Une méthode pour évaluer les effets de la bactériocine sur le microbiota intestinal des souris

Résumé

On pense que les bactériocines jouent un rôle clé dans la définition de la diversité microbienne dans différentes niches écologiques. Ici, nous décrivons une procédure efficace pour évaluer comment les bactériocines affectent la composition de microbiota intestinal dans un modèle animal.

Résumé

Des questions très intriguantes se posent avec notre connaissance approfondie de la composition des microbiotes intestinaux et de la relation avec la santé, en particulier en ce qui concerne les facteurs qui contribuent au maintien de l'équilibre de la population. Cependant, il existe des méthodologies disponibles limitées pour évaluer ces facteurs. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par de nombreuses bactéries qui peuvent conférer un avantage concurrentiel pour l'acquisition d'aliments et / ou l'établissement de niche. De nombreuses souches probiotiques de bactéries lactiques (LAB) ont un grand potentiel pour promouvoir la santé humaine et animale en empêchant la croissance de pathogènes. Ils peuvent également être utilisés pour l'immuno-modulation, car ils produisent des bactériocines. Cependant, l'activité antagoniste des bactériocines est normalement déterminée par des essais biologiques de laboratoire dans des conditions bien définies mais simplifiées par rapport à l'environnement intestinal complexe chez les humains et les animaux, où les bactéries sont confrontées à des influences multifactorielles de l'hôte et des centaines d'espèces microbiennes sHaring le même créneau. Ce travail décrit une procédure complète et efficace pour évaluer l'effet D'une variété de bactériocines avec différentes spécificités cibles dans un système murin. Les changements dans la composition de microbiota au cours du traitement par la bactériocine sont surveillés à l'aide du séquençage d'ADNr 16S de composition. Notre approche utilise à la fois les producteurs de bactériocines et leurs mutants isogènes non productifs de bactériocines, ce dernier permettant de distinguer les modifications liées à la bactériocine liées aux modifications du microbiota liées à la bactériocine. L'extraction de l'ADN fécale et les méthodes de séquençage de l'ADNr 16S sont cohérentes et, conjointement avec la bioinformatique, constituent une procédure puissante pour trouver des changements faibles dans les profils bactériens et pour établir des corrélations, en termes de concentration de cholestérol et de triglycérides, entre les populations bactériennes et les marqueurs de santé. Notre protocole est générique et peut donc être utilisé pour étudier d'autres composés ou nutriments susceptibles de modifier le micro hôteRobiota composition, soit lors de l'étude de la toxicité ou des effets bénéfiques.

Introduction

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens produits par une large gamme d'espèces bactériennes ^{1 , 2} . Ces composés et leurs producteurs, en particulier LAB, ont été explorés et exploités dans le monde entier pendant des décennies pour leurs applications potentielles dans la conservation des aliments et la médecine ³ . Plusieurs bactériocines sont connues pour tuer les pathogènes importants, y compris les espèces de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus et Bacillus . Certaines bactériocines ont même la capacité de moduler la réponse immunitaire ⁴ . De nombreuses bactériocines ont des spectres relativement étroits, une propriété qui est très appréciée dans certaines applications. Par exemple, certaines bactériocines à spectre étroit peuvent être utilisées pour diriger une activité spécifique contre des groupes sélectionnés de bactéries problématiques, sans beaucoup de perturbation sur la flore commensale ou bénéfique partageant la même niche; Ceci est particulièrement essentiel dans l'environnement intestinal, Où de nombreux microbes bénéfiques prospèrent de manière interactive et dynamique ⁵ . Les bactériocines sont également très attrayantes pour une utilisation prophylactique ou probiotique, car elles peuvent supprimer la croissance des agents pathogènes, des pathobionts ou des bactéries opportunistes qui peuvent déséquilibrer l'homéostasie intestinale ^{6 , 7} .

