Échographie dans des enquêtes de reproduction expérimentales chez le rat

Résumé

Ce manuscrit décrit l’utilité de l’échographie effectuée sur les rats femelles pour concevoir des modèles expérimentaux pour reproduction et gynécologique enquête. Une explication détaillée de la façon d’effectuer une évaluation échographique est montrée.

Résumé

Avec le développement de techniques de reproduction assistée et les limites éthiques de la recherche sur les êtres humains, des modèles animaux de rat ont été couramment en médecine de la reproduction. Dans le passé, l’étude du développement du système reproducteur chez les rongeurs a reposé sur un examen histologique des tissus excisés ponctuel. Récemment, avec le développement de l’échographie transabdominale à haute résolution, échographie de haute qualité peut désormais être effectuée afin d’évaluer les organes reproducteurs des rats, ce qui permet une nouvelle méthode pour étudier le système reproducteur. Images ont été obtenues à l’aide d’un système haute résolution échographique. Échographie gynécologique a effectué 28 huit semaines non-gestantes et 5 rates Sprague-Dawley. Nous décrivons comment reconnaître les organes du système reproducteur et des structures connexes dans des vues typiques au cours des différentes phases de l’oestrus cycle. Couleur des flux que Doppler a été utilisée pour mesurer le débit sanguin de l’artère utérine et d’évaluer les changements de modèle pour le débit sanguin utérin au cours des différentes étapes de la grossesse. Nous avons démontré que l’exploration de l’échographie est une méthode utile pour évaluer les changements dans les organes reproducteurs internes. Son utilisation soulève la possibilité de mener des expériences additionnelles, y compris les procédures médicales ou chirurgicales et offre la possibilité de suivre l’évolution échographique aux organes internes sans pour autant sacrifier les animaux.

Introduction

Modèles animaux rat ont été largement utilisées en médecine de la reproduction, y compris dans l’embryon et de l’ovaire transplantation^1,2. Toutefois, dans le passé, l’étude du développement du système reproducteur chez les rongeurs a reposé sur un examen histologique des tissus excisés ponctuel, et l’étude longitudinale des variations quotidiennes d’organe reproducteur n’a pas été possible à des rats,³. L’échographie a été largement utilisé dans les techniques de reproduction assistée chez les humains depuis plus de 30 ans, mais cette précieuse technologie n’a été appliquée récemment à des rats.

Notre objectif était d’établir une approche échographique pour évaluer les organes reproducteurs des rats Sprague-Dawley pour concevoir des modèles expérimentaux pour reproduction et gynécologie d’investigations et de démontrer la procédure parce qu’à notre connaissance, Il n’y a aucune publication visualisée actuelles au sujet de cette procédure. Nous décrivons la procédure de l’examen échographique du système reproducteur de la femelle rat et résultats échographiques sur l’anatomie et le débit sanguin de l’artère utérine en utilisant des ultrasons de haute définition. Nous avons mesuré les caractéristiques de l’endomètre, des ovaires et des flux sanguin artères utérines chez les femmes non enceintes animaux à différents stades du cycle oestral afin d’évaluer les différences significatives dans l’épaisseur de l’endomètre, de la morphologie ovarienne et de débit sanguin utérin dans différentes étapes du cycle oestral, semblable aux femmes. Nous avons utilisé un appareil à ultrasons de haute qualité avec une fréquence de 70 MHz et un niveau de résolution de 30 µm. Notre autre objectif était d’évaluer les changements dans la résistance du débit sanguin utérin chez des rates gravides. Cette technique permet l’étude des variations quotidiennes dans les organes reproducteurs sans sacrifier les animaux.

Il y a plusieurs difficultés techniques en utilisant des ultrasons sur les rats. Ces difficultés incluent : l’endomètre de rat est beaucoup plus mince qu’un humain femelle⁴. Difficulté dans les ovaires des rats d’imagerie a été attribuée à peau plus épaisse et la musculature de la paroi abdominale chez le rat, qui a abouti à atténuation quasi-complète de l’échographie à⁵, et de l’artère utérine est beaucoup plus difficile de trouver des femmes enceintes rats. Nous avons résolu de nombreux problèmes techniques avec la procédure, et pour ces problèmes qui persistent, nous montrons comment minimiser.

Surveillance réussie des changements échographique dans les organes reproducteurs des rats sans avoir à sacrifier les animaux ouvrira la possibilité de construire des futurs modèles animaux de médecine de la reproduction et d’autres interventions chirurgicales.

