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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le but de ce protocole est de démontrer la préparation, la culture, le traitement et l'immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La technique peut être utilisée comme outil de dépistage in vitro dans la recherche auditive.

Résumé

Bien qu'il y ait eu des progrès remarquables dans la recherche de l'ouïe au cours des dernières décennies, il n'y a toujours pas de remède contre la perte d'audition sensorielle (SNHL), une affection qui entraîne généralement une perte ou une perte des structures mécanosensorielles délicates de l'oreille interne. Des essais sophistiqués in vitro et ex vivo ont émergé ces dernières années, ce qui a permis de dépister un nombre croissant de composés potentiellement thérapeutiques tout en minimisant les ressources et en accélérant les efforts pour développer des remèdes pour SNHL. Bien que les cultures homogènes de certains types de cellules continuent à jouer un rôle important dans la recherche actuelle, de nombreux scientifiques s'appuient maintenant sur des cultures organotypiques plus complexes d'oreilles internes murines, également connues sous le nom d'explants cochléaires. La préservation des structures cellulaires organisées à l'intérieur de l'oreille interne facilite l'évaluation in situ de divers composants de l'infrastructure cochléaire, y compris les cellules capillaires interne et externe, les neurones ganglionnaires en spirale, les neuronesItes, et les cellules de soutien. Nous présentons ici la préparation, la culture, le traitement et l'immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La préparation minutieuse de ces explants facilite l'identification des mécanismes qui contribuent au SNHL et constituent un outil précieux pour la communauté de la recherche auditive.

Introduction

La perte auditive sensorielle (SNHL) reflète les dommages causés à l'oreille interne ou à la voie auditive ascendante. Bien que la perte auditive soit le déficit sensoriel le plus fréquent chez les humains 1 , les traitements curatifs n'existent pas encore 2 . Bien que les implants cochléaires ou auditifs du tronc cérébral puissent rétablir un certain degré d'audition chez les patients atteints de SNHL grave à profond, l'audition fournie par ces dispositifs est encore très différente de l'audition "naturelle", en particulier lors des tentatives de compréhension de la parole dans le bruit ou de l'écoute musicale.

Bien que la dégénérescence des cellules capillaires ait longtemps été considérée comme la conséquence principale des événements auditifs traumatiques ( p. Ex., Exposition au bruit élevé), il existe de plus en plus de preuves que les synapses transmettant l'information des cellules capillaires au nerf auditif sont au moins aussi vulnérables aux traumatismes acoustiques 3 , 4 , 5 > , 6 . Étant donné que les seuils audiométriques humains, l'étalon-or actuel pour l'évaluation de la fonction auditive, ne prédisent pas un dommage cellulaire spécifique dans l'oreille interne, des outils plus raffinés sont nécessaires pour détecter la dégénérescence cellulaire dès que possible et pour initier un traitement adéquat 7 .

Des traitements pharmaceutiques prometteurs pour la perte d'audition sont souvent testés sur des cultures cellulaires homogènes in vitro , mais de tels systèmes ne modélisent pas précisément le micro-environnement cochléaire. On sait que les cellules cochléaires sécrètent des facteurs trophiques qui influent sur d'autres types de cellules dans la cochlée 8 , 9 , un processus crucial in vivo qui se perd lorsque l'organe de Corti 10 , 11 ou Spiral Ganglion Neurons (SGN) 12 est cultivé isolément ou lorsque Les marqueurs moléculaires sont analysésLes études in vivo qui peuvent être nécessaires pour la validation des données in vitro pour établir de nouveaux traitements personnalisés pour la perte d'audition dans la poursuite de la «médecine de précision» nécessitent des ressources et des temps importants. Cela est particulièrement important lorsque l'on considère Combien d'effort est nécessaire pour parfaire et effectuer des injections membranaires de l'oreille moyenne ou des fenêtres rondes avec des tests auditifs et la dissection subséquente de la totalité des cochléaires. Le criblage efficace de composés prometteurs dans des cultures organotypiques ex vivo connues sous le nom d'explants cochléaires fournit une alternative économique et fiable 14 , 15 , 16 , 17 .

