Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Résumé

Immunomarquage des méthodes pour analyser des populations distinctes des microtubules dans le cerveau en développement du poisson zèbre sont décrites ici, qui sont largement applicables à d’autres tissus. Le premier protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage des microtubules stables et dynamiques. Le deuxième protocole fournit une méthode pour l’image et de quantifier les microtubules naissants spécifiquement.

Résumé

Les microtubules (MTs) sont des structures dynamiques et fragiles qui sont difficiles à image in vivo, en particulier chez les embryons de vertébrés. Immunomarquage méthodes sont décrites ici pour analyser des populations distinctes de MTs dans le développement du tube neural de l’embryon de poisson zèbre. Alors que l’accent est mis sur les tissus nerveux, cette méthodologie est largement applicable à d’autres tissus. Les procédures sont optimisés pour les dès le début à mi-somitogenèse-stade embryons (1 somite à 12 somites), cependant ils peuvent être adaptés à un éventail d’autres stades avec des ajustements relativement mineurs. Le premier protocole fournit une méthode pour évaluer la distribution spatiale des MTs stables et dynamiques et d’effectuer une analyse quantitative de ces populations avec logiciel de traitement d’image. Cette approche vient compléter les outils existants à la dynamique des microtubules image et de la distribution en temps réel, en utilise des lignées transgéniques ou expression transitoire de constructions étiquetées. En effet, ces outils sont très utiles, mais ils ne distinguent pas facilement MTs dynamiques et stables. La capacité de l’image et d’analyser ces populations distinctes de microtubules a des implications importantes pour la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la polarisation de la cellule et la morphogenèse. Le deuxième protocole décrit une technique pour analyser spécifiquement les MTs naissantes. Ceci est accompli en capturant les propriétés de croissance de novo de MTs au fil du temps, suite à la dépolymérisation des microtubules avec la nocodazole de drogue et une période de récupération après le lavage de la drogue. Cette technique n’a pas encore été appliquée à l’étude des MTs chez les embryons de poisson-zèbre, mais est un test utile pour étudier la fonction in vivo des protéines impliquées dans l’assemblage des microtubules.

Introduction

Les microtubules (MTs) sont des polymères de α - et β-tubuline qui s’assemble en protofilaments linéaire, dont plusieurs se combinent pour former un tube creux^1,2. MTs sont des structures polarisées, avec l’essor de plus fins et croissance lente moins les extrémités qui sont ancrées à centrosome ou autres organisation des microtubules center (MTOC)³. De novo Formation de MT est initiée par nucléation à l’anneau γ-tubuline complexe (γ-TURC), qui fournit un modèle pour les MT Assemblée⁴. Dans une cellule donnée, deux populations de MTs se distinguées ce tour-ci au fil à des vitesses différentes. Dynamiques MTs explorent leur environnement cellulaire par la commutation entre les phases de croissance et de rétrécissement dans un processus appelé instabilité dynamique⁵. Contrairement aux MTs dynamiques, stables MTs sont non productrices et ont une demi-vie plus longue que la dynamique MTs⁶.

Des décennies de recherche en biologie cellulaire a fourni une sophistiqué panoplie d’outils pour étudier la fonction et la structure de la MT et a donné lieu à un vaste corpus de connaissances sur ces éléments du cytosquelette. Par exemple, MTs jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien de la polarité cellulaire, qui est attribuable non seulement à leur polarité intrinsèque, mais aussi à la distribution subcellulaire différentielle des stable versus dynamique MTs^{7, 8}. en revanche, beaucoup moins est entendu sur l’architecture de MT et de fonctionner dans des environnements de (3-d) en trois dimensions plus complexes, tels que les embryons de vertébrés, en partie en raison de relever le défi de l’imagerie du cytosquelette MT à haute résolution. Malgré cette limitation, la récente génération de GFP-transgénique exprimant les lignes que MTs de l’étiquette ou une expression transitoire de marqueurs de MT fluorescent-étiquetées a augmenté notre compréhension des changements dynamiques qui subissent une MTs et leur cellulaire et rôle de développement de l’embryon de poisson zèbre. L’ensemble du réseau MT peut être photographié sur des lignées transgéniques dans laquelle tubuline est soit directement marqué⁹ ou tubuline polymères sont indirectement étiquetés à l’aide de protéines associées à la MT Doublecortin-like-kinase (Dclk) ou Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Autres lignes (et constructions) ont été générées qui permet d’évaluer des polarité intrinsèque MT par marquage spécifiquement MT plus fins ou ancrées à un centrosome moins les extrémités^{11,12,13, 14}. la puissance de ces outils réside dans la possibilité d’étudier la dynamique de la MT en direct, les organismes de développement. Ces études ont révélé, par exemple, la distribution spatiale et dynamique de MTs dans les populations de cellules spécifiques, l’orientation du mitotique broches en tissus subissant la morphogenèse (indicateur du plan de division cellulaire), la polarité du polymère MT en ce qui concerne les processus tels que l’élongation cellulaire et de la migration et les taux de croissance MT déterminé par comète vitesse^9,13,15. La limitation de ces outils est qu’ils ne sont pas facilement discriminatoires entre les populations stables et dynamiques de MT.

