Laser Doppler : Un outil pour mesurer les îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire In Vivo

Résumé

Îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire régule la distribution de sang îlot et maintient la fonction physiologique des cellules β des îlots. Ce protocole décrit en utilisant un moniteur Doppler laser pour déterminer l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire in vivo et d’évaluer les contributions de la microcirculation des îlots pancréatiques de maladies liées au pancréas.

Résumé

Comme un état fonctionnel de la microcirculation, vasomotricité microvasculaire est importante pour la livraison de l’oxygène et les nutriments et l’élimination du dioxyde de carbone et les déchets produits. L’altération de la vasomotricité microvasculaire pourrait être une étape cruciale dans le développement de maladies liées à la microcirculation. En outre, les îlots pancréatiques fortement vascularisé est adapté pour soutenir la fonction endocrine. À cet égard, il semble possible d’en déduire que l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire pourrait affecter la fonction des îlots pancréatiques. Analyser les changements pathologiques de l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire pourrait être une stratégie possible pour déterminer les contributions que microcirculation îlots pancréatiques rend aux maladies connexes, telles que le diabète sucré, pancréatite, etc.. Par conséquent, le présent protocole décrit à l’aide d’un contrôleur de flux de sang Doppler laser pour déterminer l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire et d’établir des paramètres (y compris la perfusion sanguine moyenne, amplitude, fréquence et parent Vitesse de la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques) pour l’évaluation de l’état fonctionnel microcirculatoire. Dans un modèle de souris diabétiques streptozotocine, nous avons observé un état fonctionnel avec facultés affaiblies des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire. En conclusion, cette approche d’évaluation des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire in vivo peut révéler des mécanismes relatifs aux maladies d’îlots pancréatiques.

Introduction

En tant que paramètre de l’état fonctionnel de la microcirculation, vasomotricité microvasculaire assume la responsabilité de la livraison et l’échange d’oxygène, les nutriments et les hormones et est essentielle à l’élimination des produits métaboliques, tels que le dioxyde de carbone et les déchets cellulaires ¹. la vasomotricité microvasculaire réglemente également la distribution du débit sanguin et la perfusion tissulaire, ce qui affecte locale artérielle microcirculatoire et réponses à l’inflammation, qui peut induire un oedème dans de nombreuses maladies. Par conséquent, vasomotricité microvasculaire est extrêmement importante de maintenir la fonction physiologique des organes^2,3,4, tissus et cellules. L’altération de la vasomotricité microvasculaire pourrait être une des étapes clés dans le développement de maladies liées à la microcirculation⁵.

Laser Doppler a été initialement développé pour l’observation et la quantification dans le domaine de la microcirculation recherche⁶. Cette technique, ainsi que d’autres approches techniques (p. ex., laser speckle⁷, oxygène transcutanée, etc.), a été considérée comme la méthode de référence pour évaluer le débit sanguin dans la microcirculation. La raison d’être que la perfusion sanguine de la microcirculation locale (c.-à-d., capillaires, artérioles, veinules, etc.) peut être déterminée par les appareils équipés de laser Doppler, repose sur le principe de l’effet Doppler. La longueur d’onde et la fréquence de la lumière de l’émission stimulée changent lorsque les particules de lumière rencontrent émouvante globules dans les microvaisseaux, ou qu’ils restent inchangés. Par conséquent, dans la microcirculation, le nombre et la vitesse des globules sont les facteurs clés concernant l’ampleur et la distribution des fréquences de la lumière Doppler décalé, alors que la direction du flux sanguin microvasculaire n’est pas pertinente. À l’aide de différentes méthodes, une variété de tissus ont été utilisés pour des études microcirculatoires, y compris les mésentères et dorsale du pli cutané chambres de souris, rats, hamsters et même les humains⁸. Toutefois, dans le protocole actuel, nous nous concentrons sur le fonctionnel statut des îlots pancréatiques microvasculaire vasomotricité, qui est évaluée à l’aide de laser Doppler et un système d’évaluation maison de paramètre.