En termes de nature et de propriétés physicochimiques, les bactériocines sont très diverses, car elles ont des structures différentes, des spécificités cibles, des modes d'action, etc. La plupart des bactériocines ont été étudiées très en détail dans des milieux in vitro , mais très peu ont été testés dans les aliments Les matrices ^{8 , 9} ou in vivo, telles que dans un intestin d'animal ^{6 , 10} . Les propriétés in vitro peuvent différer dans une grande mesure lorsqu'elles sont évaluées in vivo en raison de la complexité oF l'environnement intestinal et aussi à des effets involontaires putatifs sur les bactéries bénéfiques. La plupart des probiotiques sont LAB. Ils produisent une gamme d'autres métabolites, y compris les acides gras à chaîne courte, qui influent sur la physiologie de l'hôte, ainsi que pour démontrer les propriétés antimicrobiennes envers certaines bactéries. Par conséquent, dans le cas des souches probiotiques qui produisent des bactériocines, il est préférable d'établir des analyses réalistes, comme des animaux sains avec un microbiota normal.

Dans la présente étude, nous fournissons une stratégie qui permet d'évaluer l'effet de différentes souches productrices de bactériocines, dont les bactériocines ont des spectres inhibiteurs différents, sur des souris saines. Notre stratégie comprend l'alimentation de souris avec des mutants isogènes non bactériociniques, ce qui permet de différencier les effets médiés par la bactériocine des effets induits par la bactériocine. Le séquençage du 16S rDNA permet de suivre les changements dynamiques de la population bactérienne dans l'intestin. SubsUne analyse statistique équitable déchiffre les corrélations entre les espèces bactériennes et aussi entre les espèces bactériennes et les paramètres physiologiques mesurés ( p. Ex., Poids corporel, paramètres biochimiques sériques, etc. ). Nous croyons que le protocole présenté dans cette étude s'applique également à d'autres applications probiotiques ou prébiotiques au-delà de l'étude des bactériocines chez les animaux vivants.

Protocole

Les soins et la manipulation doivent être effectués dans une unité spécialisée de soins des animaux. Les procédures décrites ici ont été approuvées par le Comité d'éthique correspondant de l'Université de Valence et les autorités locales, conformément aux principes de la protection des animaux de laboratoire obligatoire par le droit de l'Union européenne et 2010/63 / UE et le gouvernement espagnol RD 53/2013 sur la protection des animaux Utilisé à des fins scientifiques, afin de respecter le principe 3R dans l'expérimentation animale (remplacement, réduction, raffinement).

1. Cultures bactériennes congelées utilisées pour inoculer des souris

1. Inoculer des souches individuelles de LAB dans 5 mL de milieu de perfusion cérébrale et coeur (BHI) et les cultiver pendant 20 à 24 h (nuit) à 30 ° C.
2. Diluer chaque culture bactérienne pendant la nuit 100 fois dans BHI en transférant 2 ml de culture pendant une nuit à 200 ml de BHI. Cultivez-les à 30 ° C pendant 20 à 24 h.
   NOTE: Les souches utilisées dans cette étude sont listées dans le tableau 1.
3. RécolteLls par centrifugation à 5 000 xg pendant 20 min à 4 ° C.
4. Retirer le surnageant et laver les cellules deux fois en suspendant chaque pastille cellulaire dans 100 ml de solution salée tamponnée au phosphate glacée (PBS) et en recueillant les cellules comme à l'étape 1.3.
5. Après le deuxième lavage, suspendre chaque pastille cellulaire dans 20 ml de glycérol à 15% glacé dans du PBS.
6. Aliquotez la suspension de cellules dans des volumes de 1 ml dans des tubes, puis rangez-les à -80 ° C jusqu'à utilisation.
   REMARQUE: Les cellules doivent être utilisées dans un délai de 1 à 2 mois après ce point.
7. Déterminer le numéro de cellule avant le stockage et avant l'administration de sorte que le nombre de cellules vivantes données à la souris soit connu.
   1. Pour le comptage des cellules, faites des dilutions séquentielles en dix fois dans une solution glacée de chlorure de sodium (NaCl) glacée à 0,9%. Répartir 100 μL de chaque dilution sur une plaque d'agar BHI. Incuber de nuit (20 à 24 h) à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies, ce dernier pour déterminer les unités formant des colonies (cfu) / mL.
8. Pour produire de l'eau potable contenant des bactéries, diluer les cellules de chaque culture bactérienne dans 100 ml d'eau potable stérile et filtrée, avec une UFC moyenne finale de 10 ⁹ ml d'eau. Pour l'évaluation de la survie bactérienne, compter les cellules vivantes juste après la dilution et après 24 h une fois par semaine pendant les deux premières semaines de traitement bactérien.

