Analyse de haut-débit du comportement locomoteur dans le dosage de l’île de drosophile

Résumé

Le dosage de l’île est un dosage relativement nouvel et rentable qui peut être utilisé pour évaluer le comportement locomoteur base de Drosophila melanogaster. Ce manuscrit décrit des algorithmes pour le traitement automatique des données et une quantification objective des données de test de l’île, ce qui en fait une lecture sensible et à haut débit pour les grands écrans génétiques ou pharmacologiques de dosage.

Résumé

Percées dans les technologies de séquençage de prochaine génération contribuent à l’identification des gènes de maladies (candidat) pour les troubles du mouvement et d’autres maladies neurologiques à une vitesse croissante. Cependant, on connaît les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces troubles. La boîte à outils génétique, moléculaire et comportementale de Drosophila melanogaster rend cet organisme modèle particulièrement utile pour caractériser des gènes de maladies nouvelles et mécanismes d’une manière de haut débit. Néanmoins, écrans de haut débit nécessitent des tests efficaces et fiables qui, idéalement, sont rentables et permettent la quantification automatisée des traits pertinents à ces troubles. Le dosage de l’île est un rentable et facilement mise en place méthode pour évaluer le comportement locomoteur Drosophila . Dans ce test, les mouches sont jetées sur une plate-forme d’une hauteur fixe. Ceci induit une réponse motrice innée qui permet les mouches d’échapper à la plate-forme de quelques secondes. À l’heure actuelle, des analyses quantitatives des essais filmés de l’île sont effectuées manuellement, qui est une entreprise laborieuse, notamment lors de l’exécution de grands écrans.

Ce manuscrit décrit les algorithmes «Drosophile île Assay » et « Île test Analysis » pour le haut débit, traitement automatisé des données et la quantification des données de test de l’île. Dans la configuration, une simple webcam connectée à un ordinateur portable recueille une série d’image de la plate-forme alors que l’analyse est réalisée. L’algorithme «Drosophile île Assay » mis au point pour le logiciel libre Fidji traite ces séries d’images et quantifie, pour chaque condition expérimentale, le nombre de mouches sur la plateforme au fil du temps. Le script « Île test Analysis », compatible avec le logiciel gratuit R, a été développé pour traiter automatiquement les données obtenues et pour calculer si les traitements/génotypes sont statistiquement différentes. Grandement, cela améliore l’efficacité du test de l’île et rend une lecture puissante base locomotion et comportement de vol. Il peut donc être appliqué aux grands écrans enquête mouche capacité locomotrice, Drosophila modèles des troubles du mouvement et l’efficacité du médicament.

Introduction

Ces dernières années, les percées dans les technologies de séquençage de nouvelle génération ont grandement contribué à l’identification de gènes qui sous-tendent les dyskinésies dégénératives du cerveau (par exemple, une ataxie cérébelleuse et maladie de Parkinson), de périphériques neuronale origine (p. ex., la sclérose latérale amyotrophique et la paraplégie spastique héréditaire) et d’origine musculaire (par exemple, de dystrophie musculaire de Duchenne et la dystrophie myotonique)^1,2,3,4 . Malgré cela, on connaît mal les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la plupart de ces troubles. Une meilleure compréhension de ces mécanismes est essentielle à l’élaboration de thérapies.

Comme chez les humains, dans les organismes modèles, tels que le vol et de la locomotion chez la drosophile, est contrôlée par le cerveau central, système nerveux périphérique et les muscles. En outre, la durée d’une génération rapide et une boîte à outils génétique de la drosophile rendent cet organisme modèle particulièrement adapté pour le criblage à haut débit des gènes impliqués dans les troubles du mouvement et^{5,6 de dépistage des drogues} . En raison du nombre important de conditions qui doivent être testés dans ces écrans, fiables et rentables et dosages simples relatives, comme outils pour quantifier les résultats de sortie de façon automatisée, sont fortement souhaitables.

Schmidt et al. (2012) ⁷ décrit un test peu coûteux, appelé le « test de l’île » pour évaluer le comportement locomoteur de drosophile . Le dosage de l’île a été utilisé avec succès aux examens préalables à grande échelle pour identifier les gènes avec des fonctions spécifiques aux cellules gliales⁷, dans l’évaluation de modèles de drosophile de déficience intellectuelle⁸et pour l’évaluation générale de voler le comportement moteur⁹. La conception du principe de l’essai de l’île se compose d’une plate-forme surélevée, sur laquelle plusieurs mouches sont levées. Ceci induit un comportement moteur inné qui permet aux mouches sains d’échapper à la plate-forme de quelques secondes. Le test mesure le nombre de mouches restant sur la plate-forme au fil du temps^7,8,9. Toutes ces caractéristiques indiquent que l’île peut être un outil de dépistage puissant de gènes impliqués dans les troubles du mouvement.

Actuellement, l’analyse quantitative des données de test filmé de l’île se fait manuellement,^7,8,9. Afin d’améliorer l’efficacité du test, il a développé une méthode de faible coût pour semi-automatiquement quantifier l’évasion de mouches de la plate-forme. Le programme d’installation utilise une simple webcam connectée à un ordinateur portable pour collecter les temps image série de la plate-forme, avec des cadres acquis chaque 0,1 s. images sont ensuite traitées avec la macro «Drosophile île Assay » qui quantifie le nombre de mouches sur la plate-forme au-dessus temps. La macro «Drosophile île Assay » est divisée en trois macros sous indépendants : (I) la « pile de créer et de la projection, » Sub macro identifie des expériences différentes îles stockés dans différents sous-dossiers et crée une pile et une projection de chacun séries temporelles. (II) la macro sous « Définir la plateforme » ouvrira successivement tous les fichiers « Projection_image_name.tif » situés dans les différents sous-dossiers expérimentales, moment auquel l’utilisateur est invité à définir manuellement la plate-forme de l’île dans la région d’intérêt (ROI). (III) « analyse » quantifie automatiquement le nombre de mouches restant sur la plate-forme au cours de la série chronologique. Les macros sous peuvent s’exécuter consécutivement (en un seul passage) ou de façon indépendante. Pour l’analyse de données statistiques, un script a été développé pour traiter automatiquement les données obtenues et d’appliquer un test statistique pour déterminer si les traitements/génotypes se comportent sensiblement différents les uns des autres (Figure 1). Enfin, il est démontré que cette configuration permet d’évaluer et de quantifier la capacité locomotrice aberrante d’un modèle drosophile ataxie télangiectasie (AT).