Microcirculation îlots pancréatiques est principalement composée d’îlots pancréatiques microvaisseaux et présente des caractéristiques distinctives. Un réseau capillaire des îlots pancréatiques montre une densité cinq fois plus élevé que le réseau capillaire de son homologue exocrine⁹. Fournissant un conduit pour la livraison de l’entrée de glucose et d’insuline diffusion, des cellules endothéliales des îlots livrent l’oxygène aux cellules métaboliquement actives dans îlet cellules β. En outre, des preuves nouvelles démontre également que l’îlot microvaisseaux interviennent non seulement dans la régulation de l’expression des gènes d’insuline et survie des cellules β, mais aussi en affectant la fonction des cellules β ; promouvoir la prolifération des cellules β ; et en produisant un certain nombre d’angiogénique vasoactifs, substances et facteurs de croissance¹⁰. Par conséquent, à cet égard, nous en déduisons que l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire peut affectent la fonction des cellules β îlot et s’impliquer dans la pathogenèse des maladies comme la pancréatite aiguë/chronique, le diabète et autres maladies liées au pancréas.

Analyser les changements pathologiques de l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire pourrait être une stratégie possible pour déterminer les contributions de la microcirculation des îlots pancréatiques pour les maladies mentionnées ci-dessus. Une procédure pas à pas détaillée décrivant l’approche afin de déterminer la vasomotricité microvasculaire îlots pancréatiques en vivo fournir ici. Mesures typiques apparaissent alors dans les Résultats de représentant. Enfin, les avantages et les limites de la méthode sont mises en évidence dans la Discussion, ainsi que de nouvelles demandes.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été exécutés dans le respect de toutes les directives, de règlements et les organismes de réglementation. Le présent protocole en démonstration a été réalisé sous la direction et l’approbation de l’Institut de Microcirculation Animal éthique Comité (IMAEC) à la Peking Union Medical College (PUMC).

1. les animaux

1. Avant le début de l’expérience, garder trois souris BALB/c par cage, à température contrôlée (24 ± 1 ° C) et humidité (55 ± 5 %), selon un cycle lumière-obscurité de 12 h. Laissez les souris libre accès à la nourriture et l’eau.
2. Au hasard de diviser les souris dans un groupe témoin non diabétiques et un groupe de diabétique. Peser chaque souris individuels et calculer le volume d’injection à l’aide de la masse corporelle de chaque souris.
3. Rapide des souris pendant 4 h avant l’injection de streptozotocine (STZ) et fournir de l’eau ordinaire comme d’habitude le jour expérimentale 1.
4. Préparer un tampon citrate de sodium 0,1 M à pH 4,3. Mettre 1 mL de la solution dans un tube de microtubes de 1,5 mL et envelopper le tube de microcentrifuge en papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière.
5. Dissoudre la STZ dans un tampon citrate de sodium (pH 4.3) à une concentration finale de travail de 5 mg/mL avant utilisation.
6. Donner les souris des groupe diabétique des injections intrapéritonéales de STZ à une dose de 40 mg/kg à l’aide d’une seringue de 1 mL et une aiguille 25 G. Injecter les souris du contrôle non diabétiques avec le même volume de tampon citrate de sodium (pH 4,3).
7. Remettre les souris dans les cages et leur fournir nourriture et eau à 10 % de sucrose.
8. Répétez les étapes 1,3-1,7 expérimental jours 2 à 5 (c.-à-d., les 4 prochains jours consécutifs).
9. Remplacer l’eau de 10 % de saccharose eau ordinaire après la dernière injection de STZ.
10. Vite les souris pendant 6 h, mais leur donner libre accès à l’eau et mesurer leur glycémie neuf jours plus tard (experimental jour 14). Prélever un échantillon de sang de la veine caudale pour confirmer l’hyperglycémie en utilisant un système de surveillance glycémie.
    Remarque : Les souris avec le glucose de sang niveaux > 200 mg / dL sont considérés comme diabétiques.

2. préparation de l’Instrument

1. Nettoyer les surfaces optiques de pointe de la sonde et le connecteur de la sonde de l’appareil Doppler laser avec un chiffon doux et non abrasif pour enlever la poussière et les particules. Branchez le câble dans le port de l’instrument (Figure 1 a).
2. Monter le support de calibrage en permettant le flux standard d’être en équilibre thermique avec un cadre expérimental (température de la pièce, généralement pendant 30 min). Secouer le flux standard doucement pendant 10 s et laissez reposer pendant 2 min.
3. Placer le conteneur standard de flux dans le milieu de la base de l’étalonnage. Ajuster le collier à la hauteur maximale et fixer la sonde dans la pince tels qu’il pointe vers le bas vers le conteneur. Veillez à ce que la norme de flux est correctement positionnée sous la sonde.
4. Abaissez lentement la sonde jusqu'à ce que la pointe soit correctement immergée dans la norme de flux. Sélectionnez et appuyez sur « calibration » sur le laser Doppler appareil et choisir le canal de travail relié à la sonde. Exécutez le programme d’étalonnage jusqu'à ce qu’un avis « Calibration réussie » s’affiche sur l’écran du laser appareil Doppler.
5. Fixer la sonde à l’aide de porteurs de sonde. Manuellement fixer la sonde pour éviter tout mouvement.
6. Maintenir la chambre expérimentale à température constante (24 ± 1 ° C) et humidité (~ 50-60 %).
7. Éteindre toute lumière extérieure (tels que les lampes fluorescentes et spots) avant d’effectuer l’expérience afin d’éviter le changement induit par la lumière externe.

