Mesurer les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la levure s. cerevisiae réponse à l’hypoxie

Résumé

Nous présentons ici un protocole utilisant RNA-seq pour surveiller les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la réponse à l’hypoxie des cellules de S. cerevisiae . Cette méthode peut être adaptée pour analyser l’expression des gènes au cours de toute réaction cellulaire.

Résumé

Des changements complexes dans l’expression des gènes véhiculent généralement une grande partie d’une réponse cellulaire. Chaque gène peut changer l’expression avec une cinétique unique comme le gène est régulé par l’horloge particulière de l’un des nombreux stimuli, signalisation des voies ou des effets secondaires. Afin de capturer le gène tout réponse d’expression à l’hypoxie chez la levure S. cerevisiae, RNA-seq analyse a été utilisé pour surveiller les niveaux de mRNA des gènes à des moments précis après l’exposition à l’hypoxie. L’hypoxie a été créée par la croissance de cellules de ~ 100 % N₂ gaz. Ce qui est important, contrairement aux autres études hypoxiques, ergostérol et acides gras insaturés ne s’ajoutèrent aux médias parce que ces métabolites affectent l’expression des gènes. Points dans le temps ont été choisis dans la gamme 0 - 4 heures après l’hypoxie, car cette période capte les changements majeurs dans l’expression des gènes. À chaque point dans le temps logarithmique cellules hypoxiques ont rapidement filtré et congelés, limiter l’exposition au O₂ et concomitant des changements dans l’expression des gènes. L’ARN total a été extrait des cellules et utilisé pour l’enrichissement d’ARNm, qui était ensuite convertie en ADNc. De cet ADNc, multiplexes bibliothèques ont été créés et huit ou plusieurs échantillons ont été séquencés dans une seule voie d’un séquenceur de prochaine génération. Un pipeline après séquençage est décrite, qui comprend le découpage de base qualité, lire la cartographie et de déterminer le nombre de lectures par gène. DESeq2 dans l’environnement de statistique R servait à identifier les gènes qui changent de façon significative à n’importe lequel des points temps hypoxique. Analyse de trois réplicats biologiques a révélé une reproductibilité élevée, gènes des cinétiques différentes et un grand nombre d’attendre O₂-gènes régulés. Ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier comment les cellules des divers organismes répondent à une hypoxie au fil du temps et adaptés pour étudier l’expression des gènes au cours d’autres réponses cellulaires.

Introduction

Nombreux organismes réagissent à l’hypoxie ou faible O₂, en modifiant l’expression de gène ^1,2,3. Cette réponse aide les cellules à composer avec l’absence d’un substrat essentiel pour la respiration aérobie et plusieurs réactions de biosynthèse, mais aussi avec un changement redox état ⁴. Plusieurs études de microarray réalisées chez S. cerevisiae montrent que les taux d’ARNm de centaines de gènes changent en réponse à l’hypoxie ^{5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12}. récemment, RNA-seq a été utilisée pour caractériser les modifications de l’expression génique au fil du temps au cours de l’hypoxie ¹³. Ici, les détails expérimentaux sont présentés et discutés.

L’hypoxie peut être atteint de diverses façons, chacune produisant un niveau différent d’O₂. Ici, l’hypoxie a été créée par coulant continuellement ultra haute pureté N₂ dans les fioles, qui abaisse [O₂] dissous immédiatement avec des cinétiques reproductibles ¹⁰. Il est possible qu’il y a quelques O₂ molécules qui contribuent au métabolisme et l’expression génique mais cet environnement est considéré comme très proche d’anaérobie. En l’absence d’O₂, cellules de levure ne peuvent biosynthétiser hème, ergostérol et acides gras insaturés ^4,12,14. Ainsi, des études antérieures ont inclus ces métabolites dans la culture de levure sans oxygène ^5,10,15. Cependant, les nombreuses réponses hypoxiques sont médiés par l’épuisement de ces métabolites et ainsi reconstituer les renverse le gène hypoxique expression réponses ^12,16. Afin d’imiter l’hypoxie naturel, ces métabolites n’ont pas été ajoutés à la presse. Le temps que les cellules ont été exposées à une hypoxie sans la présence de ces métabolites essentiels, il n’y avait aucune augmentation notable de la mort cellulaire (données non présentées), ni un stress prolongé réponse ¹³.