Cet article décrit un protocole permettant de générer, de maintenir et d'évaluer des explants cochléaires traités. Les applications spécifiques pour ce modèle sont soulignées, y compris son utilisation dans le dépistageDe composés potentiellement thérapeutiques et l'évaluation comparative de vecteurs viraux pour la thérapie génique. Une approche d'explant ex vivo permet aux chercheurs de visualiser les effets d'un traitement donné sur différentes populations cellulaires in situ , en facilitant l'identification des mécanismes spécifiques du type cellulaire et le raffinement ultérieur des thérapies ciblées.

Dans l'ensemble, cette technique fournit un modèle pour étudier la cochlée ex vivo tout en préservant les interférences vitales entre les types de cellules très différents qui coexistent dans la cochlée.

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Protocole

Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) du Massachusetts Eye and Ear. Les expériences ont été réalisées selon le Code de déontologie de l'Association médicale mondiale.

1. Préparation de la dissection

  1. Préparation de la table chirurgicale
    1. Utilisez 70% d'éthanol pour désinfecter la table chirurgicale.
    2. Placez deux plaques de préparation non stériles à côté du microscope.
    3. Préparez le tiroir à instruments, y compris les ciseaux opératoires stérilisés par la chaleur, une poignée de scalpel, un micro-couteau et une pince (deux de chacun des # 4 et # 55). Placez le tiroir à instruments et une boîte de Pétri à fond de verre de 50 mm, à paroi claire, sur un tampon non stérile.
    4. Obtenir une lame de scalpel stérile # 15; Un sac en plastique scellable ou un récipient (pour éliminer les carcasses conformément aux directives institutionnelles); Glace dans un seau; Et la solution stérile stérile Hank's Balanced Salt (HBSS). Placez ces objets sur leAutre caisse non stérile.
    5. Transférer le HBSS dans un tube de laboratoire plastique de 50 mL et le mettre sur de la glace.
  2. Préparer la culture
    1. Préparez tous les matériaux dans un capot à flux laminaire. Pour chaque quatre spécimens, mettez quatre patins de verre ronds à 10 mm en plaques autoclavées dans les quatre incrustations de la boîte de Petri 35 mm à 4 puits.
    2. Pour chaque 4 spécimens, mélangez un volume total de 300 μL composé de ce qui suit dans un tube de microcentrifugeuse: 10 μL d'adhésif tissulaire, 285 μL de NaHC03 et 5 μL de NaOH.
    3. Mettez 45 μL de la solution résultante sur chaque patte de recouvrement et laissez-le pendant au moins 20 min à la RT; Cette solution peut être laissée sur la lamelle pendant plusieurs heures mais ne peut pas être laissée O / N.
    4. Placez une ou deux boîtes de pétri à 4 po de 35 mm à l'intérieur d'une boîte de Petri de 10 cm afin de créer deux barrières contre la contamination.
    5. Préparer un milieu de culture contenant 98% de milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 1% de N-2 et 1% d'ampicilline (65 μL par puits dans un tube de (micro) centrifugeuse). Réchauffer la solution à 25 ° C avant l'utilisation.

