Évaluation in vivo des propriétés mécaniques et viscoélastiques de la langue de rat

Résumé

Nous décrivons une intervention chirurgicale dans un modèle de rat anesthésié pour déterminer le tonus musculaire et les propriétés viscoélastiques de la langue. La procédure implique une stimulation spécifique des nerfs hypogloss et l'application de courbes de force / déformation passives de Lissajous au muscle.

Résumé

La langue est un hydrostat musculaire hautement innervé et vascularisé au sol de la bouche de la plupart des vertébrés. Ses fonctions principales comprennent le soutien de la mastication et de la déglutition, ainsi que la détection du goût et la phonétique. En conséquence, la force et le volume de la langue peuvent influer sur la capacité des vertébrés à accomplir des activités de base telles que l'alimentation, la communication et la respiration. Les patients humains atteints d'apnée du sommeil ont des langues agrandies, caractérisées par une réduction du tonus musculaire et une augmentation de la graisse intramusculaire qui peut être visualisée et quantifiée par imagerie par résonance magnétique (IRM). Les capacités de mesure de la génération de force et les propriétés viscoélastiques de la langue constituent des outils importants pour obtenir une information fonctionnelle en corrélation avec les données d'imagerie. Ici, nous présentons des techniques pour mesurer la production de la force de la langue chez les rats Zucker anesthésiés par stimulation électrique des nerfs hypogloss et pour déterminer les propriétés viscoélastiques oF la langue en appliquant des courbes de force / déformation Lissajous passives.

Introduction

La langue fournit un soutien essentiel pour la mastication, la déglutition, la détection du goût et la parole. La présence de musculature extrinsèque et intrinsèque, avec une innervation et une anatomie / fonction distinct, explique l'unicité de cet hydrostat musculaire. Les progrès récents dans les techniques d'imagerie ont fourni une vue plus détaillée de son anatomie complexe ¹ . La diminution de la fonctionnalité de la langue, de l'atrophie de la langue, de la dysphagie et des obstacles de la parole sont également des manifestations courantes des affections myopathiques telles que Parkinson ² , Sclérose latérale amyotrophique (ALS) ³ , Dystrophie myotonique (MD) ⁴ et d'autres myopathies.

Les modifications de la composition musculaire associées aux états pathologiques communs affectent les propriétés mécaniques et viscoélastiques de la langue. Par exemple, l'analyse fonctionnelle de la force de la langue a révélé des changements dans les propriétés contractiles associées au vieillissementSs = "xref"> 5 ^{, 6} , hypoxie ^{7 , 8} et obésité ^{9 , 10} . Dans le cas de la dystrophie musculaire, une fibrose accrue conduit à une plus grande rigidité musculaire, ce qui se traduit par une diminution de la conformité à la déformation lorsqu'un protocole de déformation Lissajous est appliqué ¹¹ . À l'inverse, les changements dans la teneur en matières grasses musculaires, comme ceux documentés chez les patients obèses, altèrent le métabolisme ¹² et les propriétés mécaniques du muscle squelettique ^{13 , 14} et prédisent augmenter la compliance musculaire à la déformation. L'augmentation de la graisse de la langue est également corrélée au développement de l'apnée obstructive du sommeil (OSA) chez l'homme ¹⁷ en augmentant le volume de la langue au point d'occlusion partielle des voies aériennes supérieures (apnée) ^{15 , 16} . SimEn particulier, les infiltrations de graisse de langue ont été documentées chez des rats Zucker obèses ¹⁰ , ce qui suggère que ce modèle est un outil précieux pour étudier les effets de l'infiltration de graisse sur la physiologie de la langue.

La force de la langue de mesure nécessite des techniques chirurgicales délicates pour isoler et stimuler bilatéralement les nerfs hypogloss ^{17 , 18} . De telles techniques ont été décrites précédemment chez les rats ^{5 , 17 , 19 , 20} , les lapins ²¹ et les humains ^{22 , 23} , mais avec des aides visuelles limitées à l'enquêteur. En raison de sa nature hautement technique, la disponibilité d'un protocole détaillé améliorerait considérablement l'accessibilité et la reproductibilité de cette technique. L'objectif de notre paradigme expérimental est de malMettre en place une technique valide et fiable pour mesurer la force et les propriétés viscoélastiques de la langue dans un modèle de rat. Pour ce faire, le rat est anesthésié, les nerfs hypoglossaux sont exposés et la trachée est canulée pour assurer un accès gratuit à la langue de l'animal. Une boucle de suture relie alors la pointe de la langue à un transducteur de force, capable de contrôler à la fois la force et la longueur, tandis que deux électrodes de crochet bipolaire stimulent les nerfs hypogloss pour induire une contraction de la langue. Une fois la mesure de la force terminée, les capacités de contrôle de la longueur du transducteur de force sont utilisées pour changer rapidement la longueur de la langue, selon un protocole de sinusine avec amplitude fixe (courbes Lissajous), durée et fréquence, permettant de dériver Ses propriétés viscoélastiques ^{11 , 24} . Le protocole guidera l'enquêteur à travers les étapes de dissection, le positionnement de l'animal sur le platus expérimentalRm, placement des électrodes, et enfin à l'acquisition et à l'analyse des données de force et de viscoélasticité.

