Génération d’un modèle de maladie pulmonaire Obstructive chronique chez les souris par exposition à l’Ozone répétées

Résumé

Cette étude décrit la génération réussie d’un nouveau modèle animal de maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) par une exposition répétée souris à des concentrations élevées d’ozone.

Résumé

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est caractérisée par persistants d’air limitation et poumon parenchyme destruction. Il a une incidence très élevée dans le vieillissement de la population. Les thérapies conventionnelles actuelles pour la MPOC se concentrer principalement sur symptôme médicaments modificateurs ; ainsi, le développement de nouvelles thérapies est absolument nécessaire. Qualifié de modèles animaux de la BPCO pourraient contribuer à caractériser les mécanismes sous-jacents et peuvent être utilisés pour le dépistage des drogues nouvelles. Les modèles actuels de MPOC, tels que les lipopolysaccharides (LPS) ou l’élastase pancréatique porcin (EPI)-emphysème induite par modèle, générer des BPCO-comme des lésions dans les poumons et des bronches, mais ne ressemblent pas autrement à la pathogenèse de la BPCO humaine. Une fumée de cigarette (CS)-modèle induit reste l’un des plus populaires car elle ne simule pas seulement BPCO-comme des lésions dans le système respiratoire, mais il est également basé sur l’une des principales matières dangereuses qui provoque la BPCO chez les humains. Cependant, les aspects de longues et fastidieuses du modèle induite par le CS limitent considérablement son application dans le dépistage des drogues nouvelles. Dans cette étude, nous avons généré avec succès un nouveau modèle de BPCO en exposant des souris à des concentrations élevées d’ozone. Ce modèle a démontré ce qui suit : 1) ont diminué le volume expiratoire maximal 25, 50 ou 75/forcé la capacité vitale (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC et FEV₇₅/FVC), indiquant la détérioration de la fonction pulmonaire ; 2) les alvéoles pulmonaires élargie, avec destruction parenchymateuse pulmonaire ; 3) réduit le temps de la fatigue et la distance ; et 4) augmente l’inflammation. Pris ensemble, ces résultats démontrent que le modèle d’exposition (OE) de l’ozone est un modèle animal fiable qui est semblable à l’homme car la surexposition de l’ozone est l’un des facteurs étiologiques de la BPCO. En outre, il n’a fallu 6-8 semaines, issus de nos travaux antérieurs, pour créer un modèle de OE, considérant qu’il faut de 3 à 12 mois pour induire le modèle de la fumée de cigarette, ce qui indique que le modèle de OE peut être un bon choix pour la recherche de la MPOC.

Introduction

Il a été estimé que la MPOC, y compris l’emphysème et la bronchite chronique, pourrait être la troisième cause de décès dans le monde en 2020,^1,2. L’incidence potentielle de la BPCO chez une population de plus de 40 ans est estimé à 12,7 % chez les mâles et 8,3 % chez les femmes au sein de la prochaine 40 ans³. Aucuns médicaments ne sont actuellement disponibles pour inverser la détérioration progressive de patients BPCO⁴. Modèles animaux fiables de la BPCO non seulement exigent l’imitation du processus pathologique de la maladie mais également besoin d’une période de génération court. Les modèles actuels de la MPOC, y compris les LPS ou un modèle induite par le PPE, peuvent induire des symptômes emphysème^5,6. Une seule administration ou un défi de la semaine de LPS ou PPE de souris ou rats génère une neutrophilie marquée dans le lavage bronchoalvéolaire (LBA), augmentation des médiateurs pro-inflammatoires (p. ex., TNF-α et IL-1β) dans la BALF ou le sérum, produit du poumon parenchymateuses élargie à la destruction des espaces d’air et limites d’air^5,6,7,8,9,10. Cependant, LPS ou EPI ne sont pas des causes de la MPOC humaine et ainsi ne pas imiter le processus pathologique¹¹. Un modèle induite par le CS produit une limitation persistante d’air, de la destruction parenchymateuse pulmonaire et réduit la capacité fonctionnelle d’exercice. Cependant, un protocole de CS traditionnel nécessite au moins 3 mois pour générer une MPOC modèle^12,13,14,15. Ainsi, il est important de générer un nouveau modèle animal plus efficace qui répond à deux exigences.