2. Test de souris et conception expérimentale

Note: Des souris femelles jeunes adultes BALB / c exemptes de pathogènes spécifiques (SPF) (6 à 8 semaines) sont nécessaires pour cette expérience; Ici, un total de 100 animaux ont été achetés.

1. Fournir aux souris un accès gratuit aux aliments et à l'eau granulés tout au long de l'expérience.
2. Concevez l'expérience et calculez la puissance.
   1. Si chaque traitement a son propre contrôle, appliquez une conception de cas-témoins appariés (test t). Utilisez un essai préliminaire pour calculer l'erreur moyenne et standard des effets les plus importants à déterminer.
   2. Optimiser la puissance de l'analyse et le nombre d'animaux nécessaires par groupe en utilisant différentes méthodes et programmes disponibles gratuitement ¹¹ .
   3. Pour tester les effets des souches de producteurs de bactériocines par rapport aux souches non productrices, utilisez 9 animaux par état expérimental.
      REMARQUE: Ce nombre a été déterminé en fonction de l'erreur standard expérimentale et a fourni une puissance satisfaisante (0,7 - 1,0) et un niveau de signification inférieur à 0,05.
      NOTE: Dans l'exemple donné, 11 groupes de souris ont été fabriqués, un par cage. Dix cages correspondaient aux traitements avec 5 souches productrices de bateriocines et les 5 souches 5 non-productrices isogènes correspondantes; La ^11ème cage avait 10 souris et constituait le contrôle non traité.
3. Après l'arrivée des souris dans les installations d'élevage, distribuez-les dans des cages et étiquettez les animaux pour permettre le suivi individuel. Acclimater les souris aux installations et aux conditions d'élevage pendant une semaine avant pEn cours de route.
4. Préparez l'eau potable contenant des bactéries, comme décrit à l'étape 1.8, et placez les bouteilles d'eau potable dans les cages indépendantes correspondantes qui sont clairement identifiées de sorte que les souris dans chaque cage partagent la même bouteille d'eau.
   REMARQUE: Le groupe de contrôle doit être conservé dans une cage séparée, sans contact avec les bactéries testées.
5. Préparez une nouvelle bouteille avec de l'eau potable fraîche (100 mL) tous les jours et ajoutez des suspensions bactériennes fraîchement décongelées. Faites ceci pendant 15 jours consécutifs.
6. Suivez le traitement des bactéries avec une période de deux semaines, période pendant laquelle les souris boivent de l'eau sans bactéries ( figure 1 ).

3. Collecte d'échantillons

1. Recueillir des échantillons de matières fécales.
   1. Préparez des cages autoclavées (vides) et des pinces stériles et écrivez des tubes stériles de 1,5 mL pour chaque souris.
   2. Recueillir des échantillons au même moment de la journée pour éviter les variations de la composition de microbiota au cours deLe cours d'une journée. Pour des résultats optimaux, collectez les échantillons frais séparément.
      REMARQUE: De préférence, rassemblez les excréments tôt le matin, lorsque les souris ont tendance à déféquer spontanément.
   3. Nettoyez une cage vide avec 70% d'alcool et placez une souris à l'intérieur. Laissez-le déféquer et collectez 2 à 4 boulettes fécales à l'aide de pinces stériles, en les plaçant dans des tubes de 1,5 mL.
      REMARQUE: Parfois, il suffit de maintenir la queue de la souris vers le haut; Les selles peuvent ensuite être collectées directement de l'anus dans un tube.
   4. Recueillir des échantillons fécales de chaque souris une fois par semaine durant l'expérience de quatre semaines ( Figure 1 ). Recueillir les premiers échantillons au premier jour (T0, temps zéro), juste avant l'exposition des souris aux bactéries. Recueillir les échantillons de matières fécales suivants aux jours 7, 14, 21 et 28.
   5. Réfrigérer les échantillons à 4 ° C jusqu'à leur transport au laboratoire, où ils sont congelés à -80 ° C. Planifiez d'avance et fournissez suffisamment de boîtes de stockage, en tant que grand nombre de feDes échantillons de cal seront recueillis au cours de l'expérience.
2. Pesez toutes les souris toutes les semaines le jour de la collecte des matières fécales.
3. Recueillir des échantillons de sang de la veine du visage de toutes les souris au 15 ^e jour, le dernier jour d'administration de bactéries, et déterminer les taux de triglycérides, de cholestérol total, de lipoprotéines de haute densité (HDL) et de lipoprotéines de basse densité (LDL) sérum sanguin.
   NOTE: Le personnel expérimenté devrait collecter le sang pour réduire le stress chez les animaux.

