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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés et les taux d'absorption du glucose sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basal et stimulés par l'insuline en utilisant du [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose radiomarqué.

Résumé

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. L'évaluation de la sensibilité à l'insuline des cellules musculaires est d'une importance majeure pour toutes les études consacrées à l'exploration du métabolisme du glucose musculaire et à la caractérisation des altérations métaboliques. Dans les cellules musculaires, les protéines de transporteur de glucose de type 4 (GLUT4) se transposent vers la membrane plasmique en réponse à l'insuline, ce qui permet une entrée massive de glucose dans la cellule. La capacité des cellules musculaires à répondre à l'insuline en augmentant le taux d'absorption de glucose est l'une des lectures standard pour quantifier la sensibilité des cellules musculaires à l'insuline. Les myotubes primaires humains sont un modèle in vitro approprié, car les cellules conservent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris la sensibilité à l'insuline. Ce modèle in vitro convient également pour le test de tout composé susceptible d'avoir une incidence sur la réactivité de l'insuline. Les mesures du taux d'absorption de glucose dans les myotubes différenciés reflètentSensibilité à l'insuline.

Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés, et les taux d'absorption de glucose avec et sans stimulation par l'insuline sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux de transport de glucose passifs et actifs en utilisant [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiomarqué [2H]. Des méthodes de calcul sont fournies pour quantifier les taux basiques actifs et stimulés par l'insuline, ainsi que le pli de stimulation.

Introduction

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l'homéostasie du glucose. Ce tissu sensible à l'insuline est le site principal de l'absorption de glucose qui est déclenchée par la stimulation de l'insuline 1 .

Dans le diabète de type 2, la résistance à l'insuline est observée dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique, et conduit à une concentration de glucose sanguin supérieure à la normale. Ainsi, il est très important de déterminer le niveau de sensibilité à l'insuline de ce tissu et de ses cellules, qu'il s'agisse de caractériser un défaut d'un sujet ou d'évaluer l'efficacité d'un traitement visant à l'améliorer. Chez les sujets humains ou animaux, la technique d'étalon-or pour évaluer la sensibilité à l'insuline est la pince hyperinsulinémique-euglycémique. Introduit par DeFronzo en 1979 2 et modifié depuis 3 , 4 alors, la méthode permet de quantifier tout le corps aLa capacité de réponse de l'insuline aux tissus est mesurée comme le taux de glucose à perfuser sous stimulation à l'insuline pour maintenir une concentration normale de glucose dans le sang.

L'exploration de la sensibilité à l'insuline peut également être effectuée au niveau des cellules en utilisant des modèles musculaires in vitro , et la mesure des taux d'absorption de glucose reste un outil efficace et fiable pour quantifier la réponse biologique de la stimulation cellulaire à l'insuline 5 , 6 , 7 . En effet, la mesure de l'absorption de glucose quantifie la réponse biologique cellulaire à la stimulation de l'insuline, de la liaison de l'insuline à son récepteur à la translocation des vésicules enrichies en GLUT4, y compris les cascades de signalisation intracellulaire et de phosphorylation 8 .

Ceci est d'un intérêt majeur pour les échantillons humains, car les myotubes différenciés maintiennent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris les propriétés métaboliquesIes et troubles observés chez le patient 9 , 10 , 11 , 12 . Les myotubes présentent des similitudes structurelles, métaboliques et phénotypiques avec le muscle squelettique 13 , 14 , y compris l'expression des transporteurs de glucose 15 et les machines de signalisation cellulaire insuline 16 . Ainsi, la mesure de l'absorption de glucose dans les myotubes primaires est pertinente pour caractériser le phénotype musculaire d'un donneur ou pour étudier l'effet d'une intervention (médicament, nutrition ou activité physique) sur la sensibilité à l'insuline dans la cellule musculaire.

La mesure de l'absorption de glucose sur les myotubes cultivés est également un outil fiable lors de l'exécution d'expériences qui modifient la sensibilité à l'insuline 17 , 18 . L' in vitro est adapté pour le test de tout composé qui pourrait améliorer la réactivité de l'insuline, ou pourrait prévenir ou inverser la résistance à l'insuline acquise ou induite 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la culture et différencions les myotubes humains et mesurons les taux d'absorption de glucose cellulaire. La méthode s'applique à toute source de cellules précurseurs musculaires humaines, qu'elles proviennent de préparations, de collaborations ou de fournisseurs commercialement disponibles dans le laboratoire. Les lignées de cellules musculaires immortalisées, comme C2C12 et L6, respectivement à partir d'origine de souris et de rat, peuvent également être utilisées pour la mesure de l'absorption de glucose avec ce protocole 7 .

Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basaux et stimulés par l'insuline en utilisant [3H] 2dG radiomarqué. TL'utilisation d'un analogue de glucose marqué permet une détermination précise de l'entrée de glucose avec un matériau de départ réduit, une condition commune lorsque vous travaillez avec des cellules primaires. La molécule de glucose modifiée est incapable d'entrer dans les voies métaboliques, et donc, s'accumule dans la cellule, permettant une quantification fiable via la radioactivité cellulaire totale. Les conditions expérimentales comprennent l'utilisation d'un inhibiteur du transport du glucose (cytochalasine B), et les mesures sont effectuées avec et sans insuline. Cette combinaison permet la détermination des taux d'entrée active du glucose, ainsi que le calcul du changement de pli pour l'indice de réponse à l'insuline. La méthode est présentée avec une dose d'insuline pendant un seul temps d'incubation, mais le protocole peut être facilement modifié pour des expériences de réponse à la dose ou de temps 12 .

Protocole

1. Préparation des supports de culture cellulaire et des solutions

  1. Préparation des milieux de culture
    1. Préparer le milieu de prolifération (PM) en complétant le milieu F-10 de jambon avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 ug / ml de finale), 2% de sérum de veau fœtal (FCS) et 2% de substitut de sérum.
    2. Préparer le milieu de différenciation (DM) en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 μg / mL) et 2% de FCS.
  2. Préparation des solutions d'absorption du glucose
    Attention: la manipulation de matières radioactives n'est autorisée que dans un espace restreint et contrôlé par un personnel autorisé. Les matériaux et les déchets doivent être manipulés conformément aux procédures, directives et législation locales appropriées.
    1. Pour préparer la solution saline tamponnée au phosphate de X-Dulbecco (X-DPBS), faire une solution de DPBS contenant 0,2% (p / v) (concentration finale) de sérum bovin albUmin (BSA). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Conserver à 4 ° C.
    2. Pour préparer une solution froide de 2-désoxy-D-glucose (2dG), pesez 16,4 mg de 2dG et solubilisez dans 10 ml d'eau distillée pour obtenir une solution 10 mM. Conserver à 4 ° C.
    3. Ajouter 600 μl de 2dG froid et 6 μL de [ 3 H] 2dG à 5400 μL de X-DPBS radiomarqués pour obtenir la solution 2dG (2dG *) radiomarquée.
      NOTE: La concentration finale est 1 mM 2dG et l'étiquetage est de 1 μCi / mL.
      1. Mettre de côté une aliquote de 20 μL (TC20) de solution 2dG * radiomarquée.
  3. Préparation de mélanges d'incubation
    1. Pour le mélange de cytochalasine B, ajouter 2 μL de cytochalasine B 20 mM à 2 ml de solution 2dG * radiomarquée.
      NOTE: La solution stockée de cytochalasine B est à 10 mg / ml dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
    2. Pour le mélange de DMSO, ajouter 4 μL de DMSO aux 4 mL restants de solution 2dG * radiomarquée.