Récemment, en plus de l’usage de la cigarette, la pollution atmosphérique et l’exposition professionnelle sont devenues des causes plus courantes de MPOC^16,17,18. L’ozone, comme l’un des principaux polluants (bien que pas la composante majeure de la pollution atmosphérique), peuvent directement réagir avec les voies respiratoires et endommager le tissu pulmonaire des enfants et des jeunes adultes^{19,20,21 ,22,23,24,25}. L’ozone, mais aussi d’autres stimulateurs dont LPS, PPE et CS, sont impliqués dans un grave des voies biochimiques du stress oxydatif pulmonaire et dommages à l’ADN et sont liés à l’initiation et la promotion des BPCO^26,27. Un autre facteur est que les symptômes de certains patients BPCO se détériorent après avoir été exposés à l’ozone, ce qui indique que l’ozone peut perturber la fonction de poumon^18,28,29. Par conséquent, nous avons généré un nouveau modèle de BPCO par exposition répétée des souris à des concentrations élevées d’ozone pendant 7 semaines ; Il en est résulté les défauts d’air et des lésions parenchymateuses pulmonaires semblables à ceux des précédentes enquêtes^30,31,32. Nous avons étendu le protocole OE à des souris femelles dans cette étude et reproduit avec succès l’emphysème observé chez les souris mâles dans nos précédentes études^30,31,32. Parce que la mortalité de la BPCO a diminué chez les hommes, mais augmenté chez les femmes dans de nombreux pays³³, un modèle de BPCO chez les femmes est nécessaire pour étudier les mécanismes et d’élaborer des méthodes thérapeutiques pour les patientes de MPOC. L’applicabilité du modèle OE à tous les genres étaye davantage son utilisation comme un modèle de MPOC.

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Protocole

Remarque : modèle de l’OE a été générée et utilisée en recherche a déjà été indiqué ^{30 , 31 , 32}. Toutes les expériences animales ont été approuvées par l’utilisation Comité (IACUC) de l’Université Jiaotong de Shanghai et d’institutionnels animalier.

1. souris

Centre de

1. maison exempts de micro-organismes pathogènes, âgés de 7 à 9 semaines femelles souris BALB/c dans des cages ventilées individuelles chez un animal sous contrôlée température (20 ° C) et humidité (40-60 %). Fournir un 12 h de lumière et sombre cycle de 12 h dans l’établissement. Fournir de la nourriture et l’eau ad libitum.

2. L’ozone ou l’exposition à l’Air

1. générer l’ozone avec un générateur électrique dans une étanchéité boîte acrylique (par exemple Perspex). Souffler l’air hors de la boîte à l’aide d’un petit ventilateur à travers un tuyau d’évacuation aérienne qui est connecté à l’intérieur et à l’extérieur de la boîte. Surveiller la concentration d’ozone dans la boîte à l’aide d’une sonde d’ozone. Attendez jusqu'à ce que la concentration d’ozone dans la zone atteint 2,5 parties par million (ppm).
   Remarque : La sonde d’ozone peut activer automatiquement le générateur d’ozone ou désactiver et peut maintenir le niveau d’ozone dans la boîte à 2,5 ppm.
2. Placer les souris dans la boîte quand le niveau d’ozone a atteint 2,5 ppm. Garder les souris dans la zone pendant 3 h chaque fois des pour exposer à l’ozone.
   Remarque : La boîte peut maintenir un niveau d’ozone de 2,5 ppm durant les 3 h en commutant automatiquement le générateur d’ozone on ou off et soufflant le CO ₂ qui est produite par les souris hors de la boîte.
3. Donner deux exposition à l’ozone (chaque exposition Durée 3 h) par semaine (une fois tous les 3 jours) pendant 7 semaines, exposer les souris de contrôle à l’air en même temps et pour la même période.

