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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous démontrons une méthode pour imaginer des molécules multiples dans des nano-structures hétérogènes à une seule précision de la molécule en utilisant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps marqués par fluorescence.

Résumé

L'imagerie de structures cellulaires hétérogènes utilisant une microscopie de localisation à une seule molécule a été entravée par une précision de localisation insuffisante et une capacité de multiplexage. À l'aide de marqueurs fluorescents de nano-diamant fiducial, nous décrivons les procédures de correction de dérive et d'alignement requises pour obtenir une grande précision dans un microscope à localisation à une seule molécule. En outre, une nouvelle stratégie de multiplexage, madSTORM, est décrite dans laquelle de multiples molécules sont ciblées dans la même cellule en utilisant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps fluorescents. MadSTORM est démontré sur une cellule T activée pour visualiser les emplacements de différents composants dans une structure multi-protéine liée à la membrane appelée micro-cluster de récepteur de cellules T. En outre, l'application de madSTORM comme outil général pour la visualisation des structures multi-protéines est discutée.

Introduction

Une variété de techniques de microscopie de super résolution ont été développées pour surmonter la limite de diffraction du microscope optique (~ 200 nm). Parmi ceux-ci se trouve une catégorie de techniques appelées microscopie de localisation de molécules simples (SMLM) qui comprend la microscopie de localisation photo-activation (PALM) et la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM). Les techniques SMLM participent à l'utilisation de fluorophores qui peuvent être commutés entre des états fluorescents et des états décalés (numérisés ou numérisés), ce qui permet une localisation séquentielle de la fluorescence à partir de molécules 1 , 2 , 3 .

En raison de sa compatibilité avec les colorants et les microscopes disponibles dans le commerce, STORM direct (dSTORM) est devenu une technique SMLM largement adoptée 4 . DSTORM peut atteindre systématiquement une précision de localisation de ~ 10 nm, définie comme l'incertitude dans le calcul du centre d'un diffractFonction de propagation des points à limitation d'ions (PSF). Cependant, malgré la précision élevée estimée à l'aide des algorithmes de localisation 5 , 6 , 7 , une détermination précise de l'emplacement réel des molécules individuelles a été entravée par un certain nombre de problèmes. Tout d'abord, le mouvement mécanique du stade du microscope pendant l'acquisition de l'image ajoute une grande incertitude quant à la précision de localisation. Comme les images SMLM sont obtenues sur des milliers de trames temporelles, les mouvements en nano-échelle du stade du microscope peuvent compromettre de manière significative la précision de l'image finale de super résolution 8 . Pour compenser le mouvement de l'étape pendant l'acquisition de l'image, la dérive de l'étage est généralement estimée à partir d'un ajustement basé sur la régression des localisations binées de l'image elle-même (corrélation croisée) ou des localisations séquentielles des marqueurs fiduciaires (correction fiduciaire) 1 , 9 . HowevCes méthodes nécessitent l'optimisation de multiples paramètres pour chaque pile d'images et ne peuvent pas tenir compte des mouvements de l'étage à des échelles de temps courtes telles que des vibrations mécaniques. Les nanoparticules d'or et les perles fluorescentes multicolores ont été utilisés comme marqueurs fiduciaires dans le SMLM, mais ils ne sont pas stables à la photo et entraînent une précision nettement inférieure après la correction de la dérive que les nano-diamants fluorescents au centre d'inoccupation d'azote (FND) utilisés In madST 10 .