4. Activité de comptage LAB et Bacteriocin

1. Pesez une pastille fécale de chaque échantillon dans un tube de 1,5 ml et ajoutez un volume adéquat de 0,9% de NaCl glacé pour obtenir une solution à 10% (p / v). Utilisez des micropères stériles pour des tubes de 1,5 mL pour homogénéiser la suspension fécale et préparer des dilutions en série à dix fois dans du NaCl 0,9% glacé.
2. Comptez le nombre total de cellules LAB.
   1. Transférer les cellules diluées (100 μL) à 4 mL de Ma préchaufféeN Rogosa Sharpe (MRS) gélose molle (50 ° C, gomme 0,8%). Mélanger en vortex avant de verser les cellules sur une plaque de gélose MRS solide (1,5% d'agar).
   2. Sécher la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 min dans le capot stérile avant d'incuber les cellules pendant 20 à 24 h à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies.
3. Comptez les cellules productrices de bactériocines.
   1. Transférer des cellules diluées (100 μL) du producteur de bactériocine à 4 mL d'agar MRS pré-humidifié (50 ° C, 0,8% d'agar), mélanger par vortexage et verser les cellules sur une plaque de gélose MRS (agar 1,5%); Cette couche est appelée la première couche.
   2. Transférer encore 4 ml d'agar MRS sans gélose (0.8% d'agar) sur la première couche pour intégrer toutes les cellules dans la gélose molle.
      NOTE: Cette couche est destinée à empêcher les cellules de se développer en tant que colonies à la surface des plaques d'agar. Les cellules qui poussent à la surface sont facilement déplacées lors du versement des cellules indicatrices sur le dessus (étape 4.3.4) etCompliquera donc l'interprétation des résultats. Cette couche est appelée deuxième couche.
   3. Sécher la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 min dans le capot stérile avant d'incuber pendant 20 à 24 h à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies.
   4. Pour identifier les colonies productrices de bactériocines, mélanger 40 μL d'une culture pendant une nuit d'une souche indicatrice appropriée, comme indiqué dans le tableau 1 , avec 4 mL d'agar doux préchauffé. Verser le mélange sur la plaque; Cette couche est appelée la troisième couche.
   5. Sécher la plaque en enlevant le couvercle pendant 5 à 10 min dans le capot stérile avant d'incuber pendant 20 à 24 h à 30 ° C pour la croissance cellulaire et la formation de colonies.
      NOTE: Les colonies productrices de bactériocines ont des zones claires (inhibition) autour des colonies ( figure 2 ).

5. Extraction d'ADN, amplification d'ADNr 16S et séquençage

REMARQUE: Étapes fOu l'extraction d'ADN sont décrits pour l'utilisation d'un kit commercial ( p. Ex. Kit Realpure "SSS").