Protocole

Toutes les procédures, y compris les sujets d'origine animale, ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Pennsylvanie (numéro de protocole 805822). La procédure décrite est terminale et ne nécessite pas l'utilisation de conditions aseptiques ou de produits pharmaceutiques.

1. Procédures chirurgicales

Figure 1: Procédures chirurgicales.
(A) Démarche du plan chirurgical. La ligne pointillée rouge indique la zone de l'incision. Deux lignes noires indiquent la position de la mâchoire, tandis que la ligne noire inférieure marque la position du thorax. La ligne bleue indique l'os hyoïde. (B) Exposition du ventre postérieur du muscle digastrique (flèches) après une dissolution émoussée du tissu adipeux, la sublinguale et la sous-masse Glandes ary. (C) Résection du ventre postérieur du muscle digastrique (ligne verte pointillée) pour exposer le nerf hypoglosse (flèche blanche). (D) Le nerf hypoglosse (flèche blanche) est dégagé du fascia environnant. (E) La trachée est exposée en écartant doucement le muscle lisse autour de lui (les flèches vertes indiquent la direction de la force appliquée) et sont soulevées (F) pour se préparer à l'intubation. L'étoile indique l'insertion de la langue à l'os hyoïde. La ligne pointillée verte marque le point d'incision pour l'intubation. La flèche blanche indique le noeud lâche préparé pour sécuriser la canule en place une fois inséré. (G) Incision de la trachée pour la canulation. (H) La canule trachéale est insérée et sécurisée en place avec un noeud carré. (I) Application de la suture à la langue.Target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Anesthésie et préparation à la chirurgie
   1. Placez le rat dans la chambre d'induction avec 4% d'anesthésie isoflurane.
   2. Collez l'animal en décubitus sur une source de chaleur et maintenez l'anesthésie avec 1 à 3% d'isoflurane à partir d'une pointe de nez, assurant un taux respiratoire d'au moins 70 respirations par minute.
   3. Raser la zone du cou avec une crème d'épilation et d'épilation. Lorsque vous utilisez la crème anti-épilation, étaler la crème avec un applicateur à coton jusqu'à ce que la fourrure soit enlevée. L'exposition prolongée à la crème capillaire peut provoquer une irritation de la peau.
   4. Nettoyez le champ chirurgical avec 70% d'alcool ( Figure 1A ).
   5. Vérifiez le motif de respiration et les réflexes de l'animal (manque de réflexe de pincement) avant de procéder à l'incision initiale. Le suivi et l'évaluation continue de la profondeur de l'anesthésie sont essentiels (reFréquence respiratoire du cordon et manque de réflexes toutes les 10 min); L'animal doit être sous un plan chirurgical profond de l'anesthésie pendant toute la procédure.
2. Identification des nerfs hypoglossaux
   1. Ouvrez le champ chirurgical avec une paire de ciseaux opérationnels en réséquant et en enlevant la peau comme indiqué par la ligne à pointes rouges de la figure 1A .
   2. Une dissolution brutale à travers un tissu adipeux, les glandes sublinguale et sous-maxillaire et la couche musculaire entourant la trachée.
      REMARQUE: Soyez prudent pendant la dissection. Utilisez une dissection émoussée chaque fois que possible et faites attention de ne pas endommager les vaisseaux sanguins du cou.
   3. Identifiez le ventre postérieur du muscle digastrique (PD) latéral à la trachée ( figure 1B - flèches blanches). Le nerf hypoglosse court sous ce muscle ( Figure 1C - flèche blanche). Avec l'électrocauterie, résiste au PD proxImal à l'os hyoïde ( Figure 1C - ligne pointillée).
      REMARQUE: Ne laissez pas le nerf ou le tissu autour de lui devenir sec. Ajouter une goutte d'huile minérale sur le nerf pour la protéger. Pour éviter la contraction musculaire due à la propagation sur le champ du stimulus des électrodes, caoutler soigneusement le tissu musculaire dans les endroits de contact possibles autour du nerf.