En plus de la limite de diffraction, le microscope optique est encore limité par des limites spectrales. La visualisation simultanée de multiples cibles nécessite des sondes fluorescentes avec des profils spectraux qui ne se chevauchent pas, limitant généralement le microscope optique à fluorescence à 6 couleurs et le SMLM à 2-3 couleurs 4 , 11 , 12 . En outre, l'aberration chromatique non linéaire provoque un désalignement des images multicolores, wQui nécessitent des procédures d'alignement étendues utilisant des marqueurs fiduciaires multicolores 8 , 13 . Pour surmonter ces limites, des études antérieures ont imaginé de multiples cibles en utilisant un photoblanchissement répétitif ou une trempe chimique des fluorophores liés aux séquences 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Bien que ces méthodes puissent surmonter les limites spectrales de la microscopie, le blanchiment par fluorescence est connu pour être un processus toxique 20 , et le blanchiment prolongé ou la trempe peut provoquer des effets secondaires indésirables tels que la perte de réticulation. En outre, l'accumulation de sondes fluorescentes pourrait conduire à un blocage stérique des sites de liaison dans l'échantillon, empêchant le multiplexage à grande échelle et le ciblage robuste des epitopes. Pour éviter de telles interférences stériques, un récent sLe multiplexage a eu lieu à l'aide d'un échange stochastique de fragments de protéines diffusant librement 21 . Alors que cette méthode permet un étiquetage dense des structures cellulaires, il nécessite une préparation biochimique étendue pour isoler les fragments de peptides, ne peut pas localiser des positions de molécules simples et ne facilite pas facilement le multiplexage à grande échelle en utilisant des sondes disponibles dans le commerce. Nous présentons un protocole vidéo détaillé décrivant la liaison séquentielle et l'élution d'anticorps fluorescents pour l'imagerie multiplexée, la technologie dSTORM (MadSTORM) limitée par l'anticorps et l'utilisation de nano-diamants fluorescents pour obtenir une correction et un alignement précis de la dérive.

Protocole

Attention: veuillez consulter toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et cancérogènes. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de l'exécution du protocole, y compris l'utilisation de commandes techniques (hotte aspirante, boîte à gants) et équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons complets, chaussures fermées).