Puisant dans la littérature de biologie cellulaire riche, méthodes d’immunomarquage à l’image des MTs stables et dynamiques dans l’embryon de poisson zèbre sont décrites ici, qui sont complémentaires à l’usage des lignées transgéniques. La généralisation de ces méthodes d’immunomarquage dans le poisson-zèbre a été quelque peu gênée par la difficulté à préserver l’intégrité de la MT au cours de la procédure de fixation. 1 Protocole décrit une méthode optimisée d’immunomarquage total, dynamique, et MTs stables dans les sections du développement postérieur de poisson-zèbre efficaces. En outre, une méthode simple utilisant commercialement logiciels disponibles sont décrite afin de quantifier ces populations de MT. MTs stables sont distinguent des MTs dynamiques basés sur plusieurs modifications post-traductionnelles de α-tubuline, tels que l’acétylation et détyrosination, qui s’accumulent sur les MTs stables au fil du temps^16,17. Chez l’embryon de poisson zèbre, acétylation apparaît au MTs ciliaires et axonales alors pas stable interphase MTs¹⁸, limiter l’utilité de ce marqueur à un sous-ensemble de MTs stabilisées. En revanche, détyrosination semble se produire sur toutes les MTs stables dans l' embryon de poisson zèbre¹⁸. Cette modification post-traductionnelle expose l’acide glutamique carboxy-terminale de le α-tubuline (tubuline détyrosinée)¹⁸ et peut être détectée à l’aide d’anti-Glu-tubuline¹⁹. Bien que détyrosination se produit préférentiellement sur MTs stables, des preuves expérimentales indiquent que cette modification post-traductionnelle est un résultat de, plutôt qu’une cause de, MT stabilité¹⁶. La population de MT réciproque, composée de MTs dynamiques, se distingue à l’aide d’un anticorps, anti-Tyr-tubuline, qui reconnaît spécifiquement la forme tyrosinée de tubuline α¹⁹. Après l’immunomarquage avec ces marqueurs et imagerie confocale, l’analyse quantitative des MTs (longueur, nombre et abondance relative) est possible dans des régions définies du tube neural en voie de développement. Une méthode simplifiée est fournie ici pour réaliser cette analyse à l’aide de logiciels de traitement d’images 3D. Cette méthode peut être appliquée pour répondre aux questions au sujet de la morphogénèse et la création ou la maturation des cellules polarité²⁰. En effet, l’élaboration de tableaux polarisées de MTs stables accompagne de nombreuses manifestations du développement, y compris les photorécepteurs morphogenèse²¹, épithélialisation des cellules dans le développement du tube neural¹⁸ et axon formation⁸.

Protocole n° 2 décrit une adaptation in vivo d’une épreuve de biologie cellulaire pour analyser des MTs au cours de leur Assemblée phase (/ l’ancrage de la nucléation et croissance)^22,23. Naissantes MTs sont nucléés à centrosome et par la suite fixés au subdistal appendices de la mère centriole²³. On décrit une méthode pour analyser naissant MT repousse après la dépolymérisation. Ce protocole fournit des détails sur le traitement de la nocodazole pour dépolymériser MTs, la procédure de lavage des drogues et la période de récupération après le traitement. MT repousse est contrôlée à intervalles régulierslavage post s par immunomarquage avec des marqueurs pour MTs totales (anti-β-tubuline) aux côtés de marqueurs pour le centrosome (anti-γ-tubuline) et noyau (4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)), selon les procédures décrites dans le protocole 1. L’étape de dépolymérisation MT du présent protocole est essentielle car elle permet d’évaluation de la croissance de MT de novo plutôt qu’extension de MTs préexistants. Cette technique est donc distincte des autres procédures publiées pour mesurer les taux de croissance de MT (en absence de dépolymérisation) à l’aide d’un marqueur plus comme l’ailier liaison protéine 3 fondue à la protéine fluorescente verte (GFP-EB3), comme illustré dans la Tran et al., ¹¹de 2012. En outre, ce test est particulièrement utile pour analyser les embryons défectueux en Assemblée de novo MT, tels que les mutants de NEDD1 rapportées antérieurement, dans lequel le recrutement de la γ-tubuline à centrosome est entravé, ayant pour résultat incomplet la formation du tube neural et défauts neuronale²⁴.