La réponse est également dépendante de la souche et son génotype. Les allèles des régulateurs connus des réponses hypoxiques ²sont particulièrement importants. L’arrière-plan de souche S288C est hautement souhaitée afin que les résultats peuvent être comparés aux autres études génomiques effectuées avec cette souche. Cependant, S288C contient un allèle de perte de fonction partiel des HAP1 gène ¹⁷, un régulateur transcriptionnel critique pour la réponse à l’hypoxie. Cet allèle a été réparé en S288C à l’aide d’un type sauvage la copie de la Σ1278b souche fond ¹¹.

L’expression des gènes dépend fortement de l’environnement cellulaire. Ainsi, lorsque vous effectuez l’analyse d’ADN messagère de Génome-large, il est important de maintenir un environnement constant tout en variant d’un autre paramètre comme temps, relance ou génotype. Pour obtenir des résultats très reproductibles, considérer ces trois pratiques pour l’étude et tous ses réplicats biologiques ou techniques. Tout d’abord, la même experimenter(s) doit réaliser l’étude, étant donné que les pratiques techniques peuvent varient selon les expérimentateurs. En second lieu, le même lot d’ingrédients devrait servir dans les milieux de culture chaque lot a une composition légèrement différente qui peut affecter l’expression des gènes. Troisièmement, pour minimiser les effets du cycle cellulaire, chaque instant doit provenir des cellules asynchrones dans la phase logarithmique de croissance (1-2 x 10⁷ cellules/mL).

Lorsque caractérisant une réponse complexe comme la réponse d’expression de gène à l’hypoxie, une évolution temporelle est avantageuse pour la détermination de la cinétique de divers événements. Des moments spécifiques doivent être choisis qui saisiront les changements majeurs de la réponse. Dans cette étude, les points dans le temps entre 0 et 4 h ont été observées, parce que les expériences passées ont révélé des changements très répandues dans l’expression des gènes au cours de cette période, ¹³.

Pour mesurer l’expression génétique global, RNA-seq a été utilisé ^18,19. Cette méthode utilise le séquençage de prochaine génération pour déterminer l’abondance relative de transcription de chaque gène. Par rapport à l’analyse ADN microarray, RNA-seq présente une sensibilité plus élevée (pour détecter les transcriptions moins abondantes), une plus grande gamme dynamique (pour mesurer des changements plus importants le pli) et une reproductibilité supérieure (à fidèlement suivre l’expression des gènes au fil du temps). En règle générale, l’ARN cellulaire plus est ARN ribosomique tant de méthodes ont été développées afin d’enrichir pour spécifique RNA espèces ²⁰. Ici, les perles de poly-T ont été utilisés pour purifier transcriptions d’ARNm contenant du poly-A, bien que les différents dans le commerce - kits de déplétion des ARNr disponibles pourraient également être efficaces pour l’enrichissement de l’ARNm.

Ici, la réponse d’expression de gène de S. cerevisiae à l’hypoxie a été caractérisée. Les cellules ont été exposés à une hypoxie et puis échantillonnés à huit points dans le temps (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 et 240 min). Pour confirmer la reproductibilité et de définir les transcriptions statistiquement modifiées, trois réplicats biologiques ont été effectuées. ARN a été extrait par rupture mécanique et de la purification de la colonne et ensuite traitée pour l’analyse de la RNA-seq. Le pipeline après séquençage est décrit et scripts de programmation sont fournies qui permettent la réplication exacte des analyses effectuées. Plus précisément, Trimmomatic ²¹, TopHat2 ²², HTseq ²³, l’environnement statistique R ²⁴et le DESeq2 le paquet de ²⁵ ont été utilisés pour traiter les données de RNA-seq et d’identifier des 607 gènes qui changent de façon significative au cours de hypoxie. Analyse en composantes principales (ACP) et l’expression génique des répliques, a indiqué la reproductibilité de la technique. Clustering et heatmaps révèle cinétique d’expression de grande envergure, tandis que gene ontology (aller) analyse a montré que de nombreux processus cellulaires, comme la respiration aérobie, sont enrichis dans l’ensemble des gènes régulés par l’oxygène.