Protocole

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, de la National Institutes of Health et conformément à l’arrivée (Animal Research : Reporting des expériences In Vivo) lignes directrices. Le protocole a reçu une licence pour se conformer à la Directive 2010/63/UE, avec le numéro d’autorisation A13170404 (Anexo 1) de l’expérimentation animale. Toutes les expériences ont été effectuées dans un laboratoire certifié Union européenne suite à des directives nationales pour le soin éthique des animaux (RD 53/2013, l’UE Directive 63/2010). Le protocole a été approuvé par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Murcia.

1. la préparation animaux

Remarque : Toutes les expériences appuyés par l’Animal Experimentation Section de Murcia Université et Université de département de gynécologie de Murcie et d’obstétrique.

1. Utiliser 8 semaines rats Sprague-Dawley (28 rates) pesant 200-250 g dans toutes les expériences.
   Remarque : Ici, nous avons également utilisé 5 rates gravides.
2. Pour obtenir des rates gravides, huit semaines des rats mâles femelles et fertiles en cage et s’accouplent de 17:00 -23:00 h. Identification d’un bouchon vaginal le lendemain matin a été interprété comme accouplement succès. Examiner le 1er jour de la gestation, le jour suivant après que qu’ils ont été accouplés.
3. Réaliser les expériences à 9, 15 et 18 jours de gestation.
4. Maison des rats par groupes de deux avec libre accès à la nourriture et l’eau et maintiennent sur les cycles de lumière/obscurité régulier 12 h.
5. Après acclimater aux conditions facilité pour un minimum de deux semaines, utiliser la cytologie vaginale quotidienne du matin à évaluer pour la régularité et la fréquence de l’oestrus.
   Remarque : Vingt-huit rats avec une phase d’oestrus régulière 4 à 5 jours ont été sélectionnés pour inclusion dans l’étude.

2. préparation des Rats pour l’imagerie

Remarque : Les Images ont été obtenues à l’aide de l’échographie transabdominale à haute résolution. Phases du cycle oestral ont été déterminées par la cytologie frottis vaginal.

1. Avant l’étude d’imagerie, anesthésier le barrage dans la chambre de l’induction au gaz isoflurane 2 à 3 %.
2. Enlever l’animal immédiatement mettre le museau dans un cône de nez connecté au système de l’anesthésie et maintenir l’animal sur l’isoflurane 1,5 à 2 % lors de l’examen échographique.
3. Enlever la fourrure du rebord costal à l’abdomen caudal avec les clippers et crème dépilatoire.
4. Placez le rat anesthésié en position couchée sur une table chauffée pour sécuriser le rat et assurer un confort optimal et le maintien des paramètres physiologiques pendant la durée de la séance d’imagerie. Tous les paramètres physiologiques doivent être intégrées avec les images et les données saisies en temps réel via l’application d’ultrasons.
5. Insérer délicatement la sonde rectale (après lubrification) pour surveiller la température du corps (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
6. Placer le transducteur (30 Hz) dans un support fixe et le déplacer le long de l’axe vertical et axe horizontal (en avant vers l’arrière et côté) à l’aide d’un joystick actionné manuellement ou à la main.
7. Appliquer à base de pétrole ophtalmique baume pour les yeux du rat pour éviter le séchage au cours de la procédure.

3. procédure d’examen

Remarque : Anatomie des organes reproducteurs rats´ : le vagin se trouve dorsal à la vessie et se divise en deux cornes utérines qui s’étendent vers les reins. Les ovaires sont reliés aux cornes utérines via les oviductes (Figure 1). L’utérus est situé dans la région postérieure aux reins.

