Un outil à ultrasons pour la Conduction nerveuse bloquer dans les modèles de Rat diabétique

Résumé

Cet ouvrage présente la méthodologie d’application haute échographie axés sur l’intensité pour bloquer les potentiels d’action des nerfs neuropathiques diabétiques.

Résumé

Bloc de conduction du nerf avec un transducteur à ultrasons haute d’axés sur l’intensité (HIFU) a été réalisée récemment dans des modèles animaux normaux et diabétiques. HIFU peut bloquer réversible de la conduction des nerfs périphériques sans endommager les nerfs tout en utilisant un paramètre approprié à ultrasons. Bloc temporaire et partiel des potentiels d’action des nerfs montre que HIFU a le potentiel pour être un traitement clinique utile pour soulager la douleur. Ce travail démontre les procédures permettant de supprimer les potentiels d’action des nerfs neuropathiques dans les rats diabétiques in vivo à l’aide d’un transducteur HIFU. La première étape consiste à générer des rats mâles adultes de neuropathiques diabétiques par injection de streptozotocine (STZ). La deuxième étape consiste à évaluer la neuropathie périphérique diabétique chez les rats rendus diabétiques par STZ par une sonde électronique de von Frey et une plaque chauffante. L’étape finale consiste à enregistrer en vivo extracellulaire potentiels d’action du nerf exposés à sonication HIFU. La méthode a montré ici peut-être bénéficier de l’étude des applications analgésique d’ultrasons.

Introduction

Médicaments par voie orale, l’acupuncture¹, et de la stimulation nerveuse électrique² ont été utilisés pour le traitement de polyneuropathie diabétique douloureuse. Cependant, les effets secondaires des médicaments par voie orale, opération invasive de l’acupuncture et la stimulation électrique des nerfs entravent l’efficacité thérapeutique et l’adhérence du patient. Bloc d’échographie des nerfs périphériques dans des modèles animaux a été étudiée pendant des décennies,^3,4,5. La conduction de in vitro de nerfs sciatiques de la grande grenouille verte est inhibée de façon réversible après le traitement de 10 à 20 pulsations de l’exposition aux ultrasons pour 0,4 - 1,0 s⁶. Un facteur de bloquer la conduction nerveuse est l’élévation de température induite par ultrasons⁷. Pour les patients avec polyneuropathie, la suppression des potentiels d’action composé de muscle (CMAPs) a été effectuée dans le nerf péronier exposé à des ultrasons de faible intensité pour 2 min⁸. Le temps de récupération complète était moins de 5 min.

Récemment, l’alimentation et la Drug Administration des États-Unis a approuvé HIFU comme un traitement non invasif des fibromes utérins⁹, palliations des douleurs des os métastases¹⁰et¹¹de la cancer de la prostate. Un transducteur HIFU émet des faisceaux acoustiques en dehors du corps, et les poutres transmettront dans divers milieux de tissu et convergent vers la tumeur cible au foyer. La zone focale est immédiatement formée pour générer des effets localisés sur les tumeurs de cible sans endommager les tissus environnants. HIFU a également été appliquée pour inhiber la conduction nerveuse ou provoquer une dénervation du nerf dans des expériences in vivo de normale de rats Sprague-Dawley (SD)¹². En outre, les effets à court et à long terme de HIFU neuropathique nerfs ont été étudiés¹³. Les résultats précédents ont montré que le bloc permanent ou réversible de la conduction nerveuse sensorielle pourrait être atteint par HIFU avec les paramètres appropriés. Outre les applications analgésiques, HIFU peut-être servir comme un outil pour étudier la contribution relative des composants centraux et périphériques au blocage de la conduction nerveuse pour la recherche fondamentale de la neurologie et le développement de médicaments contre la douleur. Donc, il faut une HIFU blocage plate-forme technologique spécifique des nerfs périphériques dans des modèles animaux. Le but de cet article est de démontrer les procédures pour partiellement ou complètement bloquer les potentiels d’action des nerfs périphériques chez les rats diabétiques neuropathiques par HIFU. Modèles de rat diabétique et l’évaluation des symptômes neuropathiques périphériques ont été mis en place. Une plate-forme HIFU et processus expérimentaux spécifiques pour traiter les nerfs sciatiques rat sont présentés.