Protocole

déclaration d’éthique : les procédures décrites ci-dessous suivre l’Université des directives de soins aux animaux le comté de Baltimore Maryland.

1. analyse de Stable et dynamique MTs à l’aide d’immunomarquage (protocole 1)

1. dechorionation manuelle des embryons avant fixation
   1. obtenir fraîchement pondus embryons par excès système décanter et puis à recueillir les embryons restants dans une boîte de Pétri de plastique (voir Table des matières).
   2. Enlevez tous les débris de l’embryon de l’eau et le transfert de système à un nouveau plat rempli de milieu de l’embryon (voir Table des matières) pour s’assurer que les embryons se développent dans un environnement propre.
   3. Autoriser les embryons se développer jusqu'à l’étape désirée dans une étuve à température contrôlée à 28,5 ° C.
   4. Embryons lieu moins de 24 h après la fécondation (hpf) dans un plat en verre avant dechorionation.
      Remarque : Dechorionate embryons avant fixation pour maximiser la pénétration rapide de l’intégrité de MT fixateur et de préserver. Moyen d’embryon utilisation au lieu de l’eau du système pour fournir la supplémentaires Ca ^{2 +} requis au cours de la dechorionation.
   5. Supprimer manuellement les chorions des embryons en boîte de Pétri, à l’aide de pinces fines sous un microscope à dissection.
      1. Pincer une petite zone dans le chorion rond et transparent qui entoure l’embryon avec une paire de pinces et doucement tirer pinces dehors pour créer une rupture dans la membrane.
      2. Agrandir l’ouverture en l’écartant délicatement sur le chorion rupture avec une pincette. Veillez à ne pas toucher l’embryon avec la pince, car il pourrait entraîner une rupture.
2. Fixation d’embryons mis en scène
   1. transfert mis en scène, des embryons de déchorionés pour tubes de centrifugeuse de 1,5 mL. Enlevez autant moyen embryon possible à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
      Remarque : Effectuer des traitements de fixation et de la drogue sur des embryons de jeunes (mi-somitogenèse), avant la création des centres neurales médiation la sensation de douleur, nécessitant aucune procédure supplémentaire pour soulager la douleur pendant l’euthanasie. Stades de développement sont définis dans Kimmel et al., 1995 ²⁵. Les stades somite 4-5 et 11-12 ont été utilisées pour obtenir des images de Figures 2 et 3.
   2. Préparer l’Assemblée/Mt de paraformaldéhyde (PFA) 4 % fixateur de tampon (MAB) (se reporter à la Table des matières) en combinant 1 mL 8 % PFA / 1 mL 2 X MAB et en ajoutant 2 µL 100 % Triton X-100 par 1 mL de volume total.
      ATTENTION : Porter des gants lors de la manipulation des solutions contenant de l’IFP et le Triton X-100, qui sont irritants pour la peau.
   3. Fix embryons dans 1 mL 4 % PFA/MAB fixateur pendant 5 min à 28,5 ° C. aspirer le fixateur avec une pipette, remplacez-le par fixateur frais 1 mL et incuber pendant 3 h à température ambiante (RT) sur une base berçante.
      NOTE : Les échantillons doivent être fixées rapidement à leur température biologique (28,5 ° C pour le poisson-zèbre) pour empêcher la dépolymérisation MT dépendant de la température.
3. Aspirer le fixateur et ajouter 1 mL 1 x tampon Tris salin avec NP40 tampon (SCT-NP40). Agiter doucement à ta sur un rocker trois fois de 5 min chacun. Conservation des embryons à 4 ° C en 1 mL frais 1 X TBS-NP40 pour pas plus de 7 jours.
   ATTENTION : Porter des gants lorsque vous manipulez des solutions contenant des NP-40, un irritant de la peau.
4. 1. 4 % de chaleur RT bas point de fusion (LMP) les embryons de sectionnement pour immunomarquage agarose enrobage moyen dans un récipient fermé jusqu'à ce que la solution devienne claire à l’aide d’une plaque chauffante réglé à 50 ° C, placé à proximité d’un microscope à dissection . Garder le récipient fermé entre échantillons et chauffée pendant tout le processus d’incorporation (mesures 1.4.4-1.4.6).