3. Micro-tomodensitométrie

1. à la fin de la semaine 7, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pelltobarbitalum natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne fonctionne pas répondre à un orteil pincée. moniteur et garder la souris à une fréquence de respiration régulière ; et assurez-vous qu’aucun mouvements volontaires n’existent pendant les procédures.
2. Placer les souris anesthésiés dans la chambre d’une micro-la tomodensitométrie (µCT).
3. Calibrer le µCT utilisant le protocole standard et le fabricant ' instructions de s. Fixer le tube à rayons x à 50 kV et le courant à 450 µA.
   NOTE : Les rayons x et le détecteur tournent autour des souris.
4. Exécuter l’analyse µCT en acquérant 515 projections avec une taille de pixels effectifs de 0,092 mm, un temps d’exposition de 300 ms pour une tranche et une épaisseur de tranche de 0,093 mm.
5. Reconstituer le poumon avec les images acquises à l’aide d’un logiciel. Ajuster la luminosité de l’image en niveaux de gris en définissant le minimum et le maximum de l’échelle des gris-750 et -550 unités Hounsfield, respectivement.
   Remarque : Le logiciel calculera automatiquement le volume de parenchyme pulmonaire et la zone faible atténuation (LAA) ^{34 , 35}.
6. Calculer le pourcentage de LAA (LAA %) en divisant le volume LAA par le volume pulmonaire totale.

4. tapis roulant Test

1. donner les souris une adaptation d’essai à une vitesse de 10 m/min pendant 10 min sur une machine de tapis roulant en cours d’exécution. Note : l’électricité est toujours éteint lorsque la procédure est menée.
2. administrer un test de fatigue à la souris.
   1. Réchauffer les souris à une vitesse de 10 m/min pendant 5 min.
   2. Augmenter la vitesse à 15 m/min pendant 10 min.
   3. Augmenter l’intensité de l’exercice : en augmentant la vitesse de 5 m/min, à partir de 20 m/min, toutes les 30 minutes jusqu'à ce que la souris ne peut pas continuer à courir ³⁶.
3. Enregistrer le total distance courante et durée respectivement comme distance de fatigue et temps de fatigue,.

5. mesures de la fonction pulmonaire

1. anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pelltobarbitalum natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne ne répond pas à une pincée d’orteil et attendre que les souris ont maintenu la respiration spontanée. moniteur et garder la souris à une fréquence de respiration régulière ; et assurez-vous qu’aucun mouvements volontaires n’existent pendant les procédures.
2. Soigneusement tracheostomize les souris et placez-les dans une pléthysmographie de corps qui est reliée à un ventilateur commandé par ordinateur.
   Remarque : La Ventilation est contrôlée via une soupape située dans la partie proximale de la sonde endotrachéale. Le programme d’installation fournit différentes manœuvres semi-automatique, y compris la manœuvre du volume pression quasi statique et la manœuvre des débit rapide.
3. Imposer une moyenne fréquence de 150 respirations/min pour la souris anesthésiée par l’intermédiaire de ventilation sous pression contrôlée jusqu'à une respiration régulière de respiration et d’expiration complète à chaque cycle respiratoire est obtenue.
4. Effectuer la manœuvre de pression-volume quasi statique avec le dispositif à l’aide de pressions négatives générées dans le pléthysmographe.
5. Effectuer la manœuvre de volume de débit rapide dans les boucles de pression-volume quasi statique pour enregistrer la FVC et le VEMS. Gonfler les poumons à + 30 cm H ₂ O et immédiatement après le connecter à une pression très négative pour appliquer l’expiration jusqu'à ce que le volume résiduel est à-30 cm H ₂ O. Record le FEV dans les 25 premiers, 50 et 75 ms d’exhalation (FEV ₂₅ FEV ₅₀ et ₇₅ de FEV, respectivement). Rejeter les manœuvres sous-optimale. Pour chaque test avec chaque souris, effectuer un minimum de trois manœuvres acceptables pour obtenir un moyen fiable pour tous les paramètres numériques.

6. BALF Collection

1. après anesthésie terminal avec pelltobarbitalum natricum ((1 %, 1,8-2,4 ml/100 g) adapter la dose selon les situations individuelles de voir que la souris ne pas répondre à une pincée d’orteil et perdre haleine), lavage du souris avec 2 mL de PBS via un tube endotrachéal de 1 mm de diamètre et puis récupérer la BALF ¹⁰.
2. Réunir les aliquotes de lavage récupérée et centrifuger à 4 ° C et 250 x g pendant 10 min.
3. Recueillir le surnageant pour une utilisation immédiate et stocker le reste à l’azote liquide ou de-80 ° C.
4. Compter le nombre total de cellules utilisant un hémocytomètre.
5. Resuspendre le culot dans du PBS et essorage (1 400 x g, 6 min) puis de 250 µL de cellules resuspendues sur diapositives à l’aide d’une centrifugeuse spinner de diapositive.
6. Wright appliquer la coloration de cellules sur les diapositives selon le fabricant ' protocole de s.
7. Compter 200 cellules par souris ; identifier les cellules comme les macrophages ou neutrophiles, selon morphologie standard, sous un grossissement de X 400 ; et compter leurs numéros.