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Protocole

the Institutional Animal Care et utilisation Comité des instituts nationaux de recherche santé de Taïwan a approuvé tous les protocoles animales.

1. induction de modèle diabétique en mâles adultes Sprague - Dawley (SD) Rats

1. boulettes rat Retirez la cage à rats SD rapide mâles (300-350 g) pendant 6 h avant l’induction de STZ.
Tampon
2. Prepare citrate de sodium (0,1 M, pH 4,5).
   1. Monohydrate de dissoudre 1,05 g d’acide citrique (C ₆ H ₈ O ₇ · H ₂ O ; mol en poids 210.14) dans 50 mL d’eau pour faire une solution d’acide citrique 0,1 M distillée.
   2. Dissoudre 1,47 g citrate trisodique dihydraté (C ₈ H ₅ O ₇ Na ₃ · 2 H ₂ O ; mol en poids 294.12) dans 50 mL d’eau pour faire une solution de citrate de sodium 0,1 M distillée.
   3. Ajouter 25 mL de solution de l’acide citrique à 25 mL de solution de citrate de sodium. Surveiller le pH de tampon citrate de sodium (pH 4,5) en utilisant un testeur de pH.
      Remarque : La mémoire tampon est fait isotonique par addition d’un volume approprié de solution de citrate de sodium 0,1 M.
3. STZ dissoudre dans un tampon citrate de sodium 0,1 M à céder un 50 mg/mL solution STZ.
   Remarque : La solution STZ est sensible à la lumière, par conséquent, couvrir la solution STZ avec du papier aluminium et utiliser dans 15-20 min.
4. Dessiner la solution STZ de 50 mg/kg dans une seringue d’insuline ou de tuberculine 1 mL avec aiguille de calibre 26 à 28. nettoyer le site d’injection avec un tampon à l’éthanol et par voie intrapéritonéale injecter la solution STZ dans le quadrant inférieur droit de l’abdomen pour éviter d’endommager organes abdominaux.
5. Fournir des rats avec de l’eau de 10 % de sucrose comme source unique de l’eau pendant 48 h après l’injection de STZ pour prévenir l’hypoglycémie.

2. confirmation du diabète chez les Rats par STZ

1. surveiller la concentration de glucose plasmatique jeûne de tous les rats injectés par STZ après 72 h avec un lecteur de glycémie.
   1. Rapide des rats rendus diabétiques par STZ pendant 15 h avant de mesurer le jeûne sang glycémie.
   2. Empêcher les rats dans un sac de retenue et d’exposer les queues pour la collecte de sang pendant les mesures glycémiques.
   3. Utilisez une lancette de sang pour piquer la pointe de la queue pour obtenir une petite goutte de sang. Placez la goutte de sang sur une bandelette de test de glycémie. Enregistrer la glycémie à jeun.
      Remarque : Le lecteur de glycémie détecte et affiche le niveau de glucose sanguin en unités de mg/dL. Exclure les rats à jeun de la glycémie inférieure à 150 mg/dL après 2 semaines de STZ-induction.

3. Évaluation de la neuropathie diabétique périphérique chez les Rats diabétiques

1. évaluer l’allodynie mécanique avec électronique von Frey.
   1. Habituer par la STZ rats diabétiques dans une cage sur un plancher de treillis métallique de diamètre 1 cm pendant 30 min avant d’évaluer la biche patte réponse retrait.
   2. Utiliser une sonde électronique de von Frey avec pointe rigide (0,8 mm de diamètre) pour appliquer manuellement une pression sur la surface plantaire de la patte arrière des rats et augmenter progressivement la pression jusqu'à ce qu’on voit une réaction de retrait patte.
   3. Enregistrer la pression qui indique sur le système et recommencez la mesure 5 fois par rat, avec un intervalle de 30 s entre chaque mesure.
2. Évaluer l’hyperalgésie thermique avec une plaque chauffante.
   1. S’habituer les rats rendus diabétiques par STZ sur la plaque chauffante (24 ± 0,5 ° C) pendant 10 min avant d’évaluer la réponse de douleur.
   2. Enlever et remettre les rats dans leurs cages après accoutumance, faire chauffer la plaque chauffante et maintenir la plaque de cuisson ' s température à 55 ± 0,5 ° C.
   3. Placer le rat sur la plaque de cuisson chauffée tout en démarrant simultanément le minuteur.
   4. Lorsque le rat présente des comportements distincts, tels que lécher la biche patte ou anormalement pichenette la hind patte, arrête la minuterie et enregistre le temps de latence retrait.
      Remarque : Si un rat n’exprime pas de comportements distincts après 20 s (temps de coupure 20 s), mettre fin à l’essai de plaque de cuisson et retirez le rat de la plaque chauffante.