1. Identification de l’utérus
   1. En utilisant la vessie comme un point de repère pour trouver le col de l’utérus, suivez le col de l’utérus pour trouver la succursale des cornes utérines droite et gauche.
   2. Placez-vous dans deux dimensions Regarde un vidéo en sélectionnant le mode « B ». Mesurer le diamètre antéro-postérieur de chaque corne utérine dans la région mid-Isthmiques sur une image de la ligne médiane sagittale. Détecter des mesures en utilisant le logiciel système échographique.
   3. Mesurez l’épaisseur de l’endomètre d’échogène frontière à frontière échogène dans la cavité endométriale sur une image de la ligne médiane sagittale en mode « B ».
   4. Passer en mode Doppler couleur en sélectionnant « Doppler couleur ». Color Doppler permet d’identifier le flux sanguin de l’endomètre et de mesurer le flux sanguin de l’endomètre. Sélectionnez les paramètres suivants en mode Doppler couleur : filtre passe-haut fixé à 4 Hz, ensemble de fréquence pulsée répétition entre 4 et 48 kHz et Doppler pulsé porte situé entre 0,2 et 0,5 mm.
2. Identification du flux sanguin de l’artère utérine
   1. Obtenir Doppler de signaux dans l’artère utérine, près de la marge latérale inférieure de la jonction utéro-cervical à proximité de l’artère iliaque sur chaque côté.
   2. Utilisez les paramètres suivants en mode Doppler : filtre passe-haut fixé à 6 Hz, ensemble de fréquence pulsée répétition entre 4 et 48 kHz et Doppler pulsé porte situé entre 0,2 et 0,5 mm.
   3. Prendre soin d’aligner le débit sanguin et le faisceau Doppler pour minimiser l’angle Doppler. Enregistrer l’angle entre le faisceau Doppler et le navire. Valeurs prises au-delà d’un angle de 60° sont inexactes et devraient être évités⁶.
   4. Mesurer la vitesse systolique maximale (PSV) et la vitesse de fin de diastole (EDV) tirées des trois cycles consécutifs. Calculez la tension systolique diastolique (S/M) ratio (PSV/EDV) et indice de résistance (RI) ([PSV-EDV] / PSV) les valeurs pour chaque corne utérine.
   5. Mesurer le débit sanguin de l’artère utérine de 5 rates gravides pendant la 9^ème, 15^ème, 18^ème jour de gestation.
3. Identification de l’ovaire et le débit sanguin de l’artère ovarienne
   Remarque : Les ovaires des rats femelles sont trouvent latérale aux reins des deux côtés de l’animal et résider dans les coussinets adipeux se trouves à la fin de la corne utérine (Figure 1).
   1. Pour l’image de l’ovaire, commencez avec la sonde dans un plan transversal et placez-le sur la face latérale de l’animal un peu sous les côtes. Le rein et les coussinets adipeux ont une apparence de HYPERECHOGENE par rapport à l’ovaire.
   2. Mesurer la limite externe de l’ovaire et les follicules. Chiffres sur la balance pour chaque image sont en millimètres, avec des incréments de 0,1 mm.
      Remarque : En Mode Doppler couleur et en Mode Doppler puissance d’imagerie contribue avec identification des ovaire intensité et le flux directionnel.

4. conception de l’étude

1. Vérifier le cycle oestral par cytologie frottis vaginal.
2. Diviser tous les rats dans les deux groupes. Groupe 1 ou pré fertile (ou périovulatoire), comprennent les rats qui ont été dans le pro-oestrus et l’oestrus des phases du cycle. Pour le groupe 2 ou post fertiles, inclure les rats qui étaient en dioestrus précoce et tardif dioestrus phases du cycle.
3. Surveiller et comparer le diamètre antéro-postérieur de chaque corne utérine dans la région mid-Isthmiques groupes 1 et 2.
4. Surveiller et comparer l’épaisseur de l’endomètre et les caractéristiques de l’endomètre dans les groupes 1 et 2.
5. Surveiller et comparer la taille (diamètre maximal) et les caractéristiques des ovaires et localiser les follicules périovulatoire dans les deux ovaires dans les groupes 1 et 2.
6. Surveiller et comparer le débit sanguin de l’artère utérine dans les groupes 1 et 2.
7. Surveiller et comparer le débit sanguin de l’artère utérine de rates gravides à différents stades de la grossesse (jours 9, 15 et 18 de la gestation).
8. Exécuter des analyses statistiques à l’aide de SPSS. Présentent des données comme la moyenne ± écart-type (SD) ou médiane avec gammes intervalle interquartiles. Analyser les résultats en utilisant le test t de l’étudiant entre les différents groupes. Une P-valeur de moins de 0,05 a été considéré comme une différence statistiquement significative.

Résultats

Il n’y a aucune différence significative dans les diamètres antéro-postérieur corne utérine ou dans l’épaisseur de l’endomètre, entre les deux rives de la corne utérine (tableau 1). Par rapport au groupe 2, l’épaisseur moyenne de l’endomètre dans le groupe 1 a des différences plus épais, mais non significatives (P > 0,05) ont été notées entre les deux groupes (Figure 3). Néanmoins, nous avons trouvé fluide à l’intérieur de l’utérus (chez les...

Discussion

En raison des modifications procédurales et dépannage qui s’imposait dans cette étude, malgré notre but d’identifier toutes les phases de l’oestrus cycle chez des rats en utilisant des ultrasons, nous n’avons pu trouver aucune différence significative. Nous émettons l’hypothèse que ces difficultés peuvent être parce que le cycle oestral ne dure que quelques jours chez le rat, à la différence du cycle chez les femmes. Nous sommes sûrs que toutes les mesures ont été effectuées exactement le bon mom...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system*	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit.	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD	Envigo, inc.		Rat strain
Lubricating Gel	General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System	Cibertec S.A		Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)	General Supply
Isoflurane	Esteve Veterinaria		Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.