Analyse des molécule laser Localisés psoralène adduits

Résumé

Les lasers sont fréquemment utilisés dans les études de la réponse cellulaire aux dommages de l'ADN. Cependant, ils génèrent des lésions dont l'espacement, la fréquence et les collisions avec les fourches de réplication sont rarement caractérisés. Nous décrivons ici une approche qui permet la détermination de ces paramètres avec réticule laser localisé interbrins.

Résumé

L'ADN réponse aux dommages (DDR) a été largement caractérisé en études de cassures double brin (CDB) induit par micro irradiation par faisceau laser dans les cellules vivantes. Le DDR à l'hélice de distorsion modifications de l'ADN covalentes, y compris des reticulations entre brins d'ADN (ICL), ne sont pas aussi bien définie. Nous avons étudié la DDR stimulée par ICL, localisée par photoactivation laser de psoralènes immunotagged, dans les noyaux des cellules vivantes. Afin de répondre à des questions fondamentales sur la distribution de produits d'addition et de rencontres de la fourche de réplication, nous avons combiné la localisation laser avec deux autres technologies. des fibres d'ADN sont souvent utilisés pour afficher la progression des fourches de réplication par immunofluorescence d'analogues nucléosidiques incorporés pendant de courtes impulsions. points Immunoquantum ont été largement utilisés pour l'imagerie seule molécule. Dans la nouvelle approche, les fibres d'ADN de cellules portant ICL localisée au laser sont étalées sur des lames de microscope. Les ICL marqués sont affichés avec des points de immunoquantum et ee distances inter-lésion déterminée. les collisions de la fourche de réplication avec ICL peuvent visualiser et différents modèles de rencontre identifiés et quantifiés.

Introduction

ADN est sous attaque constante des agents exogènes tels que le rayonnement, la lumière ultraviolette, les toxines environnementales, les produits de combustion, etc. De plus, il est également attaqué par des espèces radicalaires endogènes produits par le métabolisme oxydatif. Tous ces éléments ont le potentiel de perturber chimiquement ou physiquement l'intégrité de l' ADN ^1. Perturbations dans le génome peut activer l'ADN réponse Damage (DDR), un recrutement et cascade post traductionnelles avec des centaines, voire des milliers, de protéines et microARN impliqués dans la réparation des lésions, la régulation du cycle cellulaire, l'apoptose, la sénescence et les voies inflammatoires ^2.

La plupart de nos informations sur le DDR proviennent d'études avec DSB. Cela est en grande partie en raison de la disponibilité des technologies pour l' introduction de pauses, y compris les pauses spécifiques de séquence, dans l' ADN génomique dans les cellules vivantes ^3. De plus, le propensity des pauses pour induire des foyers de protéines DDR, qui peuvent être affichés par immunofluorescence, a été très utile pour identifier la cinétique et les exigences des protéines répondant. L' une des technologies clés pour l' étude de la DDR a été présenté par Bonner et ses collègues, qui ont utilisé un faisceau laser pour diriger une bande de DSB dans une « région d'intérêt » (ROI) dans les noyaux des cellules vivantes ^4. En effet, ils ont créé un foyer long dans lequel les protéines de la DDR pourraient être identifiés par immunofluorescence. Cela a été illustré par la démonstration de la bande forte de l'histone H2AX phosphorylée (γ-H2AX) dans les cellules exposées au laser. Depuis lors, l'approche laser a été utilisé dans de nombreuses études de la DDR induites par DSB. Bien que puissant et populaire, et la source d'images dramatiques immunofluorescence, il convient de noter que, dans la plupart des expériences l'intensité du laser est ajustée de manière à produire des résultats observables, sans se soucier de l'identité de la lésion,la densité, ou l'espacement. En effet, il peut être difficile de faire ces estimations. Ainsi , ils sont largement ignorés, malgré la multiplicité des lésions introduites dans l' ADN par des lasers ^5. Cela contribue aux nombreuses contradictions dans la littérature ^6.

Contrairement aux DSB, la plupart des modifications chimiques de l'ADN ne stimulent pas la formation de foyers discrets de protéines DDR. Ceci est important à la lumière de notre compréhension actuelle des fréquences de lésion. Il a été estimé que les cellules humaines en culture subissent moins de 50 DSB par cycle cellulaire, en grande partie formés au cours de la phase S ^{7, 8, 9.} Moins sont formées dans des cellules non proliférantes. Cela contraste avec le nombre de pertes de nucléobases ou des événements de modification, qui sont des dizaines de milliers par cellule / jour ^{1, 10.} Nous savons donc le plusle DDR induite par des événements qui sont relativement rares, et beaucoup moins sur celles qui sont induites par des lésions des effets de distorsion de l'hélice, ce qui, au total, sont beaucoup plus fréquents.