4. In Vivo Blocage de la Conduction avec la sonde HIFU de nerf

Remarque : l’expérience in vivo commence sur semaine 5 après injection de STZ de 50 mg/kg.

1. Perform animaux procédures avant que le blocage des CMAPs avec sonication HIFU.
   1. Stériliser les instruments chirurgicaux (bistouri, ciseaux, pinces et verre crochet) dans un autoclave avant la chirurgie.
   2. Anesthésier les rats avec une injection intrapéritonéale de tiletamine/zolazepam mélange (40 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou par inhalation de 1,75 % d’isoflurane via vaporisateur isoflurane. Placez les rats sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle.
   3. Placer les rats pour la chirurgie en décubitus ventral. Appliquer la pommade ophtalmique. Étendez la jambe du rat et pincer la surface plantaire du pied avec vos ongles pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Si les rats montrent des réponses de retrait, appliquer une anesthésie supplémentaire.
   4. Enlever les poils de la cuisse et abaisser l’arrière de rats avec une tondeuse électrique. Appliquer l’iode liquide avec une gaze propre au site chirurgical et déplacer circulairement la gaze à l’extérieur du site chirurgical. Utilisez un tampon d’alcool pour essuyer l’iode liquide avec le même mouvement circulaire. Cette expérience est réalisée sur le site gauche et droite chirurgical. Répétez la procédure à l’autre site chirurgical quand effectuer l’étape suivante de la procédure.
   5. Utiliser un ciseaux chirurgicaux stériles ou scalpel à pratiquer une incision de la peau à la dorsale de la cuisse. Utiliser des ciseaux chirurgicaux émoussés soigneusement séparer les tissus sous la peau et garantir la peau avec peau crochets. fémur peut être vus dans les muscles.
   6. Utiliser les ciseaux pour séparer soigneusement les muscles parallèles au fémur jusqu'à ce que les fibres de nerf sciatique mi-cuisse qui sont incorporés dans les muscles sont visibles. Soigneusement utiliser un crochet de verre pour séparer le nerf sciatique de la mi-cuisse des tissus conjonctifs environnants et muscles.
2. Positionner le nerf sciatique dans la zone focale HIFU à l’aide d’un fixateur de nerf sur mesure ( Figure 1 et Figure 3).
   Remarque : Le fixateur de nerf sur mesure se compose de 3 éléments ( Figure 3). Tous les composants sont faits de transparent polyméthacrylate de méthyle (PMMA). Le filet extérieur de la structure supérieure du composant I est de 2,5 mm de hauteur et M10XP0.7 ( Figure 4 a). Le puits central est un 4,0 mm de diamètre trou grâce à composante je. L’ouverture inférieure du puits est scellé par une feuille de ruban. Le diamètre de la rainure est de 1,2 mm et la distance entre le plan médian de la fente et la surface supérieure du composant I est 3,1 mm. volet II se compose d’un corps principal, quatre pattes et la structure du fond ( Figure 4 b). Le taraudage de la structure du fond est de 2,5 mm de hauteur et M10XP0.7 pour tenir le filet extérieur de composant j’ai. Le diamètre du trou central est la même que la loge centrale du composant j’ai. Les dimensions du corps principal sont de 32 mm de diamètre et 5,4 mm d’épaisseur. Quatre pattes sont déployés symétriquement. Deux pattes courtes identiques sont conçus pour l’alignement et deux longues jambes identiques fonctionnent pour accrocher sur le volet III. Le diamètre extérieur et la hauteur du volet III sont de 41 mm et 9,2 mm. Le taraudage est M36XP1.0 et le trou est de 27,5 mm de diamètre (< forte classe = « xfig »> Figure 4). Le cône est un cône creux avec l’ouverture de 84 mm de diamètre et l’ouverture inférieure de 27,5 mm de diamètre. La hauteur est de 57,5 mm ( Figure 5 a).
   1. Avant l’expérience, faire tremper le fixateur de nerf acrylique sur mesure dans l’eau de Javel-solution pendant 30 à 60 min, suivie par trempage dans l’eau stérile.
   2. À l’aide d’un crochet de verre, soulevez le nerf soigneusement et le mettre dans la fente du composant I.
   3. Composant de vis II à composante I. remplissage central ainsi du composant I sonnerie ' solution s à ultrasons préservation de propagation et du système nerveux.
   4. Vis volet III au cône de logement de l’HIFU. La composante III de quai avec composante II à travers les quatre pieds du volet II.
      Remarque : Le centre géométrique de trois composantes et le capteur sont alignés. La distance entre le nerf et le transducteur est égale à la distance focale, ce qui garantit le nerf à l’intérieur de la zone focale HIFU.
3. Insérez une paire d’aiguilles d’acupuncture dans l’origine du nerf sciatique et l’autre paire dans le muscle gastrocnémien. Connectez chaque paire d’aiguilles au système d’acquisition électrophysiologie grâce à un câble électrique coaxial ( Figure 1).
   Remarque : Sur une des extrémités du câble sont deux pinces crocodiles pour écrêter les deux aiguilles séparément et sur l’autre extrémité du câble est un connecteur BNC pour relier le système. Les paires d’aiguilles d’acupuncture travaillent comme électrodes stimulants le nerf sciatique et les électrodes d’enregistrement dans le muscle gastrocnémien.
