 300 xg à température ambiante.
8. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de culture. Déterminez la quantité de support pour chaque type de cellule pour obtenir une concentration cellulaire compatible avec le comptage cellulaire. Typiquement, un flacon T25 confluent à 90% de NHDF contient environ 1-1,5 millions de cellules, qui sont remises en suspension dans 3-4 ml de milieu de culture.
9. Comptez les cellules en utilisant une chambre de comptage cellulaire ou un compteur Coulter.
10. Graine de 8 000 à 10 000 cellules dans chacun des 60 puits intérieurs d'une plaque noire de 96 puits avec un mince polystyrène continu ou un fond de verre (noir pour éviter la diffusion et le passage croisé entre les puits adjacents pendant l'imagerie). Lorsque vous utilisez différentes conditions / traitements / lignées cellulaires, répartissez leurs emplacements d'ensemencement de manière homogène sur la plaque de manière à minimiser les effets de la plaque (Fig "> Figure 2A). Les puits extérieurs, à l'exception des puits B01 et A01, ne sont pas utilisés car ils sont plus propices aux effets de bord.
11. Graine de 8 000 à 10 000 cellules dans B01. Ce puits sera utilisé pour le réglage de la mise au point, juste avant l'acquisition de l'image.
12. Remplissez les puits extérieurs vides avec un milieu pour minimiser les gradients (température, humidité, etc. ) entre les puits et l'environnement.
13. Tapez doucement la plaque trois fois avant de la remettre dans l'incubateur pour éviter que les cellules ne poussent dans des taches.
14. Culturez les cellules pendant 24 h, ou jusqu'à un degré de confluence d'env. 70%.
15. Enregistrez les informations de traitement pour l'expérience dans une feuille de calcul appelée "Setup.xlsx". Le fichier doit contenir quatre colonnes et sera utilisé pour lier les traitements avec les puits et les informations d'image lors de l'analyse des données. Les quatre colonnes sont: «Bien», «Numéro de traitement», «Traitement» et «Contrôle» (une rangée par puits). Chaque traitement est coupléAvec un numéro de traitement unique, qui est utilisé lors de la visualisation des données pour déterminer l'ordre des traitements sur l'axe X des parcelles. La colonne de contrôle spécifie le traitement qui fonctionne comme contrôle pour le traitement sur la ligne en cours. Les illustrations d'une disposition expérimentale typique et du fichier d'installation correspondant sont représentées sur la figure 2 .

4. Chargement des cellules avec CM-H ₂ DCFDA et TMRM (± 45 min)

REMARQUE: La manipulation des cellules au jour de l'expérience peut être effectuée dans un environnement stérile (armoire à biosécurité), mais ceci n'est pas obligatoire car les cellules seront rejetées ou fixées directement après l'essai.

1. Chauffer le tampon HH à 37 ° C.
2. Préparer une solution de travail TMRM 20 μM en diluant la solution mère 1 mM 50 fois dans du tampon HH (ajouter 490 μl de tampon HH à 1 aliquote de 10 μL de solution mère TMRM).
3. Préparer une chargeAvec 2 μM CM-H ₂ DCFDA et 100 nM TMRM. À cette fin, diluer la solution mère CM-H2 ₂ mM DCFDA 1 mM 500x et la solution de travail TMRM 20 μM 200x dans du tampon HH.
   1. Généralement, pour 60 puits, préparer 7,5 ml de solution de chargement en ajoutant 15 μL de DCFDA CM-H ₂ et 37,5 μL de solution TMRM à 7447,5 μL de HH.
4. Jeter le milieu de culture des cellules en tournant la plaque à l'envers dans un seul mouvement de fluide.
5. Laver doucement les cellules deux fois avec du tampon HH à l'aide d'une pipette multicanal (100 μL / puits). Jeter le tampon HH entre les étapes de lavage en tournant la plaque à l'envers dans un seul mouvement de fluide.
6. Chargez les cellules avec CM-H ₂ DCFDA et TMRM en ajoutant 100 μL de la solution de chargement à chaque puits, à nouveau en utilisant une pipette multicanaux. Incuber pendant 25 min dans l'obscurité, à température ambiante. N'oubliez pas bien B01.
7. Au cours de ces 25 min, préparez les solutions de travail de l'oxydant TBHP et assurez-vous que le microscope et le matériel d'accessoires sont allumés.
   1. Préparer la solution de travail I: Diluer la solution mère 7M de 70x à 100 mM (10 μL de stock dans 690 μL de tampon HH).
   2. Préparer la solution de travail II: Diluer WS I 100x à 1 mM (10 μL WS I dans 990 μL de tampon HH).
   3. Préparez la solution de travail III: Diluez WS III 25x à 40 μM (pour 60 puits ajoutez 300 μL de WS II dans 7200 μL de tampon HH).
8. Au bout de 25 min, laver encore deux fois les cellules avec 100 uL de tampon HH comme décrit précédemment.
9. Ajouter 100 μL de HH-tampon aux 60 puits intérieurs.