2. Culture des cellules musculaires primaires humaines

  1. Semis de plaques à 6 puits avec cellules satellites de muscle humain
    REMARQUE: Utilisez en interne (voir la référence 24 pour plus de détails) ou des cellules satellites de muscle humain disponibles dans le commerce à partir d'un flacon congelé (contenant 250 000 cellules). La procédure suivante est donnée pour 250 000 cellules afin d'obtenir une plaque de 6 puits nécessaire à la mesure de l'absorption du glucose en une seule condition.
    1. Décongeler rapidement les flacons congelés de 24 ou des préparations commerciales de cellules satellites musculaires humaines dans de l'eau préchauffée (37 ° C) jusqu'à ce que seul un petit bloc de glace reste dans le flacon.
    2. Verser directement dans un tube en plastique de 50 ml contenant 10 ml de pré-chauffé (37 ° C) PM.
    3. Centrifuger pendant 5 min à 500 xg et jeter le surnageant.
    4. Remplacer doucement le culot cellulaire avec 18 ml de PM préchauffé (pour obtenir 42 000 cellules par3 ml de milieu). Distribuer 3 mL dans chaque puits d'une plaque à 6 puits (9,6 cm 2 ).
      NOTE: Les six puits individuels d'une plaque doivent effectuer une mesure en double de l'absorption de glucose pour les conditions suivantes: inhibition du transport passif (puits 1 et 2), taux basal (puits 3 et 4) et taux stimulé par l'insuline (puits 5 et 6). Répétez autant de plaques à six puits que des traitements distincts sont nécessaires.
    5. Incuber dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ) jusqu'à ce que les cellules atteignent 90% de confluence.
      REMARQUE: cette étape prend entre 48 et 72 h selon le lot de cellules. Ne changez pas de moyen pendant cette étape.
  2. Différenciation des cellules musculaires
    1. Retirer le PM (après 48-72 h) et le remplacer par du DM préchauffé (3 mL par puits). Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 .
      NOTE: La différenciation prend cinq jours pour atteindre un état stable où les cellules sont alignées et polynucléées. Généralement, le primaireLes myotubes sont cultivés dans un milieu glucose de 1 g / L. Par conséquent, pour éviter l'appauvrissement du glucose pendant la culture, remplir la plaque avec 3 mL de milieu pour s'assurer que suffisamment de substrat de glucose est disponible pour les cellules en tout temps.
    2. Remplacer le DM moyen tous les deux jours.
      REMARQUE: à partir de ce point, les myotubes sont stables jusqu'à 7 jours sans changement significatif et la mesure de l'absorption du glucose peut être effectuée à tout moment.
  3. Traitement des cellules musculaires (facultatif)
    REMARQUE: Les myotubes primaires peuvent être traités pendant plusieurs jours pour induire une modification (test médicamenteux, inhibiteurs / activateurs de la voie de signalisation, etc. ) avant la stimulation de l'insuline et les mesures d'absorption du glucose. Les cellules musculaires peuvent être soumises à tout traitement qui peut avoir un impact sur la sensibilité à l'insuline, et la mesure de l'absorption du glucose quantifiera cet impact. Par exemple, l'incubation des cellules musculaires avec le palmitate d'acide gras saturé favorise la résistance à l'insuline et les cellules affichent une réduction de iNsulin a stimulé l'absorption de glucose.
    1. Préparer 12 mL de DM additionné de 10% de BSA (sans acides gras) et de palmitate de 0,5 mL (PALM). Préparez 12 mL de DM complété par 10% de BSA (sans acide gras) uniquement.
    2. Préparez deux plaques de 6 puits avec des myotubes primaires humains et les cultiver comme décrit dans les sections 2.1 et 2.2 (avec 5 jours de différenciation).
    3. Le jour 5, laver chaque puits avec 2 mL de PBS. À une assiette, ajouter 2 ml de DM contenant du PALM. À l'autre plaque, ajouter 2 mL de BSA contenant seulement du DM.
    4. Incuber pendant 48 h à 37 ° C, 5% de CO 2 .

3. Stimulation de l'insuline

  1. Laver les cellules musculaires différenciées deux fois avec 2 mL de PBS.
  2. Retirer PBS soigneusement et incuber avec 3 mL de DM sans FCS pendant 3 h (37 ° C, 5% de CO 2 ) pour l'appauvrissement du sérum.
  3. Remplacez les médias dans tous les puits par 3 mL de DM sans FCS. Ajouter l'insuline 100 nM aux puits 5 et 6.
  4. Incuber la culture des myotubes humains pour1 h (37 ° C, 5% de CO 2 ).

4. Capture de glucose

  1. Après 1 heure de stimulation à l'insuline, lavez les puits deux fois avec du X-DPBS (1 mL par lavage).
  2. Ajouter 1 mL de mélange de cytochalasine B aux puits 1 et 2 et 1 mL de mélange de DMSO aux puits 3 à 6. Incuber pendant 15 minutes (37 ° C, 5% de CO 2 ). À la fin de l'incubation, placez immédiatement la plaque sur de la glace.

5. Cell Lysis

  1. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS glacé.
  2. Lyse les cellules dans chaque puits avec 600 μL de 50 mM de NaOH. Incuber sur de la glace pendant 5 min et mélanger doucement avec une rotation orbitale lente.
    REMARQUE: Si le lysat est trop visqueux, diluer avec 1,5 ml de NaOH.
  3. À l'aide d'une pipette, ré-endiguer et collecter le lysat cellulaire.