1. Suspendre 1 à 2 boulettes de souris fecales (~ 200 mg) dans 300 μL de solution de lyse.
2. Transférer l'échantillon sur un microtube de 2 mL dans lequel environ 0,5 g de perles de verre (diamètre: 0,1 mm) ont déjà été placés.
3. Ajouter 1 μL de mutanolysine à 10 U / μL et 2 μL de lysozyme à 20 mg / mL à chaque échantillon et incuber à 37 ° C pendant 40 à 60 min. Procédez avec l'un des protocoles standard pour l'extraction d'ADN à partir d'échantillons de matières fécales ¹² .
4. Appliquer deux cycles d'étapes de perlage, 1 minute chacun.
5. Ajouter 2 μL de proteinase K et bien mélanger.
6. Incuber pendant 20 min et vortex toutes les 5 min.
7. Refroidir les échantillons à 37 ° C et ajouter 1 μL de RNase A 5 μg / mL à l'échantillon. Bien mélanger.
8. Incuber à 37 ° C pendant 30 à 60 min.
9. Refroidir les échantillons à température ambiante et ajouter 180 μLDe la solution de précipitation des protéines. Vortex vigoureusement à la vitesse maximale pour 20 à 30 s.
10. Centrifuger à 16 000 xg pendant 5 min. S'il y a des particules flottant dans le surnageant, incuber les échantillons dans de la glace pendant 5 min, puis centrifuger à nouveau.
11. Transférer le surnageant contenant l'ADN à un nouveau microtube contenant 1,5 ml contenant 300 μl d'isopropanol.
12. Mélanger en inversant les tubes 20 à 30 fois et incuber pendant 1 h à -20 ° C. Alternativement, incuber les tubes pendant plus longtemps ( p. Ex., Pendant la nuit).
13. Centrifuger à 16 000 xg pendant 2 min.
14. Retirer le surnageant et sécher le tube sur du papier absorbant. Ajouter 300 μL d'éthanol à 70% pour laver le culot d'ADN.
15. Centrifugez à 16 000 xg pendant 1 min, retirez le surnageant et laissez le culot sécher pendant environ 15 min.
16. Une fois que la pastille est sèche, ajouter 100 μl d'eau stérile ou Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) de tampon et remettre à nouveau en suspension la pastille.
17. Pour éliminer tout inhibiteur possibleComposés pendant les étapes suivantes, nettoyer l'ADN. Mélanger l'ADN extrait avec 2 volumes (200 μL) de NTI tampon pour ajuster les conditions de liaison pour l'étape 5.15.
18. Placez une membrane de silice contenant une colonne de nettoyage par PCR dans un tube de collecte (2 mL) et chargez l'échantillon.
19. Centrifuger pendant 30 s à 11 000 x g. Jeter l'écoulement.
20. Laver la membrane de silice avec 700 μL de tampon NT3 et répéter l'étape 5.16.
21. Sécher la membrane de silice par centrifugation pendant 1 min à 11 000 xg pour éliminer tout tampon de lavage contenant de l'éthanol résiduel NT3.
22. Transférer la colonne à un nouveau microtube de 1,5 ml et incuber pendant 2 à 5 minutes à 70 ° C pour l'élimination totale de l'éthanol.
23. Ajouter 30 μL d'eau de qualité PCR et incuber pendant 5 min à 70 ° C. Eluir par centrifugation pendant 1 min à 11 000 x g.
24. Quantifier l'ADN en utilisant un spectrophotomètre UV / Vis ou une méthode fluorométrique.
25. Normaliser et regrouper les échantillons d'ADN des souris partageant la même cage à l'e Point de temps ch.
26. Pour observer les variations individuelles pendant le temps, échantillons d'ADN séquentiels de trois souris sélectionnées au hasard du témoin et deux autres cages aléatoires aux jours 0, 14 et 28.

6. Amplification et séquençage des gènes ARS 16S

1. Préparez une bibliothèque de gènes d'ARNr 16S amplifiés. Amplifier la région V3-V4 du gène bactérien 16S rRNA ^{5 en} utilisant des amorces avant et inversées avec des adaptateurs de surplomb appropriés:
   5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
   5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 '
2. Vérifier les bandes amplifiées en utilisant une électrophorèse avec 1% de gel d'agarose.
3. Nettoyer les produits de réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant des billes magnétiques pour la purification par amplicon.
4. Procédez comme indiqué par le fabricant selon la plate-forme de séquençage massive utilisée> 6.