5. Première imagerie en direct Round to Measure Basal ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction (± 15 min)

1. Assurez-vous que le logiciel d'acquisition est opérationnel et que le protocole d'imagerie est chargé.
2. Installez la plaque sur le microscope, allumez le matériel baSed autofocus system et utilisez bien B01 pour ajuster le décalage autofocus à l'aide du canal TMRM. Comme cette procédure induit une augmentation de l'intensité du signal CM-H ₂ DCFDA, ce puits est exclu de l'analyse de l'image en aval.
3. Exécutez le protocole d'imagerie.

6. Deuxième cycle d'imagerie en direct après l'ajout de TBHP pour mesurer les niveaux de ROS induits (± 20 min)

1. Retirez soigneusement la plaque à 96 puits du microscope.
2. Ajouter 100 μL de TBHP WS III (40 μM) à chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal (cela se traduit par une concentration de TBHP de 20 μM dans les puits). Ce composé est utilisé comme témoin interne positif pour la coloration CM-H ₂ DCFDA (le signal devrait augmenter) ainsi qu'un moyen de mesurer les niveaux de ROS induits.
   REMARQUE: H ₂ O ₂ peut également être utilisé à la place de TBHP, mais ce composé est moins stable et donc moins fiable.
3. Attendez au moins 3 minutes pour permettre une réaction complète de TBHP wAvec CM-H ₂ DCFDA.
4. Pendant ce temps, ajouter 100 μL de solution de traitement d'anticorps (1/1000) au puits A01.
5. Monter la plaque sur le microscope et vérifier la mise au point à nouveau avec le bon B01.
6. Acquérir les mêmes positions que dans le premier cycle d'imagerie en utilisant le même protocole d'imagerie.
7. Exportez les ensembles de données acquis dans un seul dossier sous forme de fichiers tiff individuels en utilisant une nomenclature normalisée qui inclut une référence à la plaque, au traitement pré ou post-TBHP, bien, au champ et au canal, séparés par des caractères de soulignement, p.ex. 'P01_Pre_B02_0001_C1' pour la plaque 1, traitement pré-TBHP, bien B02, champ 1 et canal 1. Cette information sera utilisée lors de l'analyse d'image ( p. Ex. Pour sélectionner les paramètres de segmentation appropriés), ainsi que lors de l'analyse des données (pour connecter les données d'analyse Avec les traitements corrects).
8. Acquérir des images de terrain plates pour les deux canaux sur les quatre positions autour du centre du puits A01 en utilisant le protocole d'acquisition. Save thEn tant que fichiers tiff individuels dans le même dossier que les autres images en utilisant la nomenclature standardisée suivante: 'P01_FF_A01_0001_C1' pour la plaque 1, le champ 1 et le canal 1. Assurez-vous que les signaux se situent bien dans la plage dynamique; En cas de saturation, utiliser une concentration plus faible de solution de traitement d'anticorps.
9. Jeter la plaque ou économiser pour un traitement ultérieur.
   REMARQUE: Au lieu d'enlever la plaque du microscope et d'utiliser une pipette multicanaux pour ajouter la solution TBHP, une pipette automatisée peut être installée sur le microscope et reliée au logiciel d'acquisition afin de fonctionner lors de la réception d'un déclencheur. Cela permet d'ajouter TBHP à chaque puits directement après la première acquisition, avant de passer au prochain puits. De cette façon, lorsque le premier cycle d'imagerie est terminé, le second peut commencer tout de suite et tous les puits auront un temps d'incubation égal avec le TBHP.

7. Traitement et analyse d'images (± 30 min parPlaque à 96 puits)

REMARQUE: Tout le traitement d'image est effectué dans FIJI (http://fiji.sc), une version packagée du logiciel gratuit ImageJ. Un script dédié a été écrit pour une analyse automatisée des signaux intracellulaires ROS et mitochondriaux, ainsi que des paramètres morphologiques (RedoxMetrics.ijm, disponible sur demande). Les algorithmes sous-jacents sont décrits dans Sieprath et al. ¹ .

1. Assurez-vous que FIJI est installé et opérationnel.
2. Démarrez FIJI et installez le macro-set (Plugins -> Macros -> Installer ...). Cela impliquera un certain nombre de nouvelles commandes de macro ainsi qu'un ensemble d'outils d'action pour optimiser les paramètres d'analyse, comme le montre la Figure 3A .
3. Ouvrez l'interface de configuration pour définir les paramètres d'analyse en cliquant sur le bouton 'S' ( Figure 3B ).
   1. Sélectionnez le type d'image, le nombre de canaux et le puits utiliséPour l'acquisition d'images plates.
   2. Indiquez quel canal contient des cellules (canal DCFDA CM-H ₂ ) ou une mitochondrie (canal TMRM) et ajustez les paramètres de prétraitement et de segmentation pour chaque canal en fonction de la qualité de l'image ( Figure 3B ). Cochez les cases '' Arrière-plan '' et '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' '' ' Définir un sigma pour le flou gaussien des cellules et l'amélioration des mitochondries Laplacienne. Sélectionnez un algorithme de seuillage automatique et remplissez les limites d'exclusion de taille (en pixels). Si un seuil fixe est choisi au lieu d'un algorithme de seuillage automatique, remplissez le seuil supérieur.
   3. Testez les paramètres de segmentation sur quelques images sélectionnées des ensembles de données acquises en les ouvrant et en cliquant sur les boutons 'C' ou 'M' dans le menu pour la segmentation cellulaire ou mitochondrie respectivement,Et ajustez les paramètres si nécessaire. Un exemple de résultat est illustré à la Figure 3C .
4. Exécutez l'analyse par lots sur le (s) dossier (s) d'intérêt en cliquant sur le bouton '#' et en sélectionnant le dossier avec les images. Par dossier, cela produira un nouveau répertoire "Sortie", contenant des ensembles ROI individuels (fichiers zip) et des fichiers de résultat (.txt) par image. Pour les deux canaux, le fichier de résultats contient des descripteurs morphologiques et d'intensité. Le fichier de résultats de la chaîne DCFDA CM-H ₂ (cellules) contient par descripteur la valeur moyenne pour les ROI combinés à une seule image. Pour le canal TMRM, le fichier de résultats contient par descripteur la valeur de chaque ROI mitochondrial individuellement segmenté.
5. Après l'analyse par lot, vérifiez visuellement la performance de segmentation sur une «pile de vérification», une hyperstack de toutes les images avec leur recouvrement ROI respectif en cliquant sur le bouton «V». De cette façon, des artefacts tels que des sur-/ Undersegmentation, les images hors sujet ou les particules de poussière / fibres dans les images peuvent déjà être repérées rapidement. Une restauration supplémentaire peut être effectuée pendant le contrôle de la qualité des données (cfr. §8).

8. Analyse des données, contrôle qualité (QC) et visualisation

Le traitement et l'analyse des données brutes sont effectués en utilisant le logiciel R freeware statistique (http://www.rproject.org - version 3.3.2) et RStudio (http://www.rstudio.com/ - version 1.0.44). Pour obtenir et visualiser rapidement les résultats, une application Shiny intuitive ¹⁷ (disponible sur demande) a été conçue qui intègre et visualise les données dans les plans de chaleur et les calques, et effectue également des analyses statistiques. En général, le flux de travail se compose de deux étapes consécutives. Tout d'abord, les données sont traitées et inspectées par plaque de 96 puits pour détecter les points de données aberrantes. Deuxièmement, les données organisées de toutes les plaques d'une expérience donnée sont combinées et analysées à l'aide de multi-paramètres non paramétriquesTests variables ¹⁸ et une analyse de composante principale.

1. Assurez-vous que R et RStudio sont installés et opérationnels.
2. Démarrez RStudio.
3. Ouvrez l'application brillante RedoxMetrics et exécutez l'application (choisissez de l'exécuter dans un navigateur externe).
4. Dans la page 'entrée', sélectionnez le répertoire où se trouvent les fichiers de résultats de RedoxMetrics.ijm.
5. Assurez-vous que 'Setup.xlsx' (créé à l'étape 3.15) est également présent dans ce répertoire.
6. Les fichiers de résultats et les informations de configuration sont automatiquement importés, réarrangés et visualisés.
   1. La page 'configuration expérimentale' montre la mise en page de l'expérience. Utilisez cette page pour vérification.
   2. La page suivante, «résultats par plaque», montre les données pour chaque plaque séparément dans une disposition de plaques multi-puits codées par couleur ainsi que dans des boîtiers avec des valeurs aberrantes marquées avec le nom de nom et le numéro d'image. Ce dernier permet une inspection et une identification faciles des points de données aberrantes (valeurs extrêmement élevées ou faibles par rapport aux valeurs moyennes mesurées pour ce traitement spécifique - voir la figure 4 pour un exemple).
      En utilisant cette information, vérifiez les images correspondant aux points aberrants. Si des anomalies sont détectées, elles doivent être retirées de l'analyse. La plupart des anomalies sont causées par une segmentation incorrecte lorsque (partie) de l'image est hors de portée, ou lorsque des particules de poussière fortement fluorescentes perturbent la segmentation adéquate. Les cas extrêmes peuvent déjà être repérés rapidement à l'aide de l'outil de vérification de pile (étape 7.5), mais des occurrences plus subtiles sont découvertes à cette étape. Lorsqu'aucune raison apparente ou technique ne peut être trouvée pour la valeur aberrante, l'image ne doit pas être retirée de l'analyse.
   3. Facultatif: créez une nouvelle feuille de calcul intitulée 'Drop.xlsx' avec une seule colonne appelée 'Drop'. Dans cette colonne, listez les noms de fichier (y compris l'extension ".tif") de toutes les imagesQui doit être supprimé de l'analyse (identifiée à l'étape 7.5 ou à l'étape 8.6.2). Téléchargez ce fichier en utilisant la page 'entrée'.
   4. La page «résultats complet de l'expérience» montre les résultats de toutes les plaques combinées. Si un fichier déroulant a été téléchargé, ce fichier permet de supprimer les points de données spécifiés de l'analyse.
      Pour chaque paramètre individuellement, les données sont normalisées par plaque selon leurs contrôles respectifs. Les données de toutes les plaques sont ensuite combinées, suivies de tests multivariés non paramétriques du paquet nparcomp ¹⁸ . Si seulement 2 traitements sont comparés, deux tests d'échantillons pour le problème non paramétrique de Behrens-Fisher sont effectués. Pour plus de 2 traitements, un test de comparaison multiple non paramétrique basé sur le contraste est utilisé. Les résultats sont visualisés à l'aide de boxplots.
   5. La page «analyse par grappes» montre les résultats d'une analyse de composants principaux (paquetage «stats» de base de PCA-R). Données de 5 paramètres (baLes ROS salifiés et le potentiel de la membrane mitochondriale, la taille et la circularité) sont combinés pour discriminer les différents traitements basés sur un profil rédox sensible. À cette fin, une analyse de composante principale (PCA) est effectuée (paquet Rats 'stats'). Les résultats sont visualisés à l'aide d'un biplot (ggbiplot package - http://github.com/vqv/ggbiplot).
   6. Utilisez la page "télécharger des données" pour télécharger les images de données de backend contenant les données traitées et réarrangées afin qu'elles puissent être réutilisées pour une visualisation plus avancée des données ou des analyses statistiques.
      REMARQUE: les pièges typiques et les solutions potentielles sont listés dans le tableau 1 .

Résultats

L'analyse a été comparée en utilisant plusieurs expériences de contrôle, dont les résultats sont décrits dans Sieprath et al. ¹ . En bref, la réponse de fluorescence de CM-H ₂ DCFDA et TMRM à des changements induits extraterrestre dans ROS intracellulaire et Δψ _m, ont été quantifiés pour déterminer la gamme dynamique. Pour CM-H ₂ DCFDA, le NHDF a montré une augmentation linéaire du signal de fluorescen...

Discussion

Cet article décrit une méthode de microscopie à contenu élevé pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires et de la morphofonction mitochondriale dans le NHDF. Sa performance a été démontrée avec une étude de cas sur le NHDF traité par SQV. Les résultats confirment des preuves antérieures de la littérature dans lesquelles des niveaux accrus de ROS ou un dysfonctionnement mitochondrial ont été observés après le traitement avec des inhibiteurs de la protéase du VIH de type 1, b...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	Nikon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44	Rstudio
R version 3.3.2