6. Détermination du glucose radiomarqué

  1. Mettez 400 μL de chaque lysat cellulaire dans un flacon de comptage de scintillation liquide. Préparer un flacon de contrôle négatif avec 400ΜL de NaOH 50 mM et un flacon de contrôle positif avec 20 μL de TC20 (à partir de l'étape 1.2.3.1).
  2. Ajouter 4 mL de solution de scintillation liquide à chaque flacon. Fermez le capuchon et mélangez chaque flacon à fond (1-2 s).
  3. Insérez chaque flacon dans un compteur de scintillation liquide et mesurez la radioactivité selon les instructions du fabricant. Enregistrez les comptes par minute (CPM) pour chaque flacon de scintillation pendant 10 min.
    REMARQUE: CPM = "désintégrations par minute" x "efficacité de comptage".

7. Taux d'absorption de glucose

  1. Utilisez le lysat restant (200 μL, à partir de l'étape 5.2) pour mesurer la concentration en protéines. Déterminer la concentration en protéines de chaque lysat cellulaire en utilisant Bradford 25 ou une méthode équivalente. Calculez la quantité totale de protéines (Q) en mg pour chaque puits.
  2. Pour obtenir TC1 (la valeur pour 1 μL de 2dG radiomarqué *), divisez la valeur CPM de TC20 de 20.
  3. Pour chaque flacon, calculez tLe taux d'absorption de glucose comme suit:
    figure-protocol-9178
    NOTE: R est mesuré en pmol / mg / min. La moyenne de R pour les puits 1 à 2 donne un taux de transport passif, R p . Moyenne de R pour les puits 3-4 donne le taux de transport total basal, R bt . La moyenne de R pour les puits 5-6 donne un taux de transport total stimulé par l'insuline, R it .
    1. Calculer le taux de transport actif basal (R ba ) comme suit:
      figure-protocol-9670
    2. Calculer le taux de transport actif stimulé par l'insuline (R ia ) comme suit:
      figure-protocol-9845
      NOTE: Dans les cellules sensibles à l'insuline comme les myotubes, les taux d'absorption de glucose sont généralement représentés par trois valeurs: R ba , R ia et la stimulation de l'insuline pliante comme R ia / R ba .

Résultats

Le jour 3, les myoblastes atteignent la confluence ( figure 1A ). Les myoblastes à ce stade sont typiquement mononucléés. Le moyen a été changé et, au jour 8, la différenciation a été complétée ( figure 1B ) (protocole section 2). Après 5 jours de différenciation, les myotubes sont alignés et typiquement polynucléés. Les myotubes primaires humains ont été soumis à un traitement par le palmitate ou un BSA uniqu...

Discussion

L'absorption de glucose est une mesure biologique clé pour tester les activateurs ou les inhibiteurs de la culture cellulaire et leur impact sur l'utilisation du glucose et la capacité de la cellule à répondre à l'insuline. La méthode décrite ici s'est révélée rapide et fiable et a été largement utilisée dans de nombreuses études utilisant des myotubes primaires de sujets sains et / ou métaboliquement affectés 6 , 7 , <...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent Anne Charrié au service de Radiobiologie (hôpital de Lyon-Sud) et Fond National Suisse (FNS) pour leur soutien financier.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Human primary muscle cellIn house preparation from human skeletal muscle biopsiesIn house preparation from human skeletal muscle biopsiesIf not available, use commercial source
Human primary muscle cellPromocellC-12530Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plateCorning356400BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10DutscherL0145-5001 g/L glucose
GlutamineDutscherX0551-100
penicilin/streptomycin 100xThermo fisher scientific15140122
Serum substitute UltroserGPall France15950.017serum substitute in text
DMEM low glucoseDutscherL0064-5001 g/L glucose
Fetal Calf SerumEurobioCVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineDutscherL0625-500Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution humanSigma-AldrichI9278
2-deoxy-D-glucose Sigma-AldrichD6134
Albumin bovineeuromedex04-100-812-E
fatty acid-free BSARoche10,775,835,001
palmitateSigma-AldrichP0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]PerkinElmerNET328A001MCSpecific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin BSigma-Aldrichc2743
PICO PRIAS VIAL 6 mLPerkinElmer6000192
ultima gold MW CA PerkinElmer6013159scintillation liquid
bêta counter PerkinElmer2900TR

Références

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