Protocole

1. construction de la boîte de test île

1. Prepare un plateau réalisé dans un matériau robuste, comme poly méthacrylate de méthyle (PMMA), contiennent une couche d’eau (c.-à-d. un bain). S’assurer que le matériel n’est pas blanc.
   Remarque : Les Dimensions de 40 x 35 x 2,5 cm ³ sont recommandées ( Figure 1 a).
2. Préparer une boîte (42 x 38 x., 25 cm ³) faite d’un matériau solide, transparent, comme le PMMA, à placer autour de la baignoire pour empêcher les mouches de s’échapper dans l’espace de laboratoire. Placer un trou (20 x 30 cm ²) sur le côté latéral qui est assez grand pour l’expérimentateur facilement manipuler les flacons avec les mouches et les déposer sur l’île ( Figure 1 a).
3. Préparer une plate-forme surélevée, 10 x 15 x 2,5 cm ³ en dimension, faite d’un matériau imperméable (PMMA ou plastique) qui est étanche à l’eau.
   Remarque : Cette plate-forme est nécessaire pour avoir une surface uniforme blanche pour assurer le bon contraste pour l’analyse de l’image. La taille n’est pas nécessairement fixée, mais elle doit être suffisamment grand pour s’assurer que toutes les mouches initialement atterrissent sur la plate-forme et courez la chance de marcher dessus ( Figure 1 a).
4. Difficulté la plate-forme en soit dans le collage sur la baignoire ou en plaçant des poids ou autres objets lourds à l’intérieur de la boîte de la plateforme pour éviter des modifications positionnelles de la plate-forme au cours de la session expérimentale/tournage.

2. Configuration logicielle requise et Installation

1. Installation du logiciel d’enregistrement d’image.
   1. Logiciel de téléchargement-enregistrement d’images à enregistrer les séries d’images de l’île (voir la Table des matières) et installer le logiciel sur un ordinateur.
      Remarque : Le logiciel d’imagerie-enregistrement décrit dans le présent protocole est pris en charge uniquement par Windows. Une alternative pour les autres utilisateurs a été ajoutée à la Table des matières.
2. " Assay île drosophila " installation de la macro.
   1. Télécharger le " Drosophila île dosage " macro et le Fidji compatible version ¹⁰ (1.4 ou supérieure) depuis le site suivant : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
   2. Déplacer le curseur jusqu'à la " dosage île " répertoire et cliquez sur " vue. "
   3. Cliquez sur " Download All. " du contenu du dossier sera téléchargé dans un fichier .zip, décompressez le fichier téléchargé.
   4. Copie le " Assay.ijm de l’île de Drosophila " fichier dans " Fiji.app/plugins/directory. "
      Remarque : Lors du démarrage Fidji, le " Drosophila île dosage " macro s’affiche au bas du menu déroulant plugins.
3. " Île test analyse " script d’installation et de téléchargement. Site Web
   1. Télécharger R ¹¹ parmi les options suivantes : https://cran.rstudio.com. Installez-le sur un ordinateur.
   Studio
   2. R télécharger depuis le site suivant : https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Installez-le sur un ordinateur.
      Remarque : Le " analyse test île " script peut être exécuté avec R seulement. Studio R, avec son interface utilisateur plus facile, est présenté comme une étape alternative pour les utilisateurs inexpérimentés dans R.
   3. Télécharger le " île test analyse " script de la " Drosophila île dosage " répertoire sur le site Web suivant : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      Remarque : après l’étape 2.2, le " île test analyse " script peut également être trouvé dans le dossier décompressé nommé " île assay. "

3. Préparation des mouches qui seront essayés dans le dosage de l’île de

1. à frais virés en scène mouches pour chaque condition expérimentale sous froid ou anesthésie du dioxyde de carbone (CO ₂), comme décrit précédemment ¹³ (sur une période de 1 - 2 jours).
   1. Préparer un minimum de 3 flacons d’échantillon par condition expérimentale, chacune contenant environ 15 mis en scène les mouches. N’utiliser que vole avec les ailes intactes et qui sont de même âge et le sexe.
      Remarque : Pour les expériences décrites ici, exemple 5 fioles contenant 15 mouches mâles de génotypes w ^- ; Actine-Gal4 / + (contrôle) et w ^- ; Actine-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) ont été recueillis le jour de l’éclosion, vieillie pendant 4 jours et ont été utilisés pour effectuer le test de l’île. Arni, souches de contrôle et le pilote de l’actine-gal4 ont été extraites d’un film publicitaire source (voir la Table des matières).
2. Laisse les mouches à récupérer pour éviter les effets de l’anesthésie (au moins 1 jour lors de l’utilisation de CO ₂) avant de tester les mouches collectées lors de l’essai de l’île à l’âge de l’intérêt.

4. montage expérimental

Nota : voir Figure 1 b.

1. , Ajouter l’eau froide avec une petite quantité de savon pour le plateau de bain et positionner la plate-forme au milieu.
   NOTE : Le savon diminue la tension superficielle de l’eau ; les mouches qui touchent l’eau seront noieront. Cela empêche des quantités croissantes de mouches volant dans la zone au cours de la progression de la session expérimentale.
2. Placer la boîte transparente sur le dessus de la barre d’État et illuminer la plate-forme par dessus à l’aide d’une lampe.
   NOTE : Illumination de la plateforme est surtout nécessaire pour assurer le bon contraste vidéo. Une lumière de LED 12V ordinaire est appropriée pour cette.
3. La position de la webcam directement au-dessus de la plate-forme (en dehors de la boîte) et connectez-le à un ordinateur.
4. Créer de nouveaux dossiers sur l’ordinateur pour stocker les données expérimentales différentes avant l’expériences.
   1. Suivre la structure de l’exemple illustré dans la Figure 2 a pour créer les dossiers. Par exemple, si le protocole expérimental requiert tester deux génotypes avec cinq répétitions chaque, tout d’abord créer un dossier principal contenant la date de l’expérience. À l’intérieur du dossier principal, créez deux sous-dossiers (un par génotype). Dans les dossiers du génotype, créer cinq nouveaux sous-dossiers, un par réplicat.
      Remarque : Pour une analyse ultérieure, il est essentiel que les séries d’images correspondant aux expériences individuelles sont enregistrés dans des dossiers avec des noms uniques.