   2. Transfert des embryons de la 1,5 mL centrifuger les tubes à une boîte de Pétri à l’aide d’une pipette de verre et remplissez-le avec 1 X TBS-NP40.
   3. Enlever les cellules de gros jaunes d’embryons au stade somitogenèse (4-5 et 11-12 somites) dans la boîte de Pétri à l’aide de pinces fines sous le grossissement d’une dissection de microscope ²⁶. Tenez l’embryon par le bourgeon de la queue avec une paire de pinces et décollez les cellules jaunes avec l’autre paire afin de préserver le tissu de cerveau postérieur. Transférez les embryons de vitellus à une zone de la boîte de Pétri exempt de débris de vitellus.
      NOTE : Incorporer des embryons dans le moule rempli de gel d’agarose individuellement pour éviter un durcissement prématuré de l’agarose LMP.
   4. Remplir un 12 x 5 mm x 3 mm bien du moule sectionnement avec 200 µL fondu agarose LMP à l’aide d’une micropipette. Effectuez les étapes 1.4.5.-1.4.6. rapidement (moins de 20 s de remplissage du moule) pour incorporer l’embryon avant que l’agarose LMP se refroidit à la RT et solidifie.
   5. Pince fine permet de transférer un embryon de vitellus par le tailbud de la boîte de Pétri au moule rempli d’agarose vers son extrémité effilée sous un microscope à dissection.
   6. Pince fine utilisation d’orienter l’embryon dans le moule, tel que le vibratome coupes dans le plan désiré. Créer des sections transversales en orientant l’embryon telle que le tissu de cerveau postérieur est parallèle à la longueur du moule avec son faisant face au bord de la face dorsale et sa face antérieure, face à la fin de la région conique. Répétez les étapes 1.4.4-1.4.6 pour les embryons restants.
   7. Autoriser l’incorporation d’agarose pour solidifier pendant 5 min à température ambiante.
   8. Générer 40 µm tronçons de l’axe plus haut de l’agarose incorporé embryons (mesures 1.4.1-1.4.7) utilisant un vibratome avec le plat de sectionnement rempli avec 1 x TBS-NP40. Transfert des sections d’intérêt à une plaque 24 puits dans 500 µL 1 x TBS-NP40, à l’aide de pinces fines. Déposer les éléments d’un seul embryon par puits.
      Remarque : Se référer pour faire référence à ¹⁸ pour plus de détails. S’assurer que les sections restent hydratées à tout moment au moins 250 µL de tampon et rock à basse vitesse (10 à 25 tr/min) pour les étapes restantes empêcher la séparation de l’incorporation d’agarose. Détergents présent dans le blocage et solutions de lavage devraient réduire la tension superficielle du milieu liquide et permettre submersion des sections. Vérifier que les sections restent dans les puits pendant et après toutes les manipulations. Soyez prudent pour éviter les sections accidentellement rejets lors de lavages.
5. Retirer le tampon et ajouter 500 µL de solution de blocage. Rock pendant au moins 1 h à température ambiante.
   Remarque : Utiliser une solution de blocage qui contient 5 % des sérums provenant de l’espèce hôte de chaque anticorps secondaire à utiliser (voir Table des matières).
6. Incuber en anticorps primaires de 300 µL dilués dans un tampon bloquant pour 36 à 72 heures à 4 ° C sur une bascule. Laver deux fois à 600 µL 1 x TBS-NP40 sur une bascule de 30 min chacun, à ta.
   NOTE : Double marquage des sections par incubation dans des anticorps primaires contre MTs totales (anti-β-tubuline, ou anti-α-tubuline) et MTs stables (anti-Glu-tubuline) ou MTs dynamiques (tubuline anti-Tyr). Sélectionnez des anticorps primaires qui ont été soulevées dans différentes espèces hôtes lorsqu’un double marquage pour total et sera modifié les populations α-tubuline. Se référer à la Table des matières pour les dilutions anticorps.
7. Incuber dans 300 µL d’anticorps secondaires conjugué à un fluorophore dilué dans un tampon bloquant sur un balancier pendant 16 à 24 heures, à 4 ° C dans l’obscurité. Laver deux fois à 600 µL 1 x TBS-NP40 sur une bascule de 30 min chacun, à ta.