1. Imagerie multiplexée de cellules T activées

  1. Conjuguer conjointement les anticorps avec le colorant Alexa-647 (A647) en utilisant le kit d'étiquetage des anticorps Alexa 647. Suivez le protocole d'étiquetage fourni par le fabricant.
    NOTE: La dialyse de la solution d'anticorps dans 1x PBS est recommandée avant cette étape pour augmenter l'efficacité de l'étiquetage des anticorps.
  2. Les anticorps marqués par centrifugation pendant 5 min à 20,800 rcf et recueillent le surnageant pour éliminer les anticorps agrégés.
  3. Préparation de lamelles fluorescentes nano-diamantées
    1. Revêtir les chambres à lamelles de 8 puits (voir la liste des réactifs / matériaux) avec 250 μL de Poly-L-Lysine 0,01% (PLL) pendant 15 minutes, aspirer et sécher à 65 ° C pendant 30 min. (Pas de rinçage avant le séchage).
    2. Préparez une dilution de FND de 100 nm dans 1x PBS. Testez diverses dilutions pour s'assurer que suffisamment de FND sont visibles dans chaque champ de vision à l'étape 1.2.7 (nous utilisons une dilution de FND de 1: 200 fournie par le fabricant).
    3. Vortex les FND dilués pendant 1 min.
    4. Sonicate le surnageant FND pendant 30 s à un réglage de puissance élevée.
    5. Incuber le surnageant FND soufflé dans une chambre à lamelles à 8 puits revêtue de PLL pendant 30 minutes à la température ambiante.
    6. Laver 5x avec 1x PBS et visualiser la chambre revêtue de FND en utilisant une excitation laser de 647 nm sur le microscope TIRF. Idéalement, 4-10 FND individuels devraient être visibles dans un champ de vision compte tenu de la dilution appropriée des FND à l'étape 1.2.2 (nous utilisons un objectif 100X avec un paramètre de pixel de caméra 256 x 256 pour donner un champ de vision de 61 x 61 μm) Avec àAu moins un FND présent dans chaque quadrant du champ d'imagerie. Si les FND semblent être regroupés ( c.-à-d. FND avec un signal significativement plus élevé que les FND environnants et une fonction de propagation de point supérieure à 200 nm), centrifuger les FND à 6,800 rcf pendant 1 min et répéter la procédure de revêtement en utilisant le surnageant FND.
    7. Ajouter 250 μl d'anticorps anti-CD3 (10 μg / mL) dans chaque puits et incuber pendant 1 heure à 37 ° C ou pendant une nuit à 4 ° C.
    8. Supprimez la solution et ajoutez 1x PBS pendant 30 secondes. Répétez cette étape de lavage 5 fois (lave 5x).
  4. Activation des cellules T Jurkat
    1. Faire tourner 1 ml de cellules Jurkat T à 800 rcf pendant 6 min et remettre en suspension dans 300 ul de solution 1x HBS. Les cellules T Jurkat devraient idéalement être à une concentration de 0,5-1,0 x 10 6 cellules / ml avant le filage. La solution 1x HBS consiste en une solution tampon HEPES avec 1% d'albumine de sérum bovin comme décrit précédemment 22 .
    2. Ajouter 150 μLDe solution 1x HBS dans chaque puits et incube à 37 ° C pendant 15 min.
    3. Ajouter 50 μL de cellules Jurkat T resuspendues à chaque puits et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
    4. Ajouter 300 μL de paraformaldéhyde à 4% à chaque puits et incuber pendant 30 minutes à 37 ° C.
    5. Laver 3x avec 1x PBS.
    6. Perméabiliser les cellules en ajoutant 250 μL de solution Triton-X 0,1% pendant 5 min à la température ambiante.
    7. Laver 3x avec 1x PBS.
    8. Ajouter 250 μL 1% de solution de gélatine de poisson dans 1x PBS à chaque puits pendant 30 minutes à température ambiante.
    9. Laver 3x avec 1x PBS.
  5. Imagerie active des cellules Jurkat T utilisant madSTORM
    1. Ajouter 200 μl d'anticorps marqué à 0,1-0,5 μg / mL à des cellules fixées pendant 1 heure à température ambiante.
    2. Laver 5x avec 1x PBS.
    3. Ajouter 1 ml de tampon STORM et recouvrir la chambre avec une lamelle de verre pour limiter l'exposition à l'air. Le tampon STORM a déjà été décrit 10 . Nous recommandons maKing nouveau tampon STORM pour chaque cycle d'imagerie et faire tourner le tampon STORM à 20,800 rcf pendant 2 min pour éliminer les précipités.
    4. En utilisant une faible puissance laser de 647 nm en mode TIRF, localisez une cellule colorée avec au moins 3 FND dans le champ de vision. Pour aider à localiser les FND, une excitation concomitante avec laser 568 nm peut être utilisée pour augmenter la luminosité du signal FND.
      NOTE: La performance de la correction fiducialisée moyenne décrite à la section 2.1 s'améliore avec l'inclusion de plus de FND.
    5. Augmenter la puissance laser de 647 nm et acquérir des images. Nous avons généralement 10 000 images à 200 ms d'exposition, laser de 125 mW à 647 nm, objectif 100X TIRF (1,49 NA), gain 100X EM (5 MHz à 16 bits, gain de conversion 1). Les détails de notre configuration d'imagerie ont été décrits précédemment 10 .
    6. Laver 5x avec 1x TBS.
    7. Ajouter 1 ml oF de tampon d'élution (MgCl2 3,5 M, PIPES 20 mM, Tween-20 à 0,1%, pH 6,5) et incubé à température ambiante pendant 1 min.
    8. Répéter l'élution 3 fois. (Les conditions d'élution exactes et le nombre de rinçages d'élution nécessaires pour éliminer le signal doivent être vérifiés pour chaque anticorps utilisé).
    9. Laver 3x avec 1x TBS et ajouter 1 ml de 1x PBS.
    10. Photoblek utilisant un laser 647 nm à haute puissance (125 mW) avec laser 405 nm à 2-5 mW pour photo-activer les colorants A647 à l'état sombre. Attendez que tous les signaux restants provenant d'anticorps non élués soient photoblanchés. Typiquement, cela prend 2 à 5 s d'exposition au laser. L'acquisition d'images d'échantillons (~ 100 images) en utilisant les paramètres STORM en 1.3.5 après élution et photoblanchage est recommandée pour confirmer la suppression du signal.
      Nous supprimons généralement 99,8% du signal en utilisant cette méthode. Nous recommandons de tester l'efficacité d'élution de chaque anticorps avant utilisation chez madSTORM comme indiqué précédemment 10 .
    11. Ajouter 250 μL de 4% de Paraformaldéhyde pendant 15 min. Ce prLes événements inversent la réticulation des molécules fixes dans la cellule.
    12. Laver 3x avec 1x PBS.
    13. Répétez les étapes 1.3.1-1.3.12 pour l'étiquetage séquentiel de plusieurs cibles. La figure 1 montre une image composite de molécules multiples dans une cellule T Jurkat activée acquise en utilisant madSTORM.