2. Dissection de l'échantillon de cochléaire murin

  1. Décapitation de la souris néonatale
    1. Obtenir une boîte de Petri en plastique de 60 mm et vaporiser 70% d'éthanol dans son couvercle afin que la surface soit humide.
    2. Versez le HBSS froid du tube de laboratoire en plastique dans la partie inférieure du plastique de 60 mm et la boîte de Petri à fond transparent et à paroi transparente de 50 mm. Rangez le tube de laboratoire en plastique et les deux boîtes de pétri sur glace pour garder le tissu à froid chaque fois qu'il ne se dissipe pas.
    3. Placez une souris néonatale P3-P5 sur glace dans un doigt de coupure d'un gant latex et attendez jusqu'à ce que l'hypothermie induit une perte de conscience (environ 1 à 3 minutes).
    4. Détachez la souris rapidement avec des ciseaux opérationnels et jetez le corps dans le sac en plastique scellable. Mettez la tête de neonate coupée dans le70% d'éthanol dans le couvercle de la boîte en Petri en plastique de 60 mm.
  2. Dissection macroscopique de l'os temporel
    1. Retirer la peau du crâne en faisant une coupe superficielle de l'extrémité antérieure à l'extrémité postérieure (directement sur le suture sagittale) en utilisant la lame du scalpel.
    2. Coupez les deux canaux auditifs externes avec la lame du scalpel et pliez la peau avant pour exposer le crâne entier.
      REMARQUE: Bien qu'aucun microscope à dissection ne soit habituellement nécessaire pour cette étape, il peut être utilisé pour une meilleure visualisation.
    3. Ouvrez le crâne le long de la suture sagittale en utilisant la lame de scalpel # 15. Assurez-vous de couper le crâne en déplaçant doucement la lame vers le haut et vers le bas de l'avant vers la postérieure pour éviter la compression des cochlées.
      REMARQUE: Le crâne ne devrait pas être ossifié à cet âge et devrait être facilement coupé.
    4. Retirer et jeter le museau en faisant une coupe verticale directement postérieure aux orbites en utilisant le scalpel # 15lame.
      NOTE: La partie postérieure du crâne doit encore contenir le cerveau et les cochlées.
    5. Éliminer le cerveau antérieur, le cervelet et le tronc cérébral par une dissection émoussée avec une pince # 4.
  3. Extraction microscopique des cochlées
    1. Ajustez le microscope (grossissement 6,5 x) et la source lumineuse en plaçant la pince sous la portée et en optimisant l'éclairage et la mise au point.
    2. Placez les deux moitiés du crâne dans la boîte à pétales en plastique de 60 mm remplie de HBSS froid.
    3. Expliquez complètement la cochlée / e, identifiable comme étant adjacente à l'artère stapédiale environnante (une artère tortueuse dans l'os temporel) et séparez manifestement l'organe de l'os temporel en utilisant des pinces n ° 4.
    4. Transférer la cochlée dans la boîte de Petri à 50 mm, à paroi claire et à fond de verre et positionner le plat sous le microscope.
    5. Placez la boîte en Petri en plastique de 60 mm avec l'autre moitié du crâne sur la glace.
    6. Retirez la cochlée du système vestibulaire et dissérez soigneusement la capsule oculaire cochléaire (typiquement cartilagineuse à cet âge) avec une pince # 4. Utilisez les pince # 55 pour toutes les étapes supplémentaires.
  4. Etapes finales du traitement des tissus
    1. Continuer avec le traitement du tissu de l'oreille interne en séparant soigneusement le ligament spirale adhérent à l'organe de Corti du reste de la cochlée et du modiolus à l'aide du micro-couteau ou de deux pinces.
      1. Couper dans la zone plus sombre et translucide à la crevasse entre le ligament spirale et la région des cellules capillaires et procéder à l'élimination subséquente du ligament spirale en le saisissant à l'aspect le plus bas et en le dégageant doucement en se déplaçant apicalement.
    2. Placez l'échantillon pour obtenir une vue longitudinale et sagittale de la cochlée et coupez la cochlée en deux à trois sections en utilisant le micro-couteau, en classant ces sections comme apical, (moyen,) et bTour d'horizon. Retirez le tissu supérieur et inférieur à la couche réelle de cellules capillaires et de neurites afin d'obtenir une pièce d'explant cochléaire qui peut être placée horizontalement sur la boîte à pétrole.
      REMARQUE: une taille appropriée pour une adhérence stable au plat de culture est approximativement de moitié d'un tour cochléaire.
    3. Retirer la membrane tectoriale, une couche translucide très mince immédiatement supérieure à l'organe de Corti, en la pelant doucement avec une pince.
    4. Retirez la membrane de Reissner, immédiatement supérieure aux SGN, en la touchant avec une pince des deux côtés et en l'épluchant.
      REMARQUE: Retirez les zones de cellules capillaires endommagées situées latéralement en les coupant avec le micro-couteau.