Afin de répondre à des questions sur la réponse cellulaire à covalentes modifications de l'ADN génomique, nous voulions travailler avec un produit d'addition d'ADN de distorsion d'hélice qui avait inhérente l'activité d'induction de DDR. De plus, pour faciliter la conception expérimentale et l'interprétation que nous étions intéressés par une structure dont l'introduction pourrait être contrôlée par rapport au temps et était prête à la visualisation. Par conséquent, nous avons développé une stratégie basée sur psoralène. Les psoralènes sont bien caractérisés intercalants d'ADN favorisant photoactifs 5' TA: AT sites. Contrairement à d'autres agents de reticulation tels que les moutardes d'azote et de la mitomycine C (MMC), ils ne sont pas l'ADN réactif à moins exposé aux UV onde longue (UVA). Les molécules intercalées réagissent avec les bases thymine sur des brins opposés pour produire des reticulations entre brins de distorsion d'hélice (CIST) ^11. Avec le psoralène triméthyl utilisé dans nos expériences la plupart des produits sont ICL, relativement peu monoadducts sont générés (moins de 10%) ¹² et des réticulations entre les bases intrabrin adjacentes sur un brin ne sont pas formés. Parce qu'ils sont des blocs puissants à la réplication et la transcription, psoralène et d'autres agents de réticulation, comme le cis-platine et MMC, sont couramment utilisés en chimiothérapie. Ainsi psoralène permis d'études qui ont suivi l'activation du DDR par une structure de distorsion de l'hélice, et a également fourni un aperçu de la réponse cellulaire à un composé ayant une importance clinique.

Nous avons synthétisé un réactif dans lequel psoralène triméthyl était lié à la digoxigénine (Dig), un stérol végétal ne se trouve pas dans les cellules de mammifères et souvent utilisé comme immunotag. L'exigence de photoactivation permet la localisation par la lumière laser (365 nm) de psoralène CIST en ROI défini dans les noyaux dans des cellules vivantes. Ceux-ci peuvent être affichés par immunofluorescence contre l'étiquette Dig. Réparation de l' ADN et des protéines DDR est apparu dans les bandes de laser localisés ICL ^{13, 14.}

Le DDR activé par les fortes intensités de laser utilisées pour produire des DSB peut être dû à des dommages isolés ou regroupés ^{15, 16.} Par conséquent, la pertinence des résultats de ces expériences à des lésions d'origine naturelle, présente une concentration beaucoup plus basse, est incertain. Pour répondre à des questions similaires sur la fréquence des produits d'addition psoralène et l' espacement dans l' ADN, nous avons profité de la technologie de fibre d'ADN ¹⁷ et des points de immunoquantum. Les points quantiques sont beaucoup plus lumineux que les colorants fluorescents et ne sont pas blanchies par exposition à la lumière. Ainsi , ils sont fréquemment utilisés pour l' imagerie de la molécule unique ^18, une application pour laquelle les colorants fluorescents sont pas suffisamment brillante. fibres d'ADN individuelles peuvent être étirées sur gdiapositives lass et peuvent être affichées par immunofluorescence contre analogues nucléosidiques incorporés au cours incubations avant la récolte des cellules. Nous avons traité les cellules avec Dig-psoralène et le retour sur investissement exposés à une irradiation par micro laser. Les fibres ont été préparées à partir des cellules et des produits d'addition individuels Dig-psoralène peut être visualisée avec les points de immunoquantum. Exposer les cellules à des analogues nucléosidiques pendant des durées relativement courtes (20-60 min) permet l'affichage des voies de réplication dans le voisinage de la CIST localisée au laser.