Protocole

1. induisant hypoxie

1. Un jour ou plus avant l’évolution temporelle de l’hypoxie : préparer l’incubateur, cellule de filtrage système, vide, réservoir d’essence, flacons, bouchons, verre étiré et tubes, comme dans la Table des matières.
2. Char₂ place N, incubateur, vide et système à proximité, pour permettre le traitement rapide des cellules de filtrage.
3. Préparer milieu YPD liquide stérile (1 %, extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de glucose) en mélangeant les composants dans une bouteille en verre et le passage à l’autoclave.
4. Plan de mise en page des flacons dans l’incubateur.
   NOTE : Le réservoir de₂ N, le premier ballon sera un piège à eau, la deuxième fiole sera le dernier point de temps, la troisième fiole sera le point de la deuxième à la dernière heure et ainsi de suite jusqu’au dernier ballon qui est un piège à eau finale. La figure 1 montre l’ordre et les connexions entre les flacons.
5. La veille de l’évolution temporelle, ensemencer une colonie de levures dans une culture de 5 mL de liquide la DPJ dans un tube stérile. Plus précisément, de ramasser une colonie complète d’une plaque à l’aide d’un écouvillon stérile. Placer le bâton dans le YPD liquide et agiter le bâton jusqu'à ce que la plupart des cellules est en suspension.
6. Faire pivoter les tubes à 30 ° C pendant la nuit (~ 16 h).
   Remarque : Après 16 h, les cellules de type sauvage atteindra saturation (~ 2 x 10⁸ cellules/mL), indiquée par une culture très nuageuse. Autres souches peuvent prendre plus de temps pour atteindre la saturation et doivent être testés en mesurant la concentration cellulaire avec un spectrophotomètre, comme indiqué dans l’étape 1.9.4.
7. Le jour de l’évolution temporelle, après 16 heures d’incubation, diluer la culture saturée 01:50 à l’aide d’une pipette de 5 mL au lieu de 4 mL de nuit culture dans 196 mL de YPD liquide dans un flacon stérile de 500 mL. Grandir avec la secousse à ~ 200 tr/min pendant 4 h à 30 ° C.
   Remarque : Après 4 h, une culture de type sauvage atteindra une concentration logarithmique de ~ 1-2 x 10⁷ cellules/mL.
8. Durant le 4 h d’incubation, étiqueter les flacons (pour les pièges de l’hypoxie et de l’eau) et les 50 mL tubes de prélèvement. Si l’incubateur à l’étape 1.7 ci-dessus n’est pas utilisé pendant le décours temporel de l’hypoxie, allumez l’autre incubateur et réglé à 30 ° C.
9. Juste avant de le soumettre les cellules à l’hypoxie :
   1. Ajouter environ 50 mL d’eau à deux des flacons stériles 250 mL qui serviront comme les pièges de l’eau.
   2. Remplir ¹/₃ d’une glace seau avec de l’azote liquide et submerger un support de polystyrène expansé pour tenir les tubes à centrifuger 50 mL.
   3. Mettre en place le système de filtration pour prélever des cellules. Ajouter un disque de filtre stérile sur l’unité de fond du système de filtration stérile pince à épiler, en prenant soin de seulement toucher les bords du disque filtre. Placez l’unité sur l’unité de fond filtre filtre et fixer avec les colliers de fixation fournis avec le système. S’assurer que les unités supérieures et inférieures sont alignées afin qu’il y a un joint étanche et aucune fuite.
   4. Mesurer la concentration en cellules avec un spectrophotomètre. Diluer les cellules afin qu’ils peuvent être mesurés dans la gamme linéaire du spectrophotomètre – OD₆₀₀ entre ~0.2 - 0,6, selon le spectrophotomètre.
      Remarque : Une unité de₆₀₀ OD est ~ 3 x 10⁷ cellules/mL, selon la morphologie cellulaire et spectrophotomètre. Une concentration de ~ 1-2 x 10⁷ cellules/mL est attendue, correspondant à l’OD₆₀₀ de ~0.33 - 0,66.