2. Correction de la dérive et alignement des piles d'images multiplexées

  1. Correction de la dérive des piles d'image madSTORM
    1. Ouvrez les images à l'aide de ImageJ. Nous vous recommandons de convertir les fichiers image sur un format TIFF avant d'ouvrir ImageJ. Utilisez le ROI rectangle pour sélectionner un seul FND. Jouez le laps de temps pour vous assurer que le FND est visible dans chaque image de la pile d'images. Utilisez Run Analysis dans le plugin ThunderSTORM pour localiser le FND. Pour la méthode de correction fiducial moyenne décrite au 2.1.5, il est important qu'un seul FND soit localisé dans chaque image ( c'est-à-dire que le nombre de pics identifiés devrait être eQual au nombre de cadres).
    2. Si le FND n'est pas identifié dans chaque image, sélectionnez un autre FND. Si plusieurs pics sont situés dans un cadre unique, retirez le pic qui s'écarte le plus des pics précédents.
    3. Répétez 2.1.2 pour chaque FND dans la pile d'images. Gardez à l'esprit que certains FND ne devraient pas être inclus dans le processus de correction de la dérive afin qu'ils puissent servir de jauge indépendant pour la précision de la correction de dérive comme décrit à l'étape 2.1.7.
    4. Pour une correction de dérive plus rapide et moins précise, utilisez les algorithmes de correction croisée ou de correction fiduciaire inclus dans ThunderSTORM pour corriger les images FND. En règle générale, nous utilisons 100 bacs, 5 grossissements et 0,1 facteur de lissage de la trajectoire pour la corrélation croisée et 10 distance max, rapport de visibilité du marqueur 0,1 min et facteur de lissage de la trajectoire 0,01 pour la correction fiducial. La corrélation croisée et la correction fiducial donneront un fichier de correction qui peut être appliqué à d'autres FND pour tester la précision de la correction de dérive.
    5. Pour une correction de dérive plus rigoureuse et plus précise, utilisez l'algorithme de correction fiducial moyenne (AFC) comme décrit précédemment 10 . Ce processus ne nécessite pas d'optimisation des paramètres et donne une précision de localisation supérieure à celle prévue par les algorithmes de localisation SMLM. Cependant, la correction moyenne de la dérive nécessite au moins 4 FND et pour que les FND soient localisés dans chaque image de la pile d'images. La correction de la dérive de l'AFC s'effectue mieux avec l'inclusion de plus de FND car un grand nombre de FND localisés diminue l'effet de distorsion d'un pic de dépassement dans une image donnée.
    6. Localisez toutes les fonctions de propagation de points dans la pile d'images en utilisant ThunderSTORM comme décrit précédemment 10 . Nous utilisons généralement une taille de pixel de 100 nm, des photoélectrons par compte A / D de 4,28, un nombre A / D de base de 100, un gain EM de 100, un PSF: une localisation gaussienne intégrée, un rayon de montage de 5 pixels, une méthode de montage à maximum de vraisemblance et 1,3 Sigma initial de pixel.
    7. Appliquer le facteur de correction de dérive acquis des FND à des localisations de l'ensemble de la pile d'images. Inspectez visuellement l'image finale pour assurer une bonne correction de la dérive ( Figure 2 ). Le facteur de correction de dérive résultant doit être testé de manière indépendante sur les FND non inclus dans la procédure AFC pour mesurer le niveau de précision de la correction de dérive. La précision des FND indépendants corrigés par dérive devrait être proche de la valeur moyenne de précision / incertitude calculée à partir de l'algorithme de localisation utilisé à l'étape 2.1.6.
    8. Répétez les étapes 2.1.1-2.1.7 pour les piles d'image madSTORM d'anticorps marqués séquentiellement. Gardez à l'esprit que la localisation du même ensemble de FND dans chaque pile d'images madSTORM est essentielle pour la procédure d'alignement suivante.
  2. Alignement des images madSTORM
    1. Calculez la position de centroïde des FND corrigés de la dérive dans chaque image de madSTORM. Pour ce faire, trouvez les axes x et y moyensPour chaque FND localisé, et moyenne des positions moyennes x et y de tous les FND dans chaque image madSTORM. L'algorithme détaillé pour cette étape a été décrit précédemment 10 . Alignez les images STSTORM séquentielles en utilisant les positions de centroid de marqueurs fiduciaires FND. Pour effectuer l'alignement, calculez le décalage entre deux images madSTORM localisées en soustrayant la position de centroïde des FND dans la seconde image madSTORM du premier. Soustrayez le montant du décalage de toutes les localisations dans la seconde image de madSTORM.
    2. Nous vous recommandons d'utiliser la première image madSTORM comme image de référence et de répéter cette étape d'alignement entre le premier et le troisième, le premier et le quatrième, etc. Testez la précision de l'alignement en mesurant le décalage entre les FND non inclus dans le processus d'alignement. De grands décalages peuvent indiquer que différents ensembles de FND ont été utilisés lors du calcul des positions de centroïdes des images séquentielles STSTORM.
    3. Dans l'affirmative, les étapes 2.2.1-2.2.2 shouLd doit être répété en utilisant le même ensemble de FND pour effectuer l'alignement.
      REMARQUE: Des codes personnalisés pour les procédures de correction de dérive AFC et d'alignement sont fournis.