7. Les prélèvements sanguins cardiaques

1. recueillir le sang par ponction cardiaque, chargez-le dans des tubes de 1,5 mL et gardez-le sur glace pendant 30 min.
2. Centrifuger les échantillons de sang pendant 5 min à 2 000 x g et 4 ° C.
3. Transférer le surnageant (sérum) dans un nouveau tube et conserver à-80 ° C ou liquide azote.
4. Préparer le sérum pour IL-1β, IL-10 et les tests de détection de TNF-α en utilisant les kits ELISA respectifs.

8. L’analyse morphométrique poumon

1. disséquer les poumons et les trachées des souris.
   1. Positionner chaque souris euthanasiés sur une planche chirurgicale immédiatement après le sacrifice.
   2. Disséquer loin le peaucier et les muscles trachées antérieurs pour visualiser et accéder aux anneaux trachées.
   3. Ouverte vers le haut le thoracique cavité. Disséquer les poumons et la trachée, mais ne séparent pas le cœur des poumons.
2. Connecter la sonde endotrachéale à une seringue contenant 4 % de paraformaldéhyde à travers un tube de polyéthylène PE90.
   ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique. Porter des gants et des lunettes de sécurité et d’utiliser la solution à l’intérieur d’une hotte aspirante.
3. Gonfler les poumons complètement à l’aide de paraformaldéhyde à 4 % (10 gouttes, ~ 200 µL) par le biais de la sonde endotrachéale. Enlever le coeur à l’issue de l’inflation.
4. Maintenir le poumon dans un tube de 15 mL contenant 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 4 h.
5. Intégrer le poumon à la paraffine. Obtenir des sections de 5 µm par bloc de paraffine sectionnant avec un microtome rotatif. Au cours de la découpe, exposer la surface maximale du tissu pulmonaire dans la zone de l’arbre bronchique.
6. Pour analyse morphométrique, effectuer l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration sur les sections.
7. Les sections d’image avec un microscope droit lumineux-zone (porte-objectif, 20 X, temps d’exposition, ms 1,667).
8. Ont deux enquêteurs aveuglés au protocole de traitement indépendamment de compter les coupes histologiques. Utiliser le point d’intersection linéaire moyenne (L, _m) en tant que paramètre pour mesurer la distance de la paroi septale inter alvéolaire. Déterminer la L _m en suivant les étapes suivantes :
   1. Ouvrez les images des sections dans Photoshop et d’en tirer une réticule-grille sur l’image avec des lignes longues de cinq 550 µm.
   2. Compter le nombre d’alvéoles à travers la ligne de grille.
   3. Calculer le L _m en divisant la longueur de la ligne de la grille par le nombre d’alvéoles. Pour la quantification, image cinq sections par souris. Acquérir des dix images de chaque section (une image par champ) et évaluer de façon aléatoire. Pendant la sélection du champ, éviter les champs des voies respiratoires et les navires en déplaçant un champ avant ou dans une autre direction.
      Remarque : Les données sont présentées comme la moyenne ± S.E.M. Un non-apparié t-test a été effectué pour comparaison entre souris exposés à l’air et des souris exposées à l’ozone. Trois animaux de chaque groupe ont servi à calculer la différence significative. Une valeur p de < 0,05 était considérée comme significative.

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Résultats

Exemples d’images 3D µCT de chaque groupe sont affichés dans la Figure 1a. Les souris exposées à l’ozone avaient considérablement accroître le volume pulmonaire totale (Figure 1a et b) et LAA % (Figure 1c) que la souris de contrôle exposés à l’air. Le volume pulmonaire et LAA % est demeurée élevées après six semaines de l’ozone e...

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Discussion

Dans cette étude, nous présentons une méthode fiable permettant de générer un nouveau modèle de MPOC. Par rapport aux autres modèles (c.-à-d., LPS ou modèles d’EPI), ce modèle de OE récapitule le processus pathologique des patients BPCO. Parce que la fumée de cigarette est la principale matière dangereuse qui cause des BPCO chez les patients humains⁴⁰, le modèle CS reste le plus populaire MPOC modèle^41,42. Toutefo...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.