   4. À l'aide d'une pince fine, dissérez le nerf hypoglosse du fascia environnant. À l'aide d'un crochet, assurez-vous qu'au moins 3 mm du nerf sont disponibles pour la connexion de l'électrode bipolaire ( Figure 1D ).
   5. À l'aide d'une pince micro-hémostatique, écraser le nerf hypoglosse distalement de l'os hyoïde ( figure 1D - flèche blanche) pour éviter la propagation rétrograde du stimulus. Éclatez le nerf en exerçant une pression sur le pinceau micro-hémostatique pendant 5 s. Lorsque l'hémostatique saisit le nerf, un bref tSorcière à la base de la langue devrait être visible.
   6. Répétez la procédure pour l'autre côté.
3. Intubation trachéale
   1. Exposez la trachée en séparant doucement les muscles lisses environnants par une dissection émoussée ( Figure 1E - comme indiqué par les flèches vertes).
      REMARQUE: soyez prudent et utilisez une dissection préférentiellement émoussée. Comparez le diamètre de la canule avec celui de la trachée. La canule doit s'insérer correctement dans la trachée et doit rester insérée de manière stable après avoir été suturée comme décrit aux étapes 1.3.2 à 1.3.5.
   2. Soulevez doucement la trachée à l'aide d'une pince serrée et passez une suture 4-0 en dessous, près du thorax. Attachez un nœud lâche initial entre le 6ème et le 7ème anneau du larynx ( Figure 1F - flèche blanche). Ce noeud sera fermé une fois que la canule sera insérée pour le maintenir en place.
   3. Glissez la tige d'unTransférer la pipette (lubrifier la pipette avec de l'huile minérale pour faciliter l'insertion) sous la trachée pour la soulever et faciliter l'insertion de la canule (IV 14 gx 3.25 "canule).
   4. Couper une petite incision entre les 4ème et 5ème anneaux du larynx ( Figure 1G - flèche blanche). Après la première incision, l'ouverture tend à se répandre, donc soyez prudente lors de la coupe initiale afin d'éviter la résection complète de la trachée.
      REMARQUE: Avant d'effectuer l'incision de la trachée, assurez-vous que la canule est prête et la livraison de l'anesthésie est activée.
   5. Commencez l'administration d'anesthésie à travers la canule et insérez-la doucement dans l'incision, avançant doucement à l'intérieur de la trachée jusqu'à environ 5 anneaux. Fixez la canule en place avec la suture, pour créer un joint étanche à l'air ( Figure 1H ).
      REMARQUE: Assurez-vous qu'aucun fluide n'entre dans la trachée coupée afin d'éviter le suffixeOcation. Une fois la trachée incisée, l'animal respire l'air ambiant. Il est donc important d'insérer rapidement la canule afin que la livraison de l'anesthésie soit maintenue. Quand / si vous déplacez l'animal, surveillez la position correcte de la canule dans la trachée.
   6. Retirez délicatement l'animal de l'ourson.
      REMARQUE: L'utilisation d'anesthésiques injectables au lieu de l'isoflurane peut simplifier la procédure en éliminant la nécessité d'une intubation trachéale et en éliminant l'espace de travail expérimental de l'excès de tubes.
4. Suture de la langue
   1. Faire tremper un morceau de 5/0 de 20 cm de long (nous suggérons Silk, tressé noir) dans PBS.
   2. Tout en maintenant la bouche du rat ouverte, tenez doucement la pointe de la langue avec la pince à serrer.
   3. Passez la suture à la direction médiale à travers la pointe de la langue ( Figure 1I - flèche blanche) en prêtant attention à garder la langue humide avec de la solution saline pour éviter les tissus potentielsdommage.
   4. Attachez une boucle d'environ 4 cm de largeur (le diamètre peut changer en fonction de la distance entre l'animal et le transducteur de force).
      REMARQUE: Assurez-vous que la suture et la langue sont humides pour faciliter l'insertion et éviter les lésions inutiles du tissu.