3. préparation des animaux

1. Autoclave le surgical instruments et laissez-les refroidir à température ambiante avant utilisation.
2. Donner les souris 10 min pour s’acclimater à l’environnement expérimental avant détection des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire par laser Doppler.
3. Remplissez une seringue de 1 mL avec 1 mL de sodium pentobarbital à 3 %. Injecter la solution de pentobarbital sodique (75 mg/kg i.p.) pour anesthésier les souris.
4. Couvrir les yeux de la souris avec une lingette gaze médicale pour prévenir le dessèchement.
5. Veiller à ce que la souris complètement perd conscience et ne répond plus aux queue ou arrière-pied pince avec une pince. Surveiller l’anesthésie tout au long de l’événement anesthésique et peropératoire chaque 15 min. maintenir l’anesthésie en la complétant avec 10 % du volume initial d’injection de la solution de pentobarbital lorsque cela est nécessaire.
6. Placez un coussin chauffant avec une couche semi-isolant au-dessous de l’animal et mettre l’animal en décubitus dorsal et transférer dans la station de travail du laser appareil Doppler. Fixer la souris vers la plate-forme de travail avec du ruban chirurgical.
7. Écouvillon de la peau abdominale de la souris avec la bétadine, puis 75 % d’éthanol est utilisé pour tamponner la zone abdominale propre.
8. Injecter par voie sous-cutanée à 2 % lidocaine/0.5% bupivacaïne mélange (50/50).  Couper un ~ 3 cm-trou de diamètre au centre d’un tampon de gaze. Couvrir la région abdominale avec le tampon de gaze.
9. Soulever la peau abdominale avec une pince et faire une incision verticale initiale le long de la ligne médiane de l’abdomen à l’aide d’une paire de ciseaux scalpel ou peau.
10. Saisir le muscle sous-jacent avec une pince et inciser pour entrer dans la cavité abdominale. Ne pas blesser un quelconque des organes. Pliez la peau et le muscle sous-jacent au-dessus de la poitrine pour révéler la cavité abdominale. Doucement, exposer le corps du pancréas et la rate à l’aide d’une paire de pince nez émoussé.

4. données Acquisition pour analyse

1. Lancez le logiciel de l’appareil Doppler laser en cliquant sur « Fichier » → « Nouveau » pour créer un nouveau fichier de mesure. Pour configurer les moniteurs connectés, sous l’onglet « Général », mis en place la surveillance durée « Gratuite courir. » Utilisez la valeur par défaut de l’usine pour l’onglet « LDF Monitor » cliquez sur « Suivant ».
2. Configurer l’affichage graphique dans la « boîte de dialogue Configuration affichage ». Sélectionner les canaux de la « Vitesse de Flux, Conc, » en cochant les cases respectives. Sélectionnez les paramètres suivants : « Source de données pour le canal » et « Label, unités et couleur. » Cliquez sur « Suivant ».
3. Entrez les informations sur le sujet et la mesure (par exemple, nom et numéro de l’objet, opérateur, suivi des temps, commentaires, etc.) dans la « boîte de dialogue des informations des fichier » et cliquez sur « Suivant » pour terminer la configuration de la mesure.
   NOTE : Une fenêtre de mesure est créée automatiquement par le logiciel (Figure 1 b).
4. Manuellement, faire progresser l’électrode au pancréas. Assurez-vous que la distance entre les sonde et le pancréas tissus ne dépasse pas 1 mm. Une distance inappropriée donne une lecture de flux de sang artificiellement augmenté ou diminué.
5. Cliquez sur l’icône de barre d’outils « Start » pour commencer à enregistrer les données d’unités (PU) de perfusion sanguine microvasculaire. Collecter les données de l’unité centrale en continu pendant 1 min chaque course. Cliquez sur « Stop » pour arrêter la mesure. Sélectionnez « Fichier » → « Enregistrer sous » au nom et enregistrez le fichier de la fin.
6. Repositionner manuellement la sonde après chaque course pour éviter les effets additifs et l’épuisement localisé des contractile et capacité de relaxation. Répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour récolter des données de PU microvasculaires multipoint (c'est-à-dire trois choisis au hasard points de tissu pancréatique) pour chaque souris. Mesurer les données d’unité centrale d’une plaque non réfléchissantes comme un contrôle de base.
7. Fermer la couche musculaire abdominal et la couche de la peau avec une suture. Placer les animaux dans des cages propres après les expériences.
8. Garder la chaleur animale en plaçant la cage de récupération moitié-sur le coussin chauffant.
   Remarque : Faites attention à la chaleur, hygiène, fluide et la prise alimentaire et l’infection. Administrer les souris à 2 mg/kg carprofène pendant 48 h comme la gestion de la douleur postopératoire.  Effectuer l’euthanasie par injection i.p. de pentobarbital sodique de 150 mg/kg lorsque les souris sont observés pour être dans un état de douleur ou de détresse qui ne peuvent pas être soulagée.