Résultats

La méthode séquentielle d'élution et de coloration a été utilisée pour produire l'image madSTORM multiplexée de microclusters et d'autres structures dans une cellule T Jurkat activée ( Figure 1 , voir les alignements des figures). Chaque image pseudo-colorée représente une série d'imagerie madSTIME acquise aux étapes 1.1.1 à 1.3.13. Comme décrit précédemment 10 , le champ de vision doit être surveillé...

Discussion

Les procédures de multiplexage séquentiel, de correction de dérive et d'alignement dans madSTORM permettent une visualisation précise et hautement multiplexée des structures hétérogènes dans les cellules. 10 En outre, madSTORM évite les limitations de la STORM multicolore, telles que l'aberration chromatique et les propriétés de décodage / émission de photos non optimales des colorants non lointains 9 , 12 . Comme la ...

Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Xufeng Wu d'avoir accès au microscope STORM. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du Centre national de recherche sur le cancer (NCI) et l'Institut national du cancer du poumon et du sang (NHLBI).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
8 well coverslip chamberLab-tek155409
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
NV-100 nm Fluorescent Nano-diamondAdamasRed FND
anti-CD3ε antibodyBD Biosciences555329
Bovine serum albumin, Fraction VKSE Scientific98-100P
Triton-XSigma-AldrichT9284
10% ParaformaldehydeEMS15712Carcinogen
Gelatin from fresh water fish skinSigma-AldrichG7041
Alexa 647 antibody labeling kitThermo FisherA20186
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-Aldrich138924
PIPESSigma-AldrichP6757
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7154Highly toxic, air sensitive
CysteamineSigma-Aldrich30070Highly toxic
Cyclooctatetraene 98%Sigma-Aldrich138924Highly toxic, air sensitive
10x PBSKD MedicalRGF-3210
10x TBSKD MedicalRGF-3385

Références

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  2. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
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