2. Configuration expérimentale

Figure 2: Positionnement et sécurisation de l'animal.
(A) La souris est positionnée sur la plate-forme expérimentale. La mâchoire est sécurisée et la bouche maintenue ouverte par l'application d'une tension verticale (flèche verte). La boucle de suture est connectée au transducteur de force (flèche blanche). (B) Les électrodes sont connectées. (C) Chaque électrode, montée sur un micromanipulateur, est reliée de manière stable au nerf. L'incrustation montre la fin de tIl accroche l'électrode. (D) La longueur optimale de la langue est mesurée avec un étrier Vernier, de l'insertion au niveau de l'os hyoïde jusqu'à la pointe de la langue. Dans cette image, les électrodes ont été retirées pour plus de clarté. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Remarque: Placez l'animal en position couchée sur le plateau chauffant de l'appareil, en utilisant les mesures de sécurité suivantes pour éviter tout mouvement pendant l'expérience.

1. Fixez le nez du rat au plateau avec une torsion métallique revêtue de plastique directement reliée à la plate-forme chauffée ( Figure 2A , 2B ).
2. Maintenir la bouche du rat ouverte en appliquant une tension verticale (utilisez une ligne de monofilament d'essai à trois voies et aligné sur 9 kg et maintenez-la en place avec une caméra) ( Figure 2A - flèche verte).
   NOTE: Une autre approche pour stabiliser le rat est d'utiliser un gag de bouche de rongeur ou une modification personnalisée de celui-ci. Il est essentiel que la bouche soit maintenue ouverte et stable pour éviter les mouvements du cou qui pourraient affecter la qualité des mesures.
3. Connectez la boucle de suture au transducteur de force ( Figure 2A - flèche blanche).
4. En utilisant un ruban chirurgical, immobiliser les membres et l'abdomen du rat pour limiter les mouvements pendant les stimulations.
5. Appliquer les deux électrodes bipolaires de crochet stimulant aux nerfs hypogloss disséqués, à proximité du site d'écrasement ( Figure 2C ).
   1. Utilisez des électrodes bipolaires stimulantes faites sur mesure à partir d'une paire d'électrodes à aiguille calibre 29 d'acier de qualité chirurgicale, maintenues ensemble à une distance de 2 mm l'une de l'autre à l'aide d'un support plastique (ici, on a utilisé deux pipettes sérologiques de 1 mL enregistrées).
   2. Pliez les pointes des électrodes à aiguille à une forme de crochetAssez petit pour former un contact stable avec le nerf (~ 1 mm de diamètre) ( Figure 2C - incrustation).
   3. Connectez les deux fils de chaque électrode à un élément de liaison double empilable avec prise jack banana x BNC, puis connectez-vous au module stimulateur d'un système de test musculaire in situ (tableau 3) à l'aide d'un diviseur BNC.
      REMARQUE: Assurez-vous que l'animal est stable et que le cou et la langue sont alignés sur le levier du transducteur de force. Continuez à surveiller la fréquence respiratoire et assurez-vous que les contraintes n'interfèrent pas avec la respiration.

3. Longueur optimale (L ₀ ) et détermination maximale de la force isométrique

1. Réglez progressivement la longueur de la langue et appliquez des stimulations de contraction isométriques jusqu'à obtention d'une force maximale.
   1. Définir L ₀ comme la longueur à laquelle la force de contraction isométrique ( Tableau 1 ) est maximale et enregistrer pour la normalisation ultérieure deLes mesures de force, comme cela change pour chaque animal. À l'aide d'un étrier Vernier, mesure la longueur de la langue de l'insertion au niveau de l'os hyoïde ( Figure 2D ) jusqu'à la pointe de la langue.
      REMARQUE: le positionnement correct des électrodes est essentiel pour assurer un contact optimal avec les nerfs. Le positionnement optimal devrait exercer des forces similaires et additifs lors de la stimulation de l'un des deux nerfs ou des deux, respectivement.
2. Avant de commencer l'expérience, connectez les deux électrodes au stimulateur et administrez un test de stimulation tétanique ( tableau 1 ). Pendant cette contraction, surveillez l'animal pour s'assurer que le positionnement est stable et vérifiez les contractions visibles indésirables des muscles du cou.
3. Mesurer la force isométrique en appliquant une contraction suivie de 20 s par une stimulation tétanique. Répétez les stimulations 3 fois permettant une récupération de 4 minutes entre les cycles de stimulation (un cycle comprend une contraction et une surE stimulation tétanique), et enregistrer les forces maximales de contraction et de tétanos.
4. Maintenir la langue humide en tout temps en appliquant quelques gouttes de PBS entre les contractions.
   REMARQUE: Si les muscles du cou se contractent, modifiez soigneusement le positionnement des électrodes de sorte qu'elles ne touchent aucun tissu musculaire environnant et, si nécessaire, cautérisent le tissu en contact avec les électrodes.

4. Détermination des propriétés viscoélastiques (courbes de Lissajous)

1. Laisser reposer la langue pendant 3 à 5 minutes après la détermination de la force isométrique. Effectuez les courbes de Lissajous à partir de L ₀ , donc la position de l'animal et du transducteur de force ne doit jamais être modifiée.
2. Sans stimuler les nerfs hypogloss, appliquer des cycles d'étirements passifs ( tableau 2 ) avec un déplacement croissant (d) soit 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50% de L ₀ (des amplitudes plus élevées peuvent nécessiter un double Contrôleur de mode avec higheR valeurs d'excursion que le 305C-LR). Par exemple, une amplitude de 40% L ₀ entraînera une déformation de la langue de + 20% L ₀ à -20% L ₀ .
   1. Utilisez une fréquence sinusoïdale fixe de 2 Hz avec 10 répétitions dans chaque cycle, pour une durée totale de 5 s chaque cycle. Des changements de la fréquence des sinus ont été utilisés dans le passé avec des tissus tels que le diaphragme ²⁴ et pourraient être adoptés pour modifier le protocole expérimental.
   2. Attendre 30 s entre chaque cycle et s'assurer que la langue est humide pendant toute la procédure.
      REMARQUE: garder la langue mouillée pendant la procédure en ajoutant quelques gouttes de PBS. Assurez-vous que la retenue qui maintient la mâchoire reste stable pendant les étirements, en particulier lorsque le déplacement atteint 40% ou plus.
3. Immédiatement après l'achèvement de l'expérience, alors que l'animal est toujours sous un plan chirurgical profond d'anesthésie, éuthaniser l'animal selon le prototype animal approuvé par l'IACUCOcol. Dissectez la langue pour un traitement ultérieur ( c.-à-d. Sectionnement ou stockage congelé pour analyses biochimiques).

Résultats

Figure 3: Résultats représentatifs.
(A) Exemples de traces réussies de la contraction et de la force tétanique. La stimulation correspondante est représentée par la trace rouge. (B) Exemple de contractions tétaniques de langue infructueuses dus à une contraction sous-maxime (trace bleue) et à une stimulation indirecte des muscles du co...

Discussion

Des changements dans le métabolisme et / ou la composition de la langue, par exemple l' infiltration de la graisse de la langue en raison de l'obésité, devraient prédire les changements quantifiables des paramètres évalués par notre protocole. La quantification de la force de la langue est d'un grand intérêt car un déséquilibre entre l'activité protrusive et rétrusive ou l'affaiblissement général de la langue peut entraîner l'occlusion de la voie aérienne supérieure

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SurgiSuite (heated Surgical tray)	Kent Scientific	SurgiSuite-LG	Includes heated platform
LED Lighting and Magnification Kit	Kent Scientific	SURGI- 5003
RC2 Rodent Circuit Controller	VetEquip	922100
Isoflurane	Butler Schein Animal Health Supply	29405
Alcohol Prep	Webcol	6818
Cotton-tipped applicators	MediChoice	WOD1002
Hair clipper	Conair
Hair remover lotion	Nair
Medical tape	Transpore	3M
D-PBS	Corning	21-030-CM
Operating Scissors	World Precision Instruments	503717-12
Hemostatic Forceps	Merit	97-458	Any tissue forceps can be used instead
Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS	World Precision Instruments	504479
Suture Tying Forceps	Fine Science Tools	18025-10
Blunt Micro Hook	Fine Science Tools	10062-12
Microhemostat	Fine Science Tools	12075-14
Thermal cautery	WPI	501292	Disposable cauteries are available at lower cost
IV 14g x 3.25" cannula	BD	B-D382268H	For tracheal cannulation
Braided silk non-absorbable suture size 4-0	Harvard Apparatus	SP104	For stabilization of the tracheal cannula
Braided non-absorbable silk 5/0 suture	Surgik LC, USA	ESILRC15387550	For suturing the tongue
Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire)			For securing the rat's nose to the platform
Camera stick
3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line	Berkley		For securing the jaw and maintaining the mouth open
Camera stick with adjustable angle			For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open.
in situ Muscle Test System	Aurora Scientific	809C	This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used.
Dual-Mode Muscle lever (force transducer)	Aurora Scientific	305C-LR	309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/
Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge)	AD Instruments	MLA1204	300C is recommended for use in mice.
Magnetic Stands	World Precision Instruments	M10	Used for making the bipolar stimulating hook electrodes
Kite Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	KITE-R and KITE-L	Require a steel plate
Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack	McMaster Carr	6704K13
Carbon fiber composites digital caliper	VWR	36934-152