Protocole

1. Préparation de Dig-TMP

1. Mélanger 50 mg (0,18 mmoles) de 4'-chlorométhyl-4,5' , 8-triméthylpsoralène et 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amine dans 25 ml rond sec flacon -bottom sous azote. Ajouter 10 ml de toluène et reflux pendant 12 h. Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite.
   1. Purifier le résidu par Chromatographie sur colonne éclair sur gel de silice. Eluer la colonne avec du chloroforme, de methanol, et 28% de solution d'ammoniac (9: 1: 0,5). Evaporer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite, et récupérer le pur 4 « - [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminométhyl-4,5 », 8-triméthylpsoralène comme visqueuse jaune pâle liquide.
   2. Mélanger 5,5 mg (0,012 mmoles) de 4 '- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminométhyl-4,5', 8-triméthylpsoralène avec 5 mg (0,008 mmoles) d'ester NHS dans la digoxigénine un ballon à fond rond sec sous azote. Ajouter 0,5 mL anhydre de diméthylformamide (DMF) und 3,4 ul de triméthylamine et on agite à 50 ° C pendant 18 h.
   3. Retirer le solvant dans un évaporateur rotatif sous pression réduite.
   4. Dissoudre le résidu dans une quantité minimale de dichlorométhane. Appliquer la solution dans les points 2 pl horizontalement à travers le fond d'une plaque preparative sur couche mince de gel de silice comme phase stationnaire. Exécuter le CCM preparative dans du chloroforme: methanol: 28% d'hydroxyde d'ammonium (8: 1: 0,1).
   5. Masque la plaque à l'exception des bords verticaux et d'identifier la bande de produit avec une lampe UV à courte longueur d'onde de 254 nm. Racler le produit à partir de la plaque avec une spatule et d'isoler le produit pur en utilisant du chloroforme: methanol mélange: 28% d'hydroxyde d'ammonium (0,1 8: 1).
   6. Éliminer les solvants dans un évaporateur rotatif sous pression réduite. Dissoudre les pastilles résiduelles dans 1 ml de 50% d' EtOH: H ₂ O, distribuer dans des aliquotes de 50 ul dans des tubes de 1,5 ml (~ 20 aliquotes) et sèche dans un évaporateur centrifuge jusqu'à ce que tout le solvant est évaporé (~ 3 h).
   7. Redissoudre chaque aliquote dans 200 ul de 50% d' EtOH: H ₂ O et sèche à nouveau dans un évaporateur centrifuge. Dissoudre de nouveau chaque aliquote dans 200 ul de 50% d' EtOH: H ₂ O, sèche dans un évaporateur centrifuge et pellets conserver à -20 ° C pour le stockage à long terme.
2. Pour l' utilisation, on dissout le culot dans 50 ul de 50% d' EtOH: H ₂ O. Préparer une dilution 1: 100 du Dig-TMP dissous dans H ₂ O et de mesurer la DO à 250 nm. Le coefficient d'extinction de Dig-TMP est 25 000. La solution est stable pendant environ un mois si elles sont conservées à -20 ° C. Vérifier la concentration en mesurant la DO à 250 nm avant chaque utilisation.
   1. Calculer la concentration en stock: Abs x 100 x 10 ^6/25 000 = concentration (en uM). En général, la solution mère est d'environ 3 mM. Il est important d'être dans cette gamme afin de réduire le volume de EtOH ajouté au milieu.