5. Configuration de paramètres vidéo dans le " Capture Device " Section de l’Interface

1. ouvert le logiciel d’enregistrement d’images et, moins la " Capture " onglet, cliquez sur " décomposée Images … " et sélectionnez la webcam appropriée comme le " Capture Device. "
2. placer une mouche morte sur l’île, régler les paramètres vidéo en cliquant sur le " des paramètres vidéo " boîte. Faites défiler les barres d’outils, réglage Luminosité, contraste et la couleur d’une manière telle que la mouche morte apparaît noire sur fond blanc ( Figure 2 b). Lorsque les réglages sont terminés, cliquez sur " Ok. "

6. Enregistrement et vidéo enregistrement paramètres de configuration dans le " Time-lapse " Section de l’Interface

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Ajuster les paramètres dans le " décomposée Movie Setup " pour enregistrer l’expérience comme un fichier .avi. Cliquez sur " parcourir …, " sélectionnez le répertoire où sera stocké le film, définissez le nom de la vidéo, puis appuyez sur " enregistrer. "
Remarque : le fichier vidéo n’est pas utilisé pour la quantification des données ; cependant, il pourrait être utile avoir une idée globale propos de l’expérience.

Ajuster les paramètres dans le " décomposée Movie Setup " section.

1. Dans la zone de compression, sélectionnez " code IYUV Intel " pour la compression vidéo et choisissez " prendre une image toutes les 0,1 secondes, " avec la " taux de lecture (images par seconde) : " à 10.
2. Sauver l’expérience de la série chronologique comme images .bmp en cliquant sur " avancé … " sélectionnez " créer une image .bmp pour chacune capturé image. " cliquez sur " parcourir. " sélectionner le même répertoire dans la " capture vidéo en AVI " fenêtre (comme choisie à l’étape 6.1), cliquez sur " ouvert, " et appuyez sur " Ok. "
   NOTE : Notez que, pendant l’expérience, les images sont stockées sous forme de fichiers .bmp (requis pour l’analyse des données). Le programme nomme les cadres comme " A " suivi par le numéro correspondant à la séquence de capture d’image (par exemple, " A_number.bmp ") ( Figure 2). Enregistrez toujours les images appartenant à différentes expérimentations dans un nouveau dossier pour s’assurer que les séries d’images préalablement enregistrées ne sera pas écrasé. Sachez que les images ne sont pas automatiquement enregistrées dans le même dossier que le fichier vidéo à moins que ce dossier est sélectionné sous " parcourir … " lorsque vous cliquez sur le " avancé " boîte.

7. Île de dosage et collecte de données

1. Appuyez sur le bouton Démarrer dans l’interface de Time-lapse image du logiciel enregistrement d’image pour démarrer l’enregistrement.
2. Appuyez sur le flacon expérimental contenant des mouches (étape 3) 2 - 3 fois pour que les mouches soient au fond de la cuvette. Rapidement enlever le bouchon du flacon et, avec un mouvement vigoureux, appuyez sur le flacon sur la plateforme afin que toutes les mouches tombent sur la plate-forme à la fois ( Figure 1).
3. Après environ 30 s, presse le " Stop " le bouton pour arrêter l’enregistrement.
   NOTE : Si toutes les mouches disparaissent de la plate-forme, l’enregistrement peut être arrêté plus tôt.
4. Enlever les mouches qui restent pendant 30 s sur la plate-forme à la main après l’arrêt de l’enregistrement de l’image.
5. Avant de procéder à l’enregistrement de l’expérience suivante, modifiez le répertoire cible pour les fichiers .bmp et films (voir la section 6).

8. Traitement de l’information : En cours d’exécution le " Drosophila île dosage " Macro

Remarque : Voir la Figure 1.

1. Exécuter le " créer pile et Projection " macro sous I à produire des piles et des projections concernant les séries d’images collectées.
   1. Start Fidji, cliquez sur " Plugins " dans la barre d’outils et a choisi " Assay île Drosophila " une nouvelle fenêtre apparaît dans le menu déroulant ;.
   2. Enter la " première image chronologiques identificateur " dans l’interface graphique macro.
      Remarque : Les cadres d’image enregistrée sont enregistrés comme " A-number.bmp " selon l’ordre dans lequel les images sont obtenues. Dans la " première image identificateur " interface macro, remplir le cadre avec le numéro attribué à la première image par le programme et avec l’extension de fichier. Remplir " première image identificateur " avec "-0001.bmp, " étant donné que la première image est appelée " A-0001.bmp " ( Figure 2). Au cas où les autres formats d’image (par exemple, .tiff ou .jpeg) sont générés par le logiciel de webcam, spécifiez l’extension de fichier correct de la première image en " première image chronologiques identificateur. "
   3. sélectionnez seulement le " créer la pile et la projection " sous macro, cliquez sur " Ok, " et sélectionnez le répertoire principal qui contient tous les sous-dossiers avec des expériences de dosage individuelles île.
      Remarque : Les fichiers .bmp dans chaque individu experiment les dossiers qui contiennent les " première image identificateur " seront traitées ultérieurement. Par défaut, deux nouveaux fichiers vont apparaître dans chaque sous-dossier de chaque expérience, appelé " Stack_image_name.tif " et " Projection_image_name.tif " ( Figure 1). Une fois que cette étape est effectuée, les fichiers .bmp peuvent être supprimés. Pile et projection des fichiers .tif contiennent toutes les données et sont suffisants pour une analyse ultérieure.
2. Exécuter le " plate-forme définir " II sous macro pour sélectionner l’emplacement exact de la plateforme.
   1. Ouvrir l’interface graphique de la " Drosophila île Assay, " sélectionner uniquement le " Define plate-forme " case à cocher et appuyez sur " Ok. "
   2. dans la " choisir un répertoire " fenêtre, sélectionnez le répertoire principal où sous-dossiers expérimentales sont stockés et appuyez sur " Select. "
      Remarque : le " plate-forme définir " recherche automatiquement les macros sous " Projection_image_name.tif " fichiers dans tous les sous-dossiers stockés dans le répertoire principal. Le " Projection_image_name.tif " image stockée dans le premier dossier, ainsi que deux fenêtres — " définir la plate-forme " et " Gestionnaire de ROI " — ouvrira.
   3. Sélectionner le " sélections polygone " outil dans la barre d’outils pour dessiner une sélection qui correspond à la plate-forme de l’île.
      Remarque : Il est très important d’exclure la délimitation de la plate-forme de la sélection. Voir Figure 2D.
   4. Après avoir sélectionné la plate-forme dans la première image, cliquez sur " Add " dans le " ROI Manager " fenêtre ; la zone sélectionnée apparaîtra dans la fenêtre Gestionnaire de ROI comme un ensemble de valeurs ( Figure 2D). Presse " Ok " dans la " définir la plate-forme " fenêtre. La macro va procéder à la prochaine projection.
   5. Cliquez sur les numéros ( Figure 2D) stockée dans la " Gestionnaire de ROI " fenêtre ; la précédente sélection, sera ensuite apparaissent automatiquement dans la projection d’image actuelle.
      NOTE : depuis l’île plate-forme est susceptible d’avoir la même taille et position lorsque les expériences sont effectuées dans une ligne (pour autant que la position de la webcam et l’île restent inchangées), il est utile stocker le ROI définissant la plate-forme dans le " ROI gestionnaire. " par Ce faisant, l’utilisateur va gagner du temps ; dans les projections à venir, il suffit de cliquer sur la sélection temporairement stockée dans le gestionnaire de ROI.
   6. Si la position de l’île a été légèrement déplacée par rapport à l’expérience précédente, régler la position de la sélection en un clic gauche dans le centre de la sélection et en faisant glisser la zone sélectionnée à la position requise.
   7. Si la sélection ne correspond pas avec la plate-forme, cliquez en dehors de la sélection et délimiter une nouvelle sélection pour la plate-forme à l’aide du " sélection polygone " outil. Stocker la nouvelle sélection dans le gestionnaire de ROI en cliquant sur " ajouter ; " une nouvelle sélection apparaîtra dans le " Gestionnaire de ROI " fenêtre qui peut être utilisé en permanence.
   8. Lorsque la sélection est ajustée, cliquez sur " Ok " dans la " définir la plate-forme " fenêtre et répéter la procédure jusqu'à ce que toutes les plates-formes sont définies.
      NOTE : Avis qu’une image binaire de la plate-forme correspondant à la zone délimitée du ROI en blanc sur fond noir, nommé " Platform_image_name.tif, " est apparu pour chaque image traitée dans le même sous-dossier expérimental comme la pile et de la projection les images produites à l’étape 8.1.3 ( Figure 1).
3. Définir la taille minimale de mouche.
   Remarque : Ce paramètre définit la taille minimale de mouche en pixels. Les particules qui sont plus petites que la taille minimale spécifiée seront exclus de l’analyse pour éviter les faux positifs à cause du bruit.
   1. Ouvrir une pile d’image créé par le " créer pile et projection " macro sous I.
   2. Convertir la pile d’image de 8 bits en cliquant sur Image > > Type > > 8-bit.
   3. Allez dans le menu, appuyez sur Image > > Adjust > > seuil, s’assurer que le " fond sombre " case est sélectionnée, puis appuyez sur " appliquer ; " une deuxième fenêtre appelée " seuil " apparaîtra. Cliquez sur " Dark background ", puis appuyez sur " Ok. "
      Remarque : une pile d’image binaire sera créée dans lequel les mouches sont définis en noir et la plate-forme en blanc. Quand ce n’est pas le cas, appliquer la " inverti " fonction en cliquant sur Edit > > inverser > > courir.
   4. Définir l’échelle pour détecter le nombre de pixels en cliquant sur Analyze > > échelle définie. Appliquer les paramètres suivants : distance en pixels = 1, la distance connue = 1 pixel aspect ratio = 1 et l’unité de longueur = pixel. Presse " Ok. "
   5. Sélectionnez le " baguette " outil (traçage) dans la barre d’outils et cliquez sur une mouche (point noir) présente sur la plate-forme. Appuyez sur ctrl + m (utilisateurs Windows) ou cmd + m (utilisateurs de Mac) ; un nouveau " résultats " fenêtre indiquera la zone de l’endroit sélectionné en pixels. Ce faire consécutivement pour plusieurs mouches et déterminer la taille minimale de mouche.
      Remarque : Lorsque vous exécutez la macro, définissez le " taille minimale de mouche " définissant la plus petite taille de mouche observées moins une marge de 10 %. ( figure 2E).
4. Exécuter le " analyse " macro sous III pour quantifier les mouches s’échappant de la plate-forme.
   1. Aller à la barre d’outils, sélectionnez " Plugins, " et a choisi le " Drosophila île Assay. "
   2. régler la " taille minimale de mouche " réglage selon la valeur définie à l’étape 8.3.
      Remarque : Utiliser la valeur définie dans seulement si étape 8.3 la configuration standard de " Minimum size mouche " entraîne l’exclusion de mouches qui étaient présents sur la plate-forme ou si la macro détecte le signal de fond oiseau.
   3. Dans le " nombre de mouches par flacon " définition, remplir le nombre maximal de mouches présentes dans les flacons pendant l’expérience complète. Par exemple, si une des expériences a flacons contenant 15 mouches, d’autres contenant 20 mouches et autres contenant 23 mouches, le " nombre de mouches par flacon " doit être indiqué comme 23.
   4. Sélectionnez le " Analyze " case et appuyez sur " Ok ; " un nouveau " choisir un répertoire " fenêtre apparaîtra. Sélectionnez le répertoire principal (avec tous les sous-dossiers et fichiers à l’intérieur) et appuyez sur " sélectionner. "
      Remarque : la macro va analyser toutes les images stockées dans les sous-dossiers tant qu’ils contiennent les " stack_image_name, " " Projection_image_name, " et " Platform_image_name " fichiers. La macro va traiter l’image après image. La sortie de macro se compose d’une pile d’image résultat binaire nommée “ result_stack_subfolder_name.tif ” et un fichier texte appelé " result_subfolder_name.txt, " qui apparaissent dans chaque dossier de données. le fichier texte (.txt) contient des mesures quantitatives correspondant à l’image de la pile et se compose de 9 colonnes. Le contenu de ces colonnes est résumé dans le tableau 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " correspond à l’image chronologiques d’une expérience, où les mouches détectés lors de l’expérience sont représentés comme des points noirs sur fond blanc ( Figure 1E).
   5. Inspecter soigneusement la pile résultat pour s’assurer qu’aucun artefact est survenu et que la macro a travaillé avec précision ( Figure 2F).
      NOTE : Exemples d’artefacts peuvent être des éléments d’images qui sont ne vole pas mais qui sont détectés comme tels par l’algorithme de segmentation d’image (faux positifs). Cela peut, par exemple, être en raison de la détection du signal de fond grâce à une sélection erronée du ROI.