3. Transfert de spécimens aux plaques de culture

  1. Enlevez les 45 μl de solution adhésive tissulaire des quatre pattes de recouvrement. Lavez chaque patte de couverture avec 50 μL d'H 2 O stérile. Aspirez l'eau.
  2. Prenez la pipette de 1 mL. Mouiller la pointe de la pipette avec environ 120 μL de DMEM pour empêcher l'échantillon d'adhérer à l'intérieur de la pointe.
  3. Transférer les spécimens individuellement à l'aide de la pipette de 1 mL. Pipettez un maximum de 70 μL de la boîte à pétales à fond de verre, petit, à paroi clochée et à fond clair, et placez l'échantillon avec le liquide sur l'une des 4 inlays (préparé avec des pattes de recouvrement) dans la boîte à pétre de 4 puits .
  4. Vérifiez sous le microscope (grossissement 50X) que l'échantillon est dans l'orientation correcte. Assurez-vous que la zone des cellules ciliées à partir de laquelle la membrane tectoriale a été retirée est orientée vers le haut. Assurez-vous que la membrane basilaire, avec la partie basale basée du modiolus, fait face vers le bas et adhère à la lamelle.
    1. Si l'échantillon est orienté à l'envers lors de l'inspection, déposez le HBSS qui reste dans la pointe de la pipette dans l'incrustation et repositionnez la pièce jusqu'à ce qu'elle soit correctement orientée.
      NONTE: Cela empêchera les cellules capillaires de flotter en milieu de culture sans support structurel de la lamelle, ce qui pourrait entraîner une dégénérescence.
  5. Aspirer l'excès de HBSS en utilisant la pipette de 1 mL. Attendre 15 s.
  6. Pipetter 60 μL du milieu de culture chaud préparé (98% de DMEM, 1% de N-2 et 1% d'ampicilline) directement sur l'échantillon. Veillez à ne pas toucher l'échantillon avec la pipette. Remplacer les couvercles intérieurs et extérieurs des boîtes de pétri et incuber O / N à 37 ° C.
  7. Remettre toutes les solutions stockées dans leurs endroits appropriés, éliminer les carcasses et les déchets résiduels, décontaminer la table chirurgicale selon les directives institutionnelles ( par exemple, utiliser de l'éthanol ou de l'hypochlorite), nettoyer et autoclaver les instruments et jeter les objets tranchants dans le récipient approprié .

4. Ajout de culture finale Médias et substances intéressantes

REMARQUE: Les explants cochléaires seront prêts à être utilisés 10 à 16 heures plus tard.

  1. Préparer un mixtuRe 97% de DMEM, 1% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de N-2 et 1% d'ampicilline (65 μL par puits dans un tube de microcentrifugeuse, chauffez la solution à 25 ° C avant l'utilisation).
  2. Ajoutez d'autres substances intéressantes aux solutions pour les groupes de traitement respectifs. Si des substances fluorescentes sont ajoutées ( p. Ex. Virus de la fluorescence verte (GFP) -expressing virus, dans une publication récente, une concentration de 10 10 GC de virus Adeno-Associés (AAV) a été utilisée pendant 48 h dans 50 μL) 18 , protégez-vous contre lumière.
  3. Transférer les boîtes de Petri contenant l'explantée cochléaire de l'incubateur et les placer sous la hotte à flux laminaire.
  4. Aspirez l'ancien milieu de culture (sans FBS) avec la pipette des inlays.
  5. Ajouter 60 μl par puits du milieu de culture chaude (traitement) préparé (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% d'ampicilline et les substances intéressantes).
  6. Remettre la boîte de Petri dans l'incubateur (37 ° C).
  7. View rPar exemple au microscope pour identifier les signes de contamination, la migration cellulaire ou le détachement de l'explant cochléaire et effectuer une coloration après un maximum de 7 jours.

5. Immunofluorescence - Jour 1

  1. Préparez la solution de blocage (94% de solution salée tamponnée au phosphate (PBS), 5% de sérum normal de chèvre ou de cheval (NGS / NHS, selon les anticorps secondaires) et 1% de tensioactif non ionique (voir le tableau des matériaux )) et le stock Une solution d'anticorps (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique avec les anticorps respectifs).
    NOTE: Les anticorps comprennent le lapin anti-Myo7A à une concentration de 1: 400+ (myosine 7A, pour les cellules capillaires interne et externe) et anti-TuJ1 de souris 1: 200+ (β-tubuline, pour SGN) OU souris (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (protéine de liaison c-terminale, pour présynapse), souris (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (densité postsynaptique, post-synapse) et anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilament, Pour SGN et fibres nerveuses). "+" MeaNs "ou plus haut."
  2. Aspirez le milieu de culture à l'aide d'une pipette. Veillez à ne pas toucher l'échantillon.
  3. Sous le capot de flux laminaire, rincer les explosifs cochléaires deux fois avec du PBS stérile, en plaçant les échantillons sur un agitateur pendant 5 min après chaque lavage.
  4. Fixez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4% (PFA - ATTENTION) pendant 20 minutes sur le shaker (sous le capot). Aspirez le PFA.
  5. Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x.
  6. Placez les explants cochléaires dans une solution de blocage préparée (94% de PBS, 5% de NHS et 1% de tensioactif non ionique) pendant 30 minutes sur l'agitateur.
  7. Placez les explants cochléaires dans une solution d'anticorps stock préparée (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique) avec les anticorps primaires respectifs (vortex avant utilisation) O / N sur un compteur à la RT.
    REMARQUE: Enrouler les boîtes de Petri avec des serviettes en papier humide enfermées dans une pellicule en plastique (ou une feuille d'aluminium si le solut ajoutéIon contient des matériaux fluorescents tels que des virus exprimeurs de GFP) pour garder la vaisselle humide et pour éviter l'évaporation de la solution d'anticorps O / N.

6. Immunofluorescence - Jour 2

  1. Préparer la tache 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (300 nM) et utiliser la solution d'anticorps stock pour obtenir les mélanges d'anticorps secondaires appropriés, complémentaires aux anticorps primaires à l'étape 5.1. ( P. Ex ., Chèvre anti-lapin 488 1: 200+ et chèvre anti-souris 568 1: 200+ OU chèvre anti-souris (IgG1) 568 1: 1000+, chèvre anti-souris (IgG2a) 488 1: 500+, Et chèvre anti-poulet 647 1: 200+ OU Phalloidine 568 1: 200+ (pour les cellules capillaires interne et externe)).
  2. Aspirer la solution primaire d'anticorps.
  3. Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x.
  4. Placez les explants cochléaires dans une solution d'anticorps stock préparée (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique) avec les resAnticorps secondaires pectifs (vortex avant utilisation) pendant 1,5 h sur un comptoir et protéger contre la lumière.
  5. Aspirer la solution d'anticorps secondaire et rincer les explants cochléaires avec une tache DAPI (placer sur un agitateur pendant 1 min puis aspirer).
  6. Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x.
  7. Utilisez une pince pour retirer les lamelles avec des échantillons de la plaque à 4 puits, les immerger dans un récipient rempli d'H 2 O distillé et sécher les lamelles en les mettant verticalement en contact avec des serviettes en papier.
  8. Placez une goutte de support de protection antifade sur la glissière du microscope et inversez les lamelles pour immerger le tissu tourné vers le bas dans le milieu.
  9. Scellez la lamelle en utilisant un vernis à ongles transparent couvrant le bord (sans écraser l'échantillon sous le verre). Laisser les lames situées à plat dans une zone couverte, loin de la lumière pendant 15 à 20 min jusqu'à ce qu'elles soient sèches et froides.Placez-les dans une boîte ou examinez-le sous le microscope confocal.
    REMARQUE: la coloration fluorescente est mieux conservée en stockant les diapositives à 4 ou -20 ° C.

7. Confocal Imaging

  1. Obtenez une vue d'ensemble et des images agrandies pour l'organe de la région de Corti, y compris les neurites et les SGN.
    REMARQUE: Paramètres standard pour le processus d'imagerie: Format de 1 024 x 1 024 pixels, vitesse de 400 Hz, image moyenne de 3, 20% d'intensité laser globale, et habituellement lentille 20X et 63X avec immersion à l'huile (potentiellement combinée avec un zoom numérique 2X). Les paramètres de canal pour le protocole de coloration DAPI, Myo7A et TuJ1 sont décrits ci-dessus: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0.0% - 488 15% isothiocyanate de fluorescéine (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% d'isothiocyanate de tétraméthylrhomadine (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%.
  2. Fusionnez les images dans une pile z en utilisant leLogiciel pour obtenir une projection d'axe z.

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Résultats

Bien que de nombreux protocoles se concentrent sur l'organe des explants de Corti, cette technique tente de préserver l'anatomie de l'ensemble du tournant cochléaire, y compris les SGN. Cela donne aux chercheurs la possibilité d'analyser les effets d'un traitement donné sur les neurites et somata des SGN en plus de l'organe de Corti. Effectuer une dissection qui conserve une partie du modiolus, comme décrit ici, est plus difficile à utiliser que l'explan...

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Discussion

Les chercheurs doivent perfectionner la technique de dissection avant d'effectuer des expériences impliquant des explants cochléaires. Les cellules ciliées sont généralement endommagées lors des dissections effectuées au début de la courbe d'apprentissage, et un moment particulièrement problématique pour leur intégrité est l'élimination de la membrane tectoriale, qui nécessite des mains régulières, des outils appropriés et une expérience. Pour économiser du temps et des ressources, un cont...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions du Département national de la surdité et des autres troubles de la communication, R01DC015824 (KMS) et T32DC00038 (soutenant SD), le ministère de la Défense accorde W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondation Bertarelli (KMS) Nancy Sayles Day Foundation (KMS) et le Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Nous remercions Jessica E. Sagers, BA pour des commentaires perspicaces sur le manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin, Sodium SaltInvitrogen11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)BD Transduction Laboratories612044
anti-Myo7A antibody, rabbitProteus Biosciences25-6790
anti-NF-H antibody, chickenEMD MilliporeAB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)Antibodies Inc.75-028
anti-TuJ1 antibody, mouseBioLegend801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mgCorning354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner ringsGreiner Bio-One627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One227261
Clear Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mmTed Pella Inc.260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
Distilled water, 500 mLThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 ForcepsFine Science Tools11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5%Sigma-Aldrich459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificR37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mLEMD MilliporeTMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mLThermo Fisher Scientific14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless SteelMountainside MedicalTechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30°Fine Science Tools10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72VWR16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mLThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mLThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 LThermo Fisher ScientificSS266-1
Normal Horse Serum (NHS)Invitrogen16050130
Operating scissorsRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, CrystallineSigma-AldrichP6148Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023 Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher ScientificA12380
Prep Pad, Non Sterile Medline05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mLEppendorf022363719Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mLEppendorf022363204Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15Fine Science Tools10015-00
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools10004-13
Stemi 2000-C Stereo MicroscopeZeiss 000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscopeLeicaN/A
Triton-X (non-ionic surfactant)IntegraT756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescenceVector Laboratories, Inc.H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thickZipline0609132541599

Références

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
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