2. Laser Localisés Dig-TMP ICL

1. Pelocalisation laser rform avec un microscope confocal avec un laser à azote SRS (337 nm) pompé à travers une cellule à colorant émettant une ligne de 365 nm et de tir 3 impulsions ns à 10 Hz, avec une puissance de 0,7 nW.
2. Faire une marque verticale sur le côté d'une boîte de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm avec un marqueur. Gratter une croix au centre de la vitre sur la surface de culture avec un stylo de diamant de telle sorte que la bande noire sur le côté de la cuvette se trouve en haut d'un bras de la croix. La croix est marquée sur la surface de croissance du verre pour que les cellules et sera dans le même plan focal.
3. Stériliser la plaque après marquage avec un rinçage de 70% d'EtOH. Sec avant étalement des cellules.
4. Cellules de la plaque (souches de laboratoire standard telles que HeLa ou U2OS) dans des boîtes de culture croix marqué un ou deux jours avant. Cellule doit être en division active et 50-70% confluentes le jour de l'expérience. Incuber 24 h avec 1 uM de 5-chloro-2-désoxyuridine (CldU) à l'ADN de manière uniforme sur les étiquettes.
5. AjouterDig-TMP dans 50% EtOH: H ₂ O dans un milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 20 uM. Porter le milieu à 37 ° C. Changer le milieu sur les cellules et les placer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO ₂₎ pendant 30 minutes pour permettre au Dig-TMP à équilibrer.
6. Bien que les cellules sont en incubation, déterminer les coordonnées x / y du champ de vision dans lequel le laser est actif. Suivre la procédure de calibrage, dans lequel le laser est dirigé par le logiciel pour graver une lame de verre en miroir le long d'une ligne horizontale et diagonale du fabricant. Les deux lignes définissent les limites du champ dans lequel le laser peut frapper une cible.
7. Placer la plaque dans l'enceinte climatique, à 37 ° C avec du _CO2 et de l' humidité contrôlée, sur la platine du microscope et de se concentrer à l'objectif de l' huile 60X sur l'intersection de la croix.
8. Diriger le faisceau laser de 365 nm pour un retour sur investissement, établie par l'investigateur à l'outil de forme dans le logiciel, pour former une bande de 3 &# 181; mx 0,6 um. Le contour de la ROI est placé par le curseur dans les noyaux des cellules situées dans le voisinage immédiat de l'intersection de la croix. Ajuster le plan focal z pour cibler le milieu laser à travers le noyau. Utiliser un laser dans la plage de 350-370 nm. 405 nm lasers ne peuvent pas induire des réticulations ^19.
   NOTE: Nous localiser le retour sur investissement dans des zones en dehors de la nucléoplasmiques nucléoles, qui peut être distingué du nucléoplasme en contraste interférentiel différentiel (DIC) imagerie.
9. Vérifier la mise au point et l' activité du laser en augmentant le réglage de puissance à un niveau suffisant pour effacer une cellule (la cellule assombrir puis disparaître). Ceci est un diagnostic important pour un trajet de lumière sans obstacle pour le laser à travers le microscope, puis à travers la lamelle et dans les cellules.
   1. Baisser le réglage de puissance juste suffisante pour activer le psoralène et l'ICL induite DDR (doit être déterminée de manière empirique pour chaque laser / microroscope combinaison). Utiliser un paramètre de l'intensité du laser (1,7% ici), qui ne déclenche pas la DDR en l'absence de psoralène (suivi par la formation de γ-H2AX).
      NOTE: Ceci est une détermination importante et les paramètres peuvent nécessiter un ajustement si la source laser ou un composant dans le trajet de la lumière est modifiée. Suivez l'accumulation de GFP protéines marquées de réparation telles que XPC ou FAN1, qui sont tous deux recrutés rapidement (en quelques secondes) aux bandes de psoralène laser, mais pas à un retour sur investissement exposé au laser seul. Certaines protéines du DDR apparaissent en quelques secondes, alors que plusieurs minutes peuvent être nécessaires pour d'autres. Il est nécessaire d'effectuer des déterminations de cours de temps pour chaque protéine d'intérêt. Nous notons également que dans les cellules qui ne sont pas exposés au laser, il n'y a pas de bandes de protéines répondant.
10. Après toutes les cellules dans un champ ont été déplacement ciblé la plaque à un nouveau champ, en restant près de l'intersection de la croix.
11. Dans des expériences conçues pour détermine la distribution des distances inter-lésion exposer les cellules au laser à 20-25 champs (4-5 cellules / champ) autour de l'intersection. Afin d'analyser les modèles de réplication dans le voisinage de la CIST localisées incuber les cellules avec 10 pM de 5-iodo-2-désoxyuridine (IDU) après la cuisson au laser.
    NOTE: Le temps d'incubation avec IdU est quelque peu arbitraire. Nous avons utilisé aussi court que 20 minutes et aussi longtemps que 60 minutes (voir ci-dessous). des impulsions plus longues (quelques heures) entraînent souvent dans plusieurs secteurs de réplication coalescents, perdant ainsi l'occasion à l'image des progrès des fourches simples. Dans certains bureaux expériences sont marquées avec CldU pendant 24 h à l'ADN de manière uniforme d'étiquette avant l'exposition au Dig-TMP suivie par marquage d'impulsion des voies de réplication.