9. Analyse de données à l’aide " île test analyse "

1. Structure les données comme indiqué dans la Figure 2 a à permettre une analyse avec le " île test analyse " script. Générer un répertoire principal avec des sous-dossiers, où chaque sous-dossier correspond à une condition expérimentale à analyser.
2. Dans les sous-dossiers, générer des dossiers qui contiennent les réplicats expérimentales indépendants ( Figure 2 a) et les fichiers results.txt produites par la " test d’île de Drosophila " macro.
   Remarque : Le " île test analyse " macro traitera toutes les conditions expérimentales, situées dans le répertoire principal à la fois.
Studio de commencer R ou R
3. . Cliquez sur le fichier > > ouvrir le fichier … dans la barre d’outils et sélectionnez le " île test analyse " script
   1. Installer le ggplot2 et le matrixStats paquets lorsque vous exécutez le " île test analyse " script pour la première fois. Tapez ce qui suit dans la fenêtre de la console :
      > install.packages("ggplot2"), entrez
      > install.packages("matrixStats"), entrer dans.
4. Spécifier l’emplacement de la sortie de données et l’analyse des fichiers dans le script. Insérer dans les lignes de script suivantes :
   1. rangée 16 : insérer le chemin vers le répertoire principal qui contient les expériences afin d’être analysées et comparées (l' Figure 2 a, c’est le chemin vers le " île dosage " dossier).
   2. Ligne 19 : Insérez le chemin d’accès au dossier où sont stockés les fichiers de sortie analyse.
      Remarque : Le répertoire indiqué dans la ligne 16 ne peut contenir les dossiers à analyser. Le script aussi fonctionnera pas correctement si les chemins d’accès insérés dans la ligne 16 et 19 sont les mêmes.
5. Exécuter le script en cliquant sur Code > > exécuter région > > tout exécuter à partir de la barre d’outils.
   NOTE : Notez que trois fichiers .csv et fichiers .txt qui en résulte ( Figure 1E) figurent dans le répertoire défini dans la ligne 19. Ce sont : (I) la " data_all_conditions.csv " fichier contient les données traitées correspondant à chaque condition expérimentale et les répliques expérimentales, organisés comme décrit dans le tableau 2. (II) les " statistiques summary.csv " fichier résume la moyenne, l’écart-type (SD) et l’écart-type de la moyenne (SEM) pour cent de mouches sur la plate-forme pour chaque condition expérimentale. (III) les " AUC.csv " fichier contient l’aire sous la courbe pour chaque répétition expérimentale. (IV) selon le nombre d’assignations présents dans le dossier principal, le script sera soit exporter un " Welch_t-test_results.txt " fichier (2 conditions) ou un " AUC_anova_results.txt " fichier (plus de 2 conditions), où les résultats de l’essai ou Analyse de la variance en comparant l’aire sous la courbe entre les conditions expérimentales est indiquée. Notez que les quatre différents types de fichiers d’image .tiff ( Figure 1E) apparaissent dans le chemin d’accès défini dans ligne 19. Ils sont appelés : " Name_Of_Data_Folder.tiff " (où Name_Of_Data_Folder représente le nom du dossier donné par l’utilisateur), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " et " AUC_anova.tiff. " des informations détaillées quant au contenu de ces graphiques se trouvent dans les résultats de représentant de ce manuscrit et à la Figure 3.