   Remarque : Enroulez le plat multipuit contenant un anticorps secondaire dans du papier à partir de là et après chaque manipulation afin d’éviter l’extinction. Sélectionnez des anticorps secondaires qui réagissent avec l’immunoglobuline de l’hôte de l’anticorps primaire. Choisissez des fluorophores anticorps secondaire qui ont des spectres d’émission distincts, sans chevauchement. Se référer à la Table des matières pour les dilutions anticorps.
8. Incuber les embryons dans 500 µL de solution de DAPI sur un balancier pendant 30 min, à RT. Wash trois fois au SCT-NP40 bascule à ta de 5 min chacun.
   NOTE : Marquage nucléaire fournit un contexte cellulaire pour la quantification de MT effectuée à l’étape 1.12.
9. Déposer une goutte de milieu de montage avec agent anti-fondu sur le centre d’une lame non poussiéreux. Pince fine permet de transférer des sections de la gouttelette moyen de montage. Placez une lamelle de poussière sur le dessus de l’échantillon. Stocker des diapositives dans un endroit sec, sombre et frais, enveloppé dans du papier, jusqu'à ce que l’imagerie est réalisée.
   NOTE : Encerclant les sections sur le dos de la lame à l’aide d’un marqueur permanent pointe fine avant l’imagerie aidera à identifier les sections lors de l’utilisation du microscope.
10. Imagerie confocale
    1. Mont sections sur un microscope confocal de laser inversé en apposant la diapositive à la scène avec la lamelle face à l’objectif. Déterminer l’optique approprié (objectif, laser et canaux de communication tels que le gain et offset) sur une lame de contrôle et gardez-les cohérente entre les échantillons ²⁷. Éviter de sursaturer les pixels pour éviter toute perte de données.
    2. Capturer images confocales Z-piles à l’aide de paramètres de canal pour les fluorophores anticorps secondaire sélectionnés et enregistrer des fichiers image ²⁷. Acquérir des Z-piles pour chaque section.
       NOTE : Reproduire les paramètres utilisés pour acquérir les images dans les Figures 2 et 3 en utilisant les paramètres d’acquisition suivants : mode = XYZ ; grossissement objectif = 63 X lentille d’immersion d’huile ; ouverture numérique objective = 1,4 ; Z-étape = 0,1 µm ; Profondeur Z = 16.23 µm. utiliser des canaux de communication suivants : excitation DAPI avec laser UV-portée de 20 %, gamme de filtre d’émission = 430-480 nm, photomultiplicateur (PMT) gain = 525 V et décalage PMT =-1.72 % ; 448 nm fluorophore (voir Table des matières) excitation avec laser à 488 nm 20 %, gamme de filtre d’émission = 493-573 nm, gain PMT = 689 V et décalage PMT = -0,2 % ; excitation de fluorophore 594 nm avec laser nm 594 de 32 %, gamme de filtre d’émission = 608-706 nm, gain PMT = 768 V et décalage PMT = -6,8 %.
    3. Enregistrer des fichiers de données brutes avec des noms de fichiers uniques, descriptive et créer une copie pour l’édition de logiciel d’analyse image.
11. Compilation de Z-piles pour l’affichage des maximums
    1. ouvrir la copie de fichier de données à l’aide du logiciel image en 3D du domaine public analyse (p. ex., ImageJ). Vérifiez que chaque canal apparaît comme une séquence d’images individuelles (Z-stacks).
    2. Split des canaux de l’image en utilisant la séquence de menu suivantes : “ canaux Images/couleur/Split ”.
    3. Créer une image fusionnée en superposant les canaux d’intérêt en utilisant la séquence de menu suivantes : " Images/couleur/fusion channels. " sélectionner le 594 nm, 488 nm et canaux DAPI de fausse couleur rouge, vert et bleu, respectivement. Vérifier " Create composite " et sélectionnez " OK " ²⁸.
       NOTE : Omettre le canal DAPI pour mieux faire en détail spécifique à MTs dans une projection maximum comme dans la Figure 2 et 3, seule sélection de fausses couleurs pour les deux autres chaînes.
    4. Examiner la pile-Z fusionnée et prendre note de début et de fin des postes des Z-plans intérieurs de meilleurs pour tous les canaux visibles. Rejeter les Z-plans extérieurs qui ont généralement un signal sous-optimal en raison de la surface inégale de la section. Se reporter à la référence ²⁹ pour plus de détails.
    5. Visualiser la pile-Z fusionnée comme une seule image 2D en effectuant une projection de l’intensité maximale de la Z-pile à l’aide de la séquence de menu analyse 3D image suivante : " Images/pile/Z-projet. " entrer de début et fin des postes des meilleurs intérieurs Z-plans de l’étape 1.11.3 comme la " tranche de démarrage " et " arrêt de tranche, " respectivement. Sélectionnez " intensité Max " comme type de projection et cliquez " OK ". Se référer pour faire référence à ²⁸ pour plus de détails.
12. Analyse MT étiquetage
    1. Ouvrez le logiciel d’analyse commerciale image en 3D. Sélectionnez " créer une bibliothèque de " et de fournir un nom descriptif pour la bibliothèque d’images. Cliquez sur " créer. " faire glisser des fichiers image raw générés à partir du microscope confocal sous la bibliothèque. Gros fichiers requièrent plus de temps pour transférer.
    2. Sélectionner le fichier à analyser. Choisissez " étendu la mise au point " de la " vue " menu pour afficher l’image de canal : fusion dans la fenêtre principale.
    3. Ajuster le seuil en faisant glisser la grille de calcul pour chaque canal à gauche ou à droite jusqu'à ce que le signal de fond est réduit et le vrai signal est robuste. Observer que chaque canal présente un véritable signal pour la molécule marquée (par exemple, chaîne DAPI montrant des noyaux oblongs ou mitose mais pas auto-fluorescence dans le cytoplasme ou agarose).
    4. Sélectionner le " Freehand région d’intérêt (ROI) " outil et décrire la région intéressante à analyser. Sélectionnez le " Actions " suivie d’onglet " Crop à sélection " de recadrer l’image. Enregistrez le fichier de l’image recadrée sous un nouveau nom. Cliquez sur le " mesures " onglet pour créer le protocole pour le filtrage des objets spécifiques pertinents pour l’analyse 3D.
    5. Glisser " trouver des objets " à la fenêtre de protocole. Renommez le premier protocole " DAPI. " sélectionner le canal DAPI dans le menu déroulant. Faites glisser les paramètres suivants au protocole DAPI et placez-les ci-dessous " trouver des objets " dans l’ordre suivant (tableau 1) : " remplir les trous à ObjectsŔ " Séparé de toucher ObjectsŔ " Exclure des objets par SizeŔ " Exclure sans toucher les ROIs ".
       Remarque : L’objectif des paramètres dans le tableau 1 sont tout d’abord définir un seuil qui ignore les signaux dont la distribution et la taille sont incompatibles avec la taille des objets analysés. Par exemple, éliminer un signal pas assez grand pour être un noyau lors du comptage des noyaux.
    6. Effectuer la séquence (étape 1.12.9) pour assembler les autres filtres pour la β-tubuline et d’autres marqueurs en utilisant les paramètres dans le tableau 1.
    7. Select " mesure " au bas de chaque protocole. Choisissez " intensité et Volume mesure " et " squelettique longueur " pour tout marquage de tubuline, mais seul le premier pour le signal DAPI.
    8. Dessiner un retour sur investissement autour de la région à mesurer. Observer les résultats sous la " Résumé " onglet après le logiciel traite de la région. Copier les données et les enregistrer dans une feuille de calcul réalisable, comme dans le tableau 2. Créer une copie de sauvegarde de la feuille de calcul pour une analyse ultérieure.
    9. Sélectionnez mesures d’intérêt (par exemple, la longueur du bundle MT, nombre de faisceaux de MT/noyau, comme l’a révélé avec différents marqueurs) dans la feuille de calcul et les analyser afin de déterminer les moyennes pour chaque groupe.
       NOTE : La MT bundle longueur moyenne = la somme de la ' longueur squelettique de moyenne pour la β-tubuline ' pour chaque embryon divisé par le nombre total d’embryons. Se reporter à la ligne 20 du tableau 2. Format de la feuille de calcul afin que les variables et les groupes expérimentaux sont représentées graphiquement facilement.