7. Analyse des données et statistiques

1. Filtrage de qualité (généralement effectué dans les installations de séquençage).
   1. Filtrer les données de lecture brutes et dé-multiplex en utilisant le logiciel fourni avec l'équipement.
   2. Traitez les lectures en fin d'utilisation en utilisant le pipeline UPARSE ¹³ implémenté dans USEARCH ¹⁴ (version 7.0.1090). Fusionnez les extrémités appariées et appliquez un filtrage de qualité en utilisant une valeur maximale d'erreur attendue (maxee) de 1.0. Jeter des séquences inférieures à 150 nt. Déterminer les séquences pour éliminer les singletons.
   3. Cluster les séquences en unités taxonomiques opérationnelles (OTU) sur une identité de séquence de 97% et utiliser UCHIME ¹⁵ pour filtrer des séquences chimériques.
2. Choix de l'OTU, affectation taxonomique et reconstruction phylogénétique, et analyses et visualisations de la diversité.
   1. Traiter les OTU en utilisant Quantitative Insights IntO Écologie microbienne (QIIME) ¹⁶ .
   2. Choisissez et alignez les OTU représentatives contre la base de données de base de Greengenes ^{17 en} utilisant PyNAST ¹⁸ avec une identité minimale de 75% (par défaut).
   3. Assignez une taxonomie aux séquences alignées en utilisant le programme classificateur de base de données ribosomique (RDP) ¹⁹ avec une confiance de 0.8.
   4. Normaliser la table OTU au compte séquentiel de l'échantillon avec la profondeur de séquence la plus basse.
   5. Construire un arbre phylogène à partir de séquences alignées en utilisant Fast Tree ²⁰ après l'étape de filtration afin d'éliminer les régions et les positions très variables qui présentent toutes les lacunes. Utilisez cet arbre pour calculer les diversités alpha et bêta et pour calculer les courbes de raréfaction et les indices de Shannon.
   6. Pour générer et visualiser des métriques de distance UniFrac non pondérées ²¹ , utilisez la principale analyse de coordonnées (PCoA).
      REMARQUE: pour sAnalyse statistique, différents logiciels peuvent être utilisés, tels que R ²² ou les outils statistiques mis en œuvre dans QIIME ¹⁶ .
   7. Pour la comparaison des indices de Shannon de la diversité entre les différents traitements, utiliser un ANCOVA, considérant le temps comme variable dépendante continue dans R.
   8. Comparez les distances entre les traitements dans PCoA dans QIIME en utilisant un test t de Student en deux faces et calculez les valeurs p non paramétriques avec 1000 permutations de Monte Carlo à l'aide de la correction Bonferroni.
   9. Analyser les corrélations entre l'abondance relative des OTU spécifiques et d'autres paramètres mesurés, tels que les taux sériques de cholestérol, HDL, LDL, etc. , en utilisant l'analyse de corrélation de Pearson. À cette fin, utilisez CoNet ²³ avec la visualisation ultérieure des réseaux de corrélation à l'aide de Cytoscape 3.1.1 ²⁴ .

Résultats

La production de bactériocines a été considérée comme une caractéristique probiotique positive dans LAB, car il a été supposé empêcher la croissance de bactéries opportunistes et pathogènes. Le but de ce travail était de montrer la capacité des bactériocines à moduler les populations de microbiota intestinales dans un modèle de souris. À cette fin, une procédure a été développée pour comparer l'effet de l'absorption de souches productrices de bactériocines...

Discussion

La procédure décrite ici a été utilisée pour déterminer si les changements dans le microbiote sont liés à la santé ou à l'âge. Différentes parties du protocole sont importantes, mais parmi celles-ci, l'échantillonnage des excréments, le choix du fragment d'ADN pour être séquencé et analysé, et l'analyse de l'extraction de l'ADN et de l'analyse bioinformatique pourraient certainement être les points les plus critiques. L'échantillonnage est crucial car, pour des raisons...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice (female)	Harlan		Mice should be 6 - 8 weeks of age
Plastic Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
Brain-Heart-Infusion broth	Conda	1400.00
European Bacteriological Agar	Pronadisa	1800.00
Agarose D1 Low EEO	Pronadisa	8010.00
1x TAE buffer	Thermo Scientific	15558042
MRS broth	Difco	288130
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
scale	Mettler Toledo	PB602-S
sterile forceps	Levantina de Laboratorios S.L.	260-3710014
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Hermle	Z383K
sodium chloride	AppliChem Panreac	121659.1211
Realpure SSS Kit	Real Life Science Solutions, Durviz, Spain	RBME04 (300 ml)
Isopropanol	AppliChem Panreac	131090.1611
Ethanol	AppliChem Panreac	131086.1214
Qubit fluorometer	Invitrogen
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
AMPure XP beads	Beckman Coulter Genomics, USA	A63881 (60 ml)
PerfeCta NGS library quantification kit	Quanta BioSciences, Maryland, USA	733-2300
MiSeq v3 reagent kit	Illumina, San Diego, California, USA	MS-102-3003
Primers for 16S rRNA gene amplification			Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index kit		FC-131-1002	Indices and Illumina sequencing adaptors
Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref.	Sigma	Z317314-1PAK
Glass beads, 0.1 mm diameter	Biospec Products	11079-101
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609.25
Omni Bead Ruptor 24	Omni International Inc.	19-040
mutanolysin	Sigma	M9901-10KU
lysozyme	Roche	10837059001
proteinase K	Roche	3115887001
RNase A	Sigma	R4875