Résultats

Dans le protocole décrit, Drosophila île dosage sont acquises et traitées en trois étapes. Tout d’abord, la réaction de fuite de vol de Drosophila jetées sur le quai est enregistrée avec une webcam et stockée sous forme d’images .bmp individuels (sections 1 à 7 du protocole). Deuxièmement, la macro «Drosophile île Assay » (étape 8) traite les images, générer un fichier de texte « result.txt » (tableau 1), dans lequel le nombre d’objets détectés dans chaque trame est résumé et une pile d’image « Result_stack.tiff », qui montre les objets détectés dans la zone de la plate-forme dans chaque image. Troisièmement, le script « Île test Analysis » (protocole section 9) traite les données de la macro stockées dans les fichiers « résultats.txt » des expériences individuelles. Plusieurs étapes sont incorporés dans le script pour filtrer et combiner les données pour l’analyse statistique. La première image dans laquelle les mouches sont jetés sur la plate-forme est détectée et considérée comme point de temps 1. Les cadres antérieurs sont éliminés dans le dataset. 100 images suivent point 1 (correspondant à 10 s) sont sélectionnés pour l’analyse. Expériences dans lesquelles le nombre initial de mouches détectée sur la plate-forme est plus petit que 5 sont automatiquement exclus de l’analyse, en éliminant les résultats peu fiables des expériences de faible puissance. Expériences dans lesquelles le nombre initial de mouches détectée sur la plate-forme dépasse le paramètre « Nombre de mouches par flacon » plus une tolérance de 3 sont également exclus. Cela évite d’ensembles de données dans laquelle le bruit les particules ont été détectés par erreur d’oiseau. Le script puis calcule le pourcentage de mouches détectés pour chaque point dans le temps par rapport au plus grand nombre de mouches détectées dans la série. Erreurs dans datasets causée par les mouches marcher dans et hors le retour sur investissement (détecté comme une diminution suivie d’une augmentation du pourcentage de mouches sur la plateforme au fil du temps) sont automatiquement corrigées par les considérant comme toujours présents sur la plate-forme à des stades antérieurs . Tous les datasets répétées pour une certaine condition expérimentale qui n’existaient pas dans le répertoire principal sont combinés et exportés vers le fichier « data_all_conditions.csv ». Ses colonnes représentent les variables décrites dans le tableau 2. Le script sera également exporter un graphique linéaire pour chaque condition expérimentale, nommé d’après le dossier qui contient les données. Ce graphique montre le pourcentage de mouches restant sur la plate-forme au fil du temps (réaction de fuite de vol) pour l’expérimental réplique présent dans le dossier respectif ()Figure 3 a-B). La moyenne, SD et SEM pour chaque condition expérimentale sont calculés et résumées dans le fichier « Summary.csv statistiques ». Un ligne graphique appelé « Escape_response_all_conditions.tiff » montre la réaction de fuite de vol moyen pour jusqu'à 12 expérimentale des conditions présentent dans le dossier principalFigure 3) (). Enfin, l’aire sous la courbe pour toutes les conditions expérimentales présentes dans le dossier principal est calculé et résumée dans le fichier « AUC.csv ». Selon le nombre des conditions présentes dans le dossier principal, le script se soit produira un non apparié Welch t-test bilatéral (2 conditions) ou une analyse de la variance avec correction de Tukey pour plusieurs essais (plus de 2) déterminer si l’expérimental conditions diffèrent sensiblement les uns des autres. Ces résultats sont résumés dans « Welch_t-test_results.txt » ou « AUC_anova_results.txt. » Lorsque vous effectuez l’analyse de la variance, le script sera également exporter un fichier « AUC_anova.tiff » qui affiche la différence de l’ASC moyenne et les intervalles de confiance de 95 % des conditions expérimentales qui sont comparées. Les valeurs de l’absolu aire sous la courbe des répliques expérimentales pour toutes les conditions expérimentales sont affichés comme des points de données individuels avec médianes dans « AUC.tiff » (Figure 3D).

L’ataxie télangiectasie (AT) est une maladie autosomique récessive mouvement caractérisée par l’apparition précoce de l’ataxie cérébelleuse due à des mutations dans le gène de Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM)¹⁴. Mutants de l’orthologue de la drosophile de l' ATM, TFUE, affichent les défauts en mobilité et longévité¹⁵. Evaluer la macro «Drosophile île Assay », un modèle drosophile d’AT a été testé dans le dosage de l’île, et la sortie des données de la macro a été comparée à comptes manuelle des données. Les résultats montrent que omniprésent tefu knockdown (w^-; Actin-Gal4/GD11950) diminue de manière significative la capacité de ces mouches à quitter la plate-forme par rapport à leurs contrôles de fond génétique (w^-; Actin-Gal4/+) ()Figure 4). Après 1 s, 50 % des mouches contrôle avait échappé à la plate-forme, à la différence de la < 1 % de tefuRNAi - mouches. Ce qui est important, les données obtenues avec la macro fidèlement reproduit les données obtenues par Manuel comptage, ce qui indique que la macro est un outil fiable qui peut être utilisé pour la quantification des données de test de l’île et l’évaluation des défauts de mouvement ( ) Figure 4 A-B).

Figure 1 : organigramme décrivant les exigences, procédure expérimentale et analyse du dosage île. Équipement de dosage (A) l’île. (B) le montage expérimental pour l’analyse de l’île. (C) île de dosage. (D) traitement des données de test de l’île avec la macro «Drosophile île Assay ». La macro «Drosophile île Assay » est composée de 3 sous macros : 1) pile et projection, 2) définir la plateforme et analyse 3). (E) traitement et analyse statistique des données en utilisant le script « Île test Analysis ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : exemples de différents ajustements requis au cours du protocole. Structure de répertoires (A) requis dans quelle île des expériences de dosage doivent être stockés pour traitement des données et l’analyse. (B) lorsque vous ajustez les paramètres vidéo, mouches doivent figurer noir sur fond blanc. (C) fichiers de sortie de cadre d’Imagecomme enregistré par le logiciel d’enregistrement d’images décrit dans ce manuscrit. (D), le jaune contour affiche la sélection de la plate-forme. La sélection de plate-forme stockées dans le gestionnaire de « ROI » est surlignée en bleu. Mouches (E) sont représentés comme des points blancs lors de l’adaptation de la « configuration de taille minimale de mouche ». La fenêtre des résultats indique la zone des mouches en pixels. (F) exemple d’une trame unique image enregistrée (à gauche) et le cadre correspondant à la pile de l’image résultante, obtenu avec la macro «Drosophile île Assay » (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : images du résultat obtient après traitement des données avec le script « Île test analyse » (A) ligne graphique montrant la réaction de fuite de vol pour chaque contrôle expérimental répliquer. (B) ligne graphique montrant la réaction de fuite de vol pour chaque répétition expérimentale de RNAi TFUE. Réaction de fuite de vol moyen (C) pour des conditions expérimentales indiquées ; les barres d’erreur représentent les parcelles Dot SEM. (D) qui représente la surface sous la distribution de la courbe pour le contrôle et les conditions de mutant. Répliques expérimentales pour les deux conditions de RNAi et contrôle tefu apparaissent comme des points de données individuels (en noir) avec des médianes (ligne rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Omniprésent tefu knockdown mouches montrent une capacité une baisse significative de quitter la plate-forme. Les données représentent le pourcentage de mouches sur la plateforme au fil du temps (s) pour le contrôle (w^-; Actin-Gal4/+) et tefu Arni (w^-; Actin-Gal4/GD11950) vole. (nombre de répétitions = 5 ; les barres d’erreur représentent la SEM). (A) les données brutes obtenues avec la macro «Drosophile île Assay ». (B) Dot parcelles représentant la surface sous la courbe de distribution pour contrôle et tefu Arni conditions obtenues avec la macro «Drosophile île Assay » (Welch non appariés t-test, ** p < 0,01). (C) les données brutes obtenues en comptant manuellement le nombre de mouches présentes sur l’île par seconde. (D) Dot parcelles représentant la surface sous la distribution de la courbe pour Tefu RNAi conditions obtenues par comptage à la main et de contrôle (Welch non appariés t-test, ** p < 0,01). Les barres d’erreur représentent le SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nom de colonne	Description
Tranche	Nom de l’image.
Comte	Le nombre d’objets détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI).
Superficie totale	Superficie totale des objets détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI) en pixels.
Taille moyenne	Superficie totale des objets détectés dans le cadre divisé par le nombre d’objets dans les limites de la plate-forme (ROI).
% Secteur	Le pourcentage de la superficie occupée par les objets à l’égard de la superficie totale de la plate-forme (ROI).
Perim.	Périmètre total des objets détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI) en pixels.
Mouche taille min.	Le minimum fly réglage de taille définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay » (en pixels).
Zone de retour sur investissement	La zone de la plate-forme (ROI) définie par l’utilisateur pendant l’exécution de la macro sous définir la plate-forme (en pixels).
Nombre de mouches	Le nombre de mouches utilisées par expérience définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay ».