2. De Novo MT Assemblée Assay (Protocole N° 2)

1. construction et test le multipuits accréditives appareil ( Figure 1) 2 jours avant l’expérience.
   Remarque : L’appareil permet un lavage simultané de plusieurs groupes expérimentaux après traitement nocodazole utilise des conduites de Table des matières. Scellant de silicone exige au moins 24 heures de temps de séchage avant qu’il ne présente aucun risque de toxicité pour les embryons.
   1. Diviser un tube à centrifuger 50 mL en deux sur la longueur, à l’aide d’une scie sauteuse ou scie à ruban.
   2. Demi-cercles cut 7, avec un rayon de 3 cm, de 70 µm nylon mesh et élaguer pour s’adapter étroitement dans une moitié de ce schisme centrifuger tube. Coller les demi-cercles dans le tube à centrifuger parallèle les marquages de gradation de 10 mL à l’aide de scellant silicone d’aquarium-safe. Laissez l’appareil sécher pendant 2 jours et rincer par trempage dans un bécher d’eau pendant 2-3 h.
   3. Ligne de l’extrémité supérieure (filetée) du tube à centrifuger coupées avec le modelage d’argile tels que la hauteur du liquide conservé dans le dispositif intermédiaire a une profondeur de ¼ po ( Figure 1, vue 2 et 3).
   4. Préparer l’appareil de lavage en retirant le piston d’une seringue de 50 mL et insertion de 12 pouces de tubulure fine dans la pointe. Pousser le tube autant que possible et sceller autour de l’articulation à l’aide de glaise à modeler.
   5. Pré mouillage du maillage à l’aide de moyen d’embryon pour permettre le liquide à courir à travers le dispositif entier de cheminement. Angle de l’appareil sur la glace donc ce liquide avec Betclic dans tous les compartiments mais toujours vide à l’avant où se trouve le bord de l’argile. Utiliser un support de bague, suspendre l’appareil de lavage au-dessus du dispositif de cheminement sur la glace ( Figure 1).
   6. Chill 200 mL du milieu de l’embryon sur la glace et verser suffisamment dans l’appareil de lavage pour s’assurer que toutes les bulles d’air sont désactivées et que le débit est environ 7 mL/min. ajuster le débit d’eau en changeant la hauteur de la seringue.
2. Enzymatiquement dechorionate embryons
   1. faire une solution de protéase non-spécifique de diluer 1 mL de 10 mg/mL stock non-spécifiques protéase dans 20 mL de milieu d’embryon.
   2. Dechorionation chimique effectuer sur des embryons 1 h avant le validant quand ils devraient atteindre le stade de développement souhaité. Digest chorions par retrait d’embryon support de 100 mm de Pétri contenant en scène embryons et ajouter 20 mL de solution de travail non-spécifiques protéase.
   3. Embryons incuber à 37 ° C pendant 5 min.
      Remarque : Ne pas dépasser les 5 min ou utilisez une plus forte concentration de la solution de protéase non spécifique, comme cela se traduira dans les embryons tomber dehors une fois traités avec la nocodazole.
   4. Rapidement pipeter des protéases non-spécifiques et remplir les plats avec environ 25 mL de milieu d’embryon. Répéter une fois.
   5. à l’aide d’une pipette de verre de 1 mL, transfert embryons âgés de moins de 24 hpf au verre plats afin des pour protéger contre les dommages.
   6. Dechorionation complète en supprimant manuellement chorions à l’aide d’une paire de pinces fines, comme indiqué au point 1.1.5.
   7. Placer le verre de Pétri contenant des embryons de déchorionés dans un incubateur à 28,5 ° C pendant au moins 30 min avant d’avoir atteint le stade de développement souhaité.
3. Depolymerize le système commercial multilatéral existant
   1. préparer une solution de 5 µg/mL nocodazole en combinant 50 µL 1 mg/mL stock nocodazole avec 10 mL de milieu d’embryon froid glace.
      ATTENTION : Utilisez des gants lorsque vous manipulez la nocodazole, un irritant de la peau.
   2. Échanger le milieu de l’embryon de la nocodazole groupe de traitement avec 10 mL de solution de travail la nocodazole froid. Placer les boîtes de Pétri sur glace pendant un temps suffisant pour le stade de développement (par exemple, 1 h pour les embryons de somite 4-5). Mettre de côté embryons témoins non traités dans une boîte de Petri sur glace fixée aux côtés d’échantillons d’affouillement à l’étape 2.3.4.1.
   3. Transfert embryons à l’aide d’une pipette de verre poli de 1 mL de feu à l’appareil intermédiaire, utilisant des compartiments séparés pour chaque groupe expérimental. Commencer le sevrage de la nocodazole par moyen d’embryon froid glace coulée dans le haut de la seringue de 50 mL.
      Remarque : Utilisez au moins 30 embryons par groupe expérimental. Groupes expérimentaux pourraient consister en des embryons témoins ou diverses morpholino ou d’embryons de RNA-injecté. L’effondrement du pont exigera un total d’environ 150 mL de milieu d’embryon à ajouter chaque 8-10 min. lavage la nocodazole tout en continuant à inhiber la croissance de MT avec de la glace. Garder les embryons sur glace est essentielle pour la réussite de ce test parce que MTs sont instables à froid et froid retarde le développement de jeunes embryons.
   4. Permettre à MTs de repousse après 20 min d’affaissement au RT par transfert d’embryons de verre plats de Pétri contenant chaud moyen d’embryon (28,5 ° C) à l’aide d’une pipette de verre poli mL 1 feu. Dès que les embryons sont transférés, démarrer un minuteur.
      1. Les embryons contrôle et lavage de fixer à 1 min, 5 min et 10 min en pipettant également environ 10 embryons dans un 1,5 mL Centrifuger le tube rempli de fix PFA/MAB 1 mL 4 % (28,5 ° C) et en suivant les instructions à l’étape 1.2.3.
4. Préparer les échantillons pour immunomarquage tel que décrit dans les sections 1.3-1.5.
5. Sections flottantes de marquer et d’embryons d’image comme décrites dans les sections 1.6-1.10 avec les modifications suivantes aux spécifications de l’anticorps primaire : utilisation 1/500 lapin anti-γ-tubuline et 1 : 200 de souris anti-β-tubuline.
6. Processus et analyser les images à l’aide de logiciels d’analyse image 3-d, comme indiqué au point 1.12.

Résultats

Analyse des MTs stables et dynamiques à l’aide d’immunomarquage
Dans le Protocole N° 1, la répartition des sous-populations MT au cours de début (neural quille) et stades avancés (tige neurales) du développement du tube neural se révèle, à l’aide de Glu-tubuline et Tyr-tubuline comme marqueurs pour MTs stables et dynamiques, respectivement. Dynamiques MTs prédominent dans le cerveau postérieur au stade de la quille neuronal (4-5 somite...

Discussion

Actuellement, il existe de nombreuses méthodes d’imagerie dynamique de MT dans le développement précoce de poisson-zèbre, allant de l’imagerie live de molécules marqués à immunomarquage de fixe tissu^11,12,13,14. Bien que MTs dans une seule cellule peuvent exister dans les États stables ou dynamiques, épithélialisation est un processus dans lequel les MTs sont stabilisés progressi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose			Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized.
Kpipes	Sigma	P7643
NaCl	Sigma	S7653
Tris-HCl	Sigma	T3253-500G
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
NP-40	American Bioanalyticals	AB01424
EGTA	Sigma	E3889-25G
MgCl2	Sigma	M2670-500G
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher	BP1605
Triton-x	American Bioanalyticals	AB02025
Anti-Fade mounting medium	Invitrogen	P10144
Mouse anti-β-tubulin	Developmental studies Hybridoma Bank	E7	1/200
Rabbit anti-γ-tubulin	Genetex	GTX113286	1/500
Rabbit anti-α-tubulin	Genetex	GTX108784	1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin	Millipore	AB3201	1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin	Millipore	ABT171	1/500
Mouse anti-centrin	Millipore	04-1624	1/1000
Goat 488 anti-rabbit	Thermofisher	A11008	1/500
Goat 594 anti-rabbit	Thermofisher	A11012	1/500
Goat 594 anti-mouse	Thermofisher	A11005	1/500
Goat 488 anti-mouse	Thermofisher	A11001	1/500
Vibratome	Vibratome	1500
Forceps	World Precision Instruments	555227F
100 mm petri dish	Cell treat	229693
35 mm petri dish	Cell treat	229638
50 ml falcon tube	Fisher	14-432-22
Woven nylon mesh 70 um	Amazon.com	B0043D1SZG
Micropipette	Gilson	F123602
Glass pipette	Fisher	NC-999363-9
Aquarium sealant	Amazon.com, by MarineLand	Silicone Sealer 1 oz (Tube)
Ring stand	Fisher	14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID	Cole-Parmer	WU-06417-21
Modeling clay	Amazon.com	Sargent Art 22-4000	Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp	Fisher	02-215-466
60ml syringe	Fisher	14-820-11
Embryo medium (E3)			34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.
Blocking Solution			50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6)			155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4)			160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software	PerkinElmer	Volocity (V 6.2)
Dry block heater	VWR	12621-108	Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope	Leica	MZ12
Confocal Microscope	Leica	SP5
Flat embedding mold	emsdiasum.com	BEEM 70904-01
Public domain image processing software	NIH	ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number