   1. Définie la fréquence d’échantillonnage et la bande passante du système d’acquisition de l’électrophysiologie de 50 et 70 Hz à 3 kHz, respectivement. Appliquer un stimulus précité maximale avec une largeur d’impulsion de 0,1 ms aux électrodes stimulants à l’origine du nerf sciatique.
   2. Enregistrer les CMAPs des électrodes enregistrement et amplifier les CMAPs avec l’amplificateur intégré dans le système d’acquisition de l’électrophysiologie.
      Remarque : Utilisez l’amplificateur intégré dans le système d’acquisition électrophysiologie pour amplifier les signaux de nerf et d’enregistrer les CMAPs depuis les électrodes d’enregistrement avec le système d’acquisition de l’électrophysiologie.
4. Utiliser un transducteur HIFU 2,68 MHz commercial afin de supprimer les CMAPs chez les rats diabétiques neuropathiques.
   Remarque : Les spécifications du capteur sont décrites comme suit : un seul élément bol sphérique avec diamètre d’ouverture de 6 cm et la longueur focale de 5 cm et une zone focale ellipsoïde de 4 mm de profondeur et 0. 8 mm de largeur en champ libre.
   1. Plonger le cône sphérique, la sonde HIFU et le cône couvert dans le réservoir rempli d’eau dégazée. Mettre la sonde HIFU dans le cône sphérique et fixer le couvercle du cône à l’ouverture supérieure du cône sphérique par 6 vis à tête ( Figure 5 b). Après que les bulles dans le cône sphérique sont expulsés naturellement en raison de la faible densité de bulles comparé à l’eau, fermer l’ouverture frontal du cône par un ruban épais transparent de 0,03 mm. La composante III de vis sur le cône sphérique.
   2. Sortir la sonde HIFU avec le cône sphérique et le volet III du réservoir d’eau dégazée.
      Remarque : L’eau d’osmose inverse utilisée dans l’étude est de l’eau purifiée par le procédé d’osmose inverse. L’eau par osmose inverse est bouillie pour expulser les gaz. Après refroidissement, l’eau dégazée est obtenue dans une cuve scellée individuelle.
5. Mettre composant j’ai dans l’espace entre le nerf et le muscle avec soin et positionner le nerf à l’écart des étapes d’i. effectuer composant 4.2.3 et 4.2.4 pour s’assurer que le nerf est à l’intérieur de la zone focale de l’HIFU ( Figure 3 < / forte >).
6. Link un générateur de fonction et un amplificateur de puissance de radiofréquence. Connectez l’amplificateur de puissance à la sonde HIFU pour la génération du faisceau HIFU. Définissez manuellement la tension nominale de l’appareil à l’HIFU transducteur via l’amplificateur de puissance. Une fois que le temps d’exposition HIFU est terminé, éteindre manuellement le générateur de fonctions. Observer le temps à l’aide d’une minuterie.
   Remarque : L’intensité et l’énergie du faisceau HIFU utilisée dans cette étude sont 2 810 W/cm ² et 84 J/mm ², respectivement.
7. Livrer en même temps, la stimulation via le système d’acquisition de l’électrophysiologie (étape 4.3) et le faisceau HIFU via système HIFU (étape 4.6) du nerf sciatique alors qu’il enregistrait les CMAPs. Augmentez l’exposition HIFU sur le nerf sciatique de 3 s, 5 s à 8 s jusqu'à ce que la diminution ou l’inhibition de l’amplitude des CMAPs est observée.
   1. Enregistrement des CMAPs une fois par seconde lors de la livraison de l’HIFU faisceau. Après avoir observé la variation de l’amplitude des CMAPs, éteignez le système HIFU et manuellement, cliquez sur l’icône Enregistrer sur le logiciel d’acquisition électrophysiologie à enregistrement CMAPs toutes les 2 min dans le début 10 min, toutes les 5 min dans les 30 minutes consécutives et toutes les 10 min dans la dernière phase de la durée d’enregistrement jusqu'à 2 h.
8. Composant séparé II et III du fixateur nerf ( Figure 3) pour retirer la sonde HIFU provenant du site d’incision. Composant séparé II et j’ai pour libérer le nerf sciatique sécurisé. Suture opératoire du rat diabétique par des sutures de catgut chromique de 4-0 après avoir enregistré les CMAPs. Appliquez iode liquide sur le site chirurgical pour prévenir l’infection.
   1. Placer des cages sur le coussin chauffant et laisser les rats récupérer dans leurs cages avant de les retourner à l’animalerie. Fournir les rats avec l’ibuprofène dans l’eau potable pour 3 jours ou par injection intrapéritonéale de la buprénorphine (0,05 - 0,1 mg/kg).
9. Insérer des électrodes stimulants et d’enregistrement à l’origine du nerf sciatique et les muscles gastrocnémiens de rats anesthésiés de neuropathiques diabétiques comme décrit aux points 4.1.2 et 4.3 7, 14 et 28 jours après la sonication HIFU initiale. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.2.
   1. Placer des cages sur le coussin chauffant et laisser les rats récupérer dans leurs cages avant de déplacer la cage à l’animalerie.
10. Euthanasier les rats après l’expérience. Place le rat dans une chambre de dioxyde de carbone. Attendre environ 5 min pour les rats d’arrêter de respirer. Veiller à ce que le cœur a cessé de battre.