Tableau 1 : Paramètres mesurés par la macro «Drosophile île Assay ». Les paramètres décrits dans cette table apparaîtra dans le fichier « résultats.txt » lors de l’exécution de la macro «Drosophile île Assay ».

Nom de colonne	Description
Tranche	Numéro de la trame.
Comte	Le nombre de mouches détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI).
X.Area	Superficie totale des mouches détectés dans le cadre dans les limites de la plate-forme (ROI) en pixels.
Mouche taille min.	Le minimum voler le paramètre d’entrée de taille définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay » (en pixels).
Zone de retour sur investissement	La zone de la plate-forme (ROI, en pixels) définie par l’utilisateur lors de l’exécution de la macro sous « définir la plate-forme ».
Nombre de mouches	Le nombre de mouches utilisées par expérience définie par l’utilisateur dans l’interface graphique de la macro «Drosophile île Assay ».
X.Count	% les mouches présents sur la plate-forme de la tranche/le cadre respectif par rapport au nombre plus élevé de mouches détectée sur la plate-forme au cours de l’expérience.
Validant	Point dans le temps 1 représente la première image à analyser et correspond au frame où les mouches apparaissent d’abord sur la plate-forme. Il y a un total de 100 images par réplicat analysés (correspondant à 10 s, lorsque vous utilisez les paramètres décrits.
Experiment	Nombre de répétitions par État.
Condition	Indique le nom de la condition expérimentale (selon le nom du dossier contenant les données définies par l’utilisateur).

Tableau 2 : Description des variables obtenues après traitement des données avec le script « Île test analyse » Les paramètres décrits dans le présent tableau apparaissent dans le fichier « data_all_conditions.csv » sur le traitement des données avec le script « Île test Analysis ».

Discussion

Ce protocole décrit la macro «Drosophile île Assay » qui évalue quantitativement Drosophila comportement moteur pendant le test de l’île. La macro compte avec exactitude les mouches sur la plateforme au fil du temps, rendant le dosage de l’île, très sensible et très approprié pour l’évaluation quantitative de haut débit de défauts locomotrices. La méthodologie permet la comparaison de n’importe quelle condition, avec mouches cultivées dans différentes conditions génétiques et/ou environnementale, y compris une exposition au médicament. Cette indication est donc particulièrement utile comme outil de découverte lors de l’exécution des grands écrans génétiques ou pharmaceutiques, lorsque l'on étudie des modèles de drosophile de dyskinésies et d’autres maladies neurologiques, ou lorsqu’on examine la locomotion ou vol comportement.

Le protocole d’essai de l’île présenté dans ce manuscrit présente des avantages par rapport aux méthodes existantes et parallèles. Par exemple, la locomotion de suivi vidéo est beaucoup plus longues et moins approprié pour les essais de vastes échantillons. Le dosage de l’île est un outil de criblage à haut débit et, en ce sens, est comparable au test rapide géotaxie négative interactive (anneau)¹⁶. La différence entre les deux est que les dosages de l’île permet la détection d’une vaste gamme de problèmes locomoteurs ; l’incapacité des mouches de quitter la plate-forme peut être causée par les défauts en vol, saut, ou marche de comportement causés par aile (muscle/neuronale) et/ou de la jambe (muscle/neuronale) défauts. En revanche, l’essai de l’anneau évalue les défauts de comportement escalade, marche, causés par des défauts de la cuisse (muscle/neuronale). Dans le cas où les utilisateurs sont intéressés par plusieurs lectures comportementales, le dosage de l’île aussi facilement combinable avec d’autres tests, tels que l’essai de l’anneau. En outre, les lasers nécessaires à optogenetics peuvent être facilement installés dans la zone de test de l’île, et la configuration est tellement simple qu’il peut facilement être déplacé dans une pièce où la température et la lumière peuvent être contrôlés.

Pour assurer le succès et la reproductibilité du dosage île décrite ici, plusieurs recommandations devraient être suivies. Aliquote et transfert les mouches à l’épreuve expérimentale flacons au moins un jour avant l’expérience pour éviter les effets du CO₂ ou le froid anesthésie. Ne surchargez pas les flacons expérimentales (utilisation des mouches de 10-15 par flacon ; il est préférable de toujours placer le même nombre de mouches par flacon). Garder les mouches sur la nourriture fraîche à tout moment. Si ce n’est pas encore familier avec la tenue de l’essai, pratique jetant vole sur la plate-forme afin de maximiser le rendement. Pratiquent également de rétracter rapidement la main droite par la suite, car elle perturbe l’analyse des données (analyse d’images et mouche comptant démarrer qu’une fois la main hors de l’image). Garder les conditions expérimentales et environnementales identiques dans des expériences qui doivent être comparées (par exemple, des contrôles par rapport à des mutants ou un génotype testé à différents âges). Toujours effectuer les expériences à la fois de la journée et de maintenir les flacons sous température contrôlée et les conditions d’humidité. Pour la puissance statistique, tester au moins trois répétitions techniques par réplicat biologique.

Pour assurer l’exécution réussie de la macro décrite ici, paramètres de la webcam et l’image doivent être ajustées pour atteindre contraste maximal : vole apparaissant comme des objets noirs sur une plate-forme de blanche. Lorsque le nombre de mouches n’est pas correctement compté par la macro, ajuster les réglages de contraste, vérifier si le retour sur investissement est correctement sélectionné et faire en sorte que la taille des mouches sur la plate-forme est supérieur au minimum spécifié voler le reglage (voir étape 8.3 du présent protocole). Les paramètres doivent seulement être défini une fois. Elles sont applicables à toutes les expériences, tant que la distance entre la webcam et la plate-forme n’est pas modifiée. Les Circularity_min et les réglages max définissent la circularité des particules (particules = mouches comptés) qui va être pris en compte pour l’analyse (vole = objets comptés). 1 représente un cercle parfait, et 0 une ligne¹⁷. À moins que les mouches présentent toujours un certain degré de circularité (une mouche ne peut apparaître qu’une ligne droite), le « Circularity_max » est réglé à 1 et le paramètre « Circularity_min » est fixé à 0,4. Il est peu probable que l’utilisateur a besoin d’ajuster ces paramètres.

La macro fait parfois des erreurs de comptage quand une mouche se trouve à proximité de la frontière de la plate-forme. Cela peut se produire si les mouches ne peuvent pas voler à pied dans et hors le retour sur investissement défini par l’utilisateur. Dans la plupart des cas, resélectionnez le retour sur investissement (autant que possible à la plate-forme de montage) peut facilement résoudre ce problème. Toutefois, le script « Île test analyse » est capable de détecter et correcte de données incorrects comtes causée par le mouches marcher dans et hors le retour sur investissement relativement bien. Bien que la résolution de la webcam présentée ici est assez élevée pour discriminer les mouches à proximité assez bien, nous avons mis en place des algorithmes supplémentaires dans la procédure de traitement d’image de la macro «Drosophile île Assay », tels que la bassin versant et d’éroder la fonction¹⁷. Ces amendements facilitent la délimitation correcte des mouches qui se trouvent à proximité sur la plate-forme. En outre, la macro est incapable de distinguer entre les mouches qui a sauté de la plate-forme ou a volé loin de lui. Néanmoins, on observe généralement que des souches mouches jeunes en bonne santé s’envoler immédiatement lorsque déposé sur la plate-forme, tandis que les mouches plus âgés et les mouches avec déficits locomoteurs demeurer plus longtemps sur la plate-forme et finit par sauter ou tomber de la plate-forme. Malgré ces limites, le dosage et l’analyse fournissent une mesure très précise du comportement locomoteur.

Pour assurer une prestation réussie du script « Île test Analysis », l’utilisateur doit s’assurer d’entrer dans les chemins d’accès corrects pour les fichiers d’entrée et de sortie dans les lignes de script des dispositions figurant au protocole et à fournir les données dans le format de dossier approprié (comme il est indiqué dans la Figure 2). Si l’utilisateur constate les critères utilisés pour filtrer les données expérimentales fiables trop strictes (ligne 68 : la première valeur dans la colonne « Count » est inférieur ou égal à 5 ; ligne 71 : la première valeur dans la colonne « Nombre » est plus élevée que le nombre total de mouches jetés sur le platfo RM + 3), désactiver ces paramètres de filtrage en ajoutant un # devant le texte dans les lignes 68 et 71 dans le script « Île test Analysis ». Dans ce cas, tous les ensembles de données doivent figurer dans l’analyse. Alternativement, les réglages de filtre peuvent être changés en ajustant les valeurs des lignes 68 et 71 selon les besoins des utilisateurs. Artefacts possibles dans la valeur de comptage dans le « résultats.txt » généré par la macro «Drosophile île Assay » peuvent aussi être réglés manuellement, et le script peut être réexécutée sur les données ajustées. Lorsque l’utilisateur est intéressé par traitement de plus de 10 images par seconde, soit plus de 10 s de données, le nombre d’images traitées par le script « Île test Analysis » devraitêtre ajusté. L’analyse statistique peut également être remplacée par des équivalents définis par l’utilisateur.

Un dossier appelé « Exemples île Assay, » contenant des exemples avec temps-séries d’images obtenues à l’aide de l’essai de l’île, se trouvent à l’adresse Internet suivante : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Télécharger le dépliant « Exemples île Assay » et suivez les étapes décrites dans le présent protocole pour rapidement se familiariser avec la structure de stockage de fichiers, le traitement des images avec la macro « Dosage Drosophila Island » et le « analyse de test d’île » script.

Le dosage de l’île, en combinaison avec la macro développée et script analysis, peut être utilisé pour évaluer et quantifier le comportement aberrant de mouvement d’un modèle drosophile d’ataxie-télangiectasie. Étant donné que le dosage peut être efficacement appliqué à différents âges, il est bien adapté à l’analyse de la nature potentiellement progressive des phénotypes.

En résumé, le dosage de l’île, en combinaison avec la macro «Drosophile île Assay » et le script « Île test Analysis », est un dosage rentable, fiable et très efficace pour objectivement analyser et quantifier les défauts locomotrices de Drosophile modèles de dyskinésies de manière à haut débit.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.
Fiji	-	-	Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio	-	-	Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R	-	-	Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com