3. Récolte de cellules et d'étirement des fibres ADN

1. Retirer la plaque de l'étape, éliminer le milieu et laver avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirer la solution PBS. Déposer une goutte de 10 ul d'une trypsine commerciale/ Solution d'EDTA sur l'intersection de la croix au milieu de la surface du verre.
2. Incuber pendant 3-4 min à température ambiante (RT), puis tirer la solution de trypsine avec les cellules détachées dans l'embout de pipette. Il n'y a pas besoin de neutraliser la trypsine.
3. Placer la goutte de trypsine / EDTA avec les cellules à une extrémité d'une lame de microscope en verre silanisée. Lyser les cellules et libérer l'ADN par addition de 10 pi de solution de SDS à 0,5% et incuber pendant 3-4 min à température ambiante en mélangeant doucement avec le bout de la pipette, permettant à la périphérie de la piscine à sécher.
4. Inclinaison vers le coulisseau 20 ° et laisser le liquide couler le long de la fin. Les fibres d'ADN sont étendues / étirée par les forces hydrodynamiques du liquide en écoulement. Laisser sécher à l'air les diapositives (~ 10 min) et le fixer à 3: 1 méthanol / acide acétique pendant 10 minutes. Retirez les diapositives de la solution de solution et de l'air sec à nouveau. A ce stade, ils peuvent être stockés indéfiniment dans 70% EtOH à -20 ° C. Le retrait de 70% EtOH laisser sécher avant la neétape xt.
5. Laver les lames dans du PBS, et ensuite subir une dénaturation dans du HCl 2,5 M pendant 1 h à TA. Ce traitement depurinates ADN qui rend les nucléobases halogénés incorporés accessible à des anticorps.
6. Neutraliser diapositives 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Laver deux fois dans du PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) pendant 5 minutes chacun.
7. Bloc coulissant avec 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 10% de sérum de chèvre dans du PBS. Couvrir les lames doucement avec un parafilm pour répandre la solution de blocage uniformément sur la lame et incuber pendant 1 h à TA.
8. Pipeter 100 ul de dilution 1: 200 dans une solution de blocage de rat anti-bromodésoxyuridine (détecte spécifiquement CldU) anticorps primaire à chaque diapositive. Couvrir les lames doucement avec un parafilm pour répandre la dilution de façon uniforme sur la lame et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à TA. Retirez le parafilm et laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
9. Pipeter 100 ul de dilution (1: 100) de chèvre anti-rat Alexa Fluor 647 dans le blocage de solution à chaque diapositive. Couvrir leglisse doucement avec un parafilm et incuber pendant 45 min à température ambiante. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
10. Pipeter 100 ul de dilution (1:40) de souris anti-bromodésoxyuridine (LDU détecte et CldU Cette spécificité double nécessite le blocage de CldU par le rat anti BrdU dans l'incubation préalable.) Anticorps primaire et un anticorps de lapin anti-DIG (1: 200 ) dans une solution de blocage à chaque diapositive. Couvrir les lames doucement avec un parafilm et incuber dans une chambre humide pendant 1 h à TA. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
11. Pipeter 100 ul de dilution (1: 100) de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 ANDC (1: 5000) de chèvre anti-lapin de sonde (par exemple, Qdot 655) dans une solution de blocage à chaque diapositive. Couvrir les diapositives doucement avec parafilm et incuber pendant 45 min à température ambiante. Laver les lames trois fois en PBST pendant 5 minutes chacun.
12. Drainer l'excès de PBST sur une serviette en papier. Ajouter 50 ul de milieu de montage antifade sur chaque lame et couvrir avec une lamelle. Image ou magasin pourpas plus de 48 h à -20 ° C.

4. Imagerie fibre par microscopie à fluorescence

1. Effectuer l'acquisition d'image à travers un objectif 63X sur un microscope inversé avec une roue de filtre entièrement motorisé fixé avec FITC, Cy5 et Q détection de point 655. Le filtre d'excitation est de 425 nm, et le filtre d'émission est de 655 nm avec 20 nm centrée sur le pic d'émission ^20.

Résultats

Laser Dig-TMP (figure 1A) localisées ICL peuvent être affichées par immunofluorescence contre le Dig-étiquette liée à la psoralène. Bien que le laser peut être dirigé pour frapper dans une zone de contour quelconque, rayures ne sont pas des formes « naturels » dans les cellules, et les signaux légitimes peuvent être facilement distingués des artefacts dus à une liaison non spécifique par des anticorps primaires ou secondaires. Cette fonction est utile lor...

Discussion

La technologie de localisation laser nécessite l'utilisation de cellules adhérentes avec des noyaux qui sont visibles en microscopie en champ clair. Nous avons essayé de fixer les cellules non adhérentes, telles que les lymphocytes primaires, ou des cellules cultivées faiblement adhérentes telles que AD293, à la surface du verre avec des préparations adhésives des cellules tels que la polylysine ou de collagène, ou des mélanges plus complexes. Bien que ces traitements peuvent lier les cellules à la surfa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107