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Résultats

L’étude in vivo a montré que, avec une dose HIFU de sonication de 3 s à une intensité de 2 810 W/cm², les CMAPs ont été supprimées par 20 % du niveau de référence, mais ils ont été complètement récupérés après 30 min (Figure 2 a, diamants) et étaient presque constante dans la période de 28 jours (Figure 2 b, diamants). Pour l’exposition HIFU 5 s à la même intensité, les CMAPs a diminu?...

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Discussion

Suppression partielle et temporaire de l’action potentials des nerfs de rats diabétiques en vivo neuropathiques et présence instantanée de l’effet de blocage après traitement HIFU, que tous deux ont été observés. L’étude complémentaire de 28 jours sur CMAPs a démontré qu’un blocus sécuritaire de la conduction nerveuse pourrait être effectué dans une exposition HIFU appropriée. En conséquence, le protocole précité du traitement HIFU peut fournir une solution alternative pour le bloc rév...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
streptozotocin	Sigma	85882
citric acid monohydrate	Sigma	C1909
trisodium citrate dihydrate	Sigma	W302600
glucose meters	Roche Accu-Check Active	GC
electronic von Frey device	IITC Life Science	2390
hot plate	IITC Life Science
Biopac MP36 acquisition system	Biopac Systems, Inc.
HIFU transducer	Sonic Concepts	H108
function generator	Agilent	33250A
power amplifier	Electronics & Innovation	1040L
Rats	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube vet ointment	Dechra
isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurance	Attane
Restraint bag (Decapicones)	Braintree Scientific	DC 200