5. calculer les paramètres de la vasomotricité microvasculaire

1. Utiliser la commande « Export » du laser Doppler logiciel pour exporter l’heure et les données brutes d’unité centrale sous forme de fichier *.xlsx et ouvrez le fichier dans une feuille de calcul.
2. Calculer l’appareil de perfusion de base moyen (PU_b) (voir étape 4.6).
3. Calculer la moyenne la perfusion sanguine (PU_un) pendant 1 min d’une mesure comme suit : la perfusion sanguine (PU_un) en moyenne = PU - PU_b (équation 1).
4. Calculer la fréquence (cycles/min) pour chaque 1 min de mesure.
   Remarque : La fréquence de la vasomotricité microvasculaire est définie comme le nombre de pics qui s’est produite dans une vague de la vasomotricité microvasculaire par minute.
5. Calculer l’amplitude (ΔPU) pour chaque 1 min de mesure.
   1. Calculer l’amplitude de la vasomotricité microvasculaire comme la différence entre (PU_max) maximale et minimale (_minde PU) : Amplitude (ΔPU) = PU_max - PU_min (équation 2).
6. Calculer la vitesse relative (PU) pour chaque 1 min de mesure.

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Résultats

Une photo du laser mesure microvasculaire vasomotricité Doppler appareil équipé d’une diode laser de semi-conducteur est montrée dans la Figure 1 a. Logiciel d’interface utilisateur est présenté dans la Figure 1 b. À l’aide de la méthode susmentionnée, les paramètres hémodynamiques des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire ont été détectées chez les souris diabétiques et non diabétiques témo...

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Discussion

Dans les cas qui impliquent la dysfonction microvasculaire (p. ex., diabète, pancréatite aiguë, les affections périphériques microvasculaires, etc.), certaines maladies conduisent à une diminution du débit sanguin. Outre les changements dans la circulation sanguine, il y a des indicateurs importants, tels que la vasomotricité microvasculaire, qui reflètent l’état fonctionnel de la microcirculation. L’indicateur spécifique, la vasomotricité microvasculaire, est généralement défini comm...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MoorVMS-LDF2	Moor Instruments	GI80	PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software	Moor Instruments	GI80-1	Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration base	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
Calibration flux standard	Moor Instruments	GI-cal	Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer	Johnson and Johnson	#1955685	Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips	Johnson and Johnson	#1297006	Confirm hyperglycemia
Streptozotocin	Sigma-Aldrich	S0130	Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Working concentration 3 %
Ethanol	Sinopharm Inc.	200121	Working concentration 75 %
Sucrose	Amresco	335	Working concentration 10 %
Medical gauze	China Health Materials Co.	S-7112	Surgical
Blunt-nose forceps	Shang Hai Surgical Instruments Inc.	N-551	Surgical
Surgical tapes	3M Company	3664CU	Surgical
Gauze sponge	Fu Kang Sen Medical Device CO.	BB5447	Surgical
Scalpel	Yu Lin Surgical Instruments Inc.	175C	Surgical
Skin scissor	Carent	255-17	Surgical
Suture	Ning Bo Surgical Instruments Inc.	3325-77	Surgical
Syringe and 25-G needle	MISAWA Inc.	3731-2011	Scale: 1 ml