   5. Obtenir rapidement l’échantillon de temps 0.
      1. Connectez le système de filtre à un vide de fort (~ 10 mbar) via le tuyau à vide et un piège de flacon de 1000 mL. Allumez l’aspirateur. Faire couler la culture (habituellement environ 20 mL) dans le haut de la page et attendre pour liquide à être tiré à travers le filtre (~ 10 s, en fonction sur la force du vide).
      2. Avec précaution, retirez le disque de filtre avec la pince à épiler propre et placer dans un tube à centrifuger 50 mL. Placer immédiatement le tube à centrifuger dans le rack immergé dans l’azote liquide. Ce qui est important, ne pas préalablement Faites refroidir les tubes avant d’insérer le filtre car les tubes exploserait.
      3. Après > 30 s, place le tube dans un congélateur-80 ° C pour l’extraction de l’ARN plus tard. Après chaque filtration, nettoyer et remonter le système de filtre. Rincer le système de tirant d’eau à travers pour 10 s sans un disque filtrant. Enfin, essuyez le système avec une serviette en papier.
   6. Diluer la culture 4 h dans des fioles différents pour les différents points dans le temps, afin que chaque fiole atteigne la concentration logarithmique (~ 1-2 x 10⁷ cellules/mL) au point heure indiquée d’hypoxie.
      Remarque : Le tableau 1 montre les dilutions qui servaient à la souche haploïde S288C HAP1⁺ de type sauvage. Il est recommandé de tester chaque souche dans ces conditions de culture hypoxique et ajuster les dilutions en conséquence.
   7. Une fois que les cellules et les médias sont ajoutés pour flacons, remplacer le papier d’aluminium couvrant la fiole d’ouverture fermée par un bouchon contenant deux tubes de verre insérés.
   8. Placer les flacons dans l’incubateur dans la layout déterminé plus tôt.
   9. Connecter en toute sécurité le tuyau tel qu’illustré à la Figure 1.
   10. Vérifiez que tous les bouchons sont bien poussé dans les ouvertures de la fiole.
10. Au temps 0, ouvrir la soupape de régulation. Réglez ensuite le débitmètre à 3 L/min.
    NOTE : Bulles seront observées dans les deux ballons d’eau, indiquant le débit de gaz approprié. Si ce n’est pas le cas, vérifiez que tous les bouchons sont serrées et le tube est correctement attaché.
11. Fermez l’incubateur et régler la vitesse d’agitation à ~ 200 tr/min. Démarrer un minuteur.
12. Avant chaque point dans le temps, mis en place le système de filtration comme décrit ci-dessus dans l’étape 1.9.3.
13. À chaque moment (p. ex., 5 min, 10 min, etc.), ont deux personnes capables de traiter rapidement les cellules comme suit :
    1. Première personne : enlever le ballon approprié du support et retirez le bouchon (avec verre étiré de joint).
       Remarque : Cela ne cassera pas le flux de N₂ à tout les autres flacons de culture mais interrompt temporairement le débit pour le dernier casier de l’eau.
    2. La seconde personne : pipette 1 mL de culture et diluer dans une cuvette. Rebrancher le tuyau du flacon de culture qui est maintenant à la fin de la ligne du dernier piège à eau (un tube et un bouchon sera supprimée dans le processus.). Ensuite, mesurer la concentration cellulaire dans la cuve, comme indiqué ci-dessus au point 1.9.4.
    3. Première personne : Versez le reste de la culture dans le système de filtration sous vide et ensuite effectuer le filtrage et la congélation comme décrit ci-dessus à l’étape 1.9.5.
14. Lorsque vous avez terminé avec tous les points dans le temps, éteignez le gaz de₂ N. Fermez d’abord le régulateur et attendre que la pression libérer puis éteignez le débitmètre. Enfin, démonter le système et nettoyer tout le matériel avec l’eau, puis de l’éthanol à 70 %.

2. Extraction de l’ARN

1. Préparer le tampon RLT pour la purification de RNA de colonne, tel que décrit dans la Table des matières.
2. Préparer une solution de DNase en ajoutant 10 µL de la solution mère de DNase à 70 µL de tampon de RDD par échantillon (voir Table des matières).
3. Retirer les tubes de 50 mL contenant des filtres et des cellules du congélateur à-80 ° C et placez sur la glace pour décongeler (~ 15 min). Effectuez les opérations suivantes avec des tubes sur la glace.
4. Label 2 mL tubes à bouchon vissé et placez-les sur la glace, un tube pour chaque échantillon. Ajouter ~0.6 mL de perles lavé à l’acide dans chaque tube, en utilisant un tube de microtubes de 1,5 mL à ramasser et à mesurer les perles.
5. Ajouter 0,6 mL de tampon RLT froid aux tubes de 50 mL.
6. Pipette de haut en bas pour enlever les cellules du filtre et dans la solution. Évitez de laisser le filtre reste dans la solution, tel que le filtre s’imprégner de la solution. Enlever toute la solution absorbée dans le filtre à l’aide de l’embout de la pipette à serrer le filtre contre la paroi du tube.
7. Transférer la totalité du liquide dans le tube de 50 mL aux tubes à bouchon vissé contenant des perles.
8. Placer les tubes d’un bouchon qui visse dans un homogénéisateur de moulin de perle et exécuter pour un min.
   Placer immédiatement les tubes sur la glace pendant trois minutes. Encore une fois, placer les tubes dans l’homogénéisateur et exécuter pour un min.
9. Retirer les tubes de l’homogénéisateur et le déposer sur la glace pendant 5 min. Les perles seront déposent au fond des tubes.
10. Effectuer le reste des étapes à la température ambiante.
11. Avec une pipette, transférer seulement le lysat (~ 350 µL), évitant les perles, dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
12. Micro-centrifugeuse pendant 2 min à vitesse maximum et le transfert puis le surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
13. Ajouter 1 volume d’éthanol à 70 % (fait partir de 200 preuve biologie moléculaire-éthanol). Mélangez bien en pipettant également.
14. Transférer la solution et aucun précipité dans une colonne de RNA qui a été placée à l’intérieur d’un tube de prélèvement de 2 mL.
15. Centrifuger pendant 15 s à ≥12, 000 x g et jeter les intermédiaires (le liquide dans le tube).
16. Ajouter 350 µL de tampon RW1 à la colonne. Centrifuger pendant 15 s à ≥12, 000 x g et jeter le cheminement.
17. Ajouter 80 µL DNase je mélange de l’incubation à la membrane de la colonne (ne vous pas sur les côtés du tube) et laisser pour reposer pendant 15 minutes.
18. Ajouter 350 µL de tampon RW1 à colonne. Microtubes pour 15 s à ≥12, 000 x g et jeter le cheminement.
19. Ajouter 500 µL de tampon RPE à la colonne. Accréditives microcentrifugeuse pour 15 s à ≥12, 000 x g et jetez-la.
20. Ajouter 500 µL de tampon RPE à la colonne. Micro-centrifugeuse pendant 2 min à ≥12, 000 x g.
21. Retirez la colonne doucement et placer dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL. Microcentrifugeuse à pleine vitesse pendant 1 minute (pour sécher complètement la membrane).
22. Jeter le tube de prélèvement et placer la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Ajouter 30 µL d’eau exempte de RNase à la membrane de la colonne.
23. Éluer l’ARN de la colonne en microcentrifuging pendant 1 min à ≥12, 000 x g. Lorsque vous chargez les colonnes dans la microcentrifugeuse, assurez-vous que les couvercles de la tube de prélèvement sont orientés dans le sens de la centrifugeuse tourne, pour empêcher les couvercles rupture.
24. Ajouter un autre 30 µL d’eau exempte de RNase à la membrane de la colonne, tout en gardant la colonne dans le même tube de microcentrifuge.
25. Micro-centrifugeuse pendant 1 min à ≥12, 000 x g, alors que le volume de l’éluat final est 60 µL.
26. Stocker chaque tube de 1,5 mL contenant 60 µL d’ARN dans le congélateur à-80 ° C.

3. déterminer la qualité et la Concentration d’ARN

1. Mesurer la concentration d’ARN et d’ADN dans chaque échantillon de RNA, utilisent un fluorimètre, colorants (b) DNA-RNA-spécifiques et fluorescents et tubes de dosage (c) énumérés dans la Table des matières. Suivez les instructions de la fluorimètre et les colorants.
2. Vous pouvez également mesurer la concentration de l’acide nucléique avec un spectrophotomètre UV fixé à 260 nm.
   Remarque : Une lecture de₂₆₀ A 1.0 équivaut à ARN simple brin de ~ 40 µg/mL.
3. Tester la qualité de RNA en exécutant l’ARN sur un analyseur d’acide nucléique commercial (voir Table des matières) ou sur un standard de formaldéhyde/agarose gel ²⁶.

4. RNA-seq analyse

1. Le stock total de RNA, représentent 21 µL de 100 ng/µL RNA dans de l’eau exempte de RNase. Utilisez 1 µL de cette 21 µL pour tester la concentration d’ARN comme ci-dessus. Soumettre l’ARN total restant 20 µL (2 µg) à un centre de séquençage externe pour l’enrichissement de l’ARNm, préparation de la bibliothèque spécifique à strand (avec huit ou plus des codes à barres pour le multiplexage) et de séquençage (voir Table des matières). Alternativement, localement effectuer d’enrichissement de l’ARNm et préparation de la bibliothèque et puis soumettre la bibliothèque pour l’ordonnancement.
2. Piscine huit ou plus multiplexé d’échantillons et de séquence dans une seule voie d’un séquenceur de prochaine génération.
3. Télécharger le fichier FASTQ qui contient tous les lectures de séquence et lit l’index correspondant. En outre, téléchargez le fichier texte contenant les codes à barres multiplex.
   Remarque : Les lectures d’index peuvent être présents dans un fichier distinct de FASTQ. Placer tous ces fichiers dans un répertoire.
4. Placez le script fourni ici, « fastq_pipeline.sh », dans le même répertoire. Modifiez ce script en fonction de l’expérience et les répertoires de l’ordinateur.
   NOTE : ce script contient des annotations expliquant les étapes. En bref, la qualité du script supprime les lectures, mappe les lectures sur le génome et génère un fichier délimité par des tabulations qui contient le nombre de lectures par gène pour chaque échantillon.
5. Déposer les fichiers FASTQ et les données brutes comte lire dans Gene Expression Omnibus du NCBI avant publication ²⁷. Suivez les instructions pour « Soumettre les données high-throughput séquence vers GEO » : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
6. Importer les données de lecture comte dans l’environnement de statistique R et effectuer une analyse statistique, en utilisant le script R fourni ici, « time_course_script. R ». Modifiez ce script en fonction de l’expérience et les répertoires de l’ordinateur.
   NOTE : Ce script contient des annotations expliquant les étapes. En bref, ce script importe les données lues, normalise les lectures, identifie les gènes qui changent de façon significative au cours du temps, effectue l’analyse PCA et graphique de l’expression de certains gènes.

Résultats

L’évolution temporelle de l’hypoxie et l’analyse de la RNA-seq effectuées indépendamment de trois fois. Afin d’étudier la reproductibilité des trois répliques, données d’expression pour tous les gènes a été analysées à l’aide de l’analyse en composantes principales (ACP). La figure 2 montre comment les échantillons changent pendant les deux premières composantes principales, qui représentent 58,9 % de la variabilité. Cette analys...

Discussion

Dans cette étude, les taux d’ARNm pour tous les gènes a été mesurée au cours de l’hypoxie dans la levure S. cerevisiae. Le but était d’analyser les modifications de l’expression génique comment global en raison de la croissance dans un environnement contrôlé de près-anoxiques. Plusieurs mesures ont été prises pour s’assurer que la méthode décrite ici a été soigneusement contrôlées et reproductibles. Tout d’abord, les cellules sont exposées à un milieu hypoxique précisément défi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enclosed dry incubator	Thermo Scientific	MaxQ 4000	Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder	Millipore	XX1002530	25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum	Edwards	E-LAB 2	The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask			To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in	Tygon	38TT	Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank			99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask			Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks			Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)			Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm			Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm	Tygon	E-3603	One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs	Millipore	HAWP02500	25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes			For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes			One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen			For freezing cells
acid-washed beads	Sigma	G8772	Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	For RNA column purification
Qiagen RLT buffer			Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1	Qiagen		included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions	Qiagen	79254	The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD	Qiagen		included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes			For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer	Biospec Mini-Beadbeater-24	112011	Keep in cold room
Bacto Peptone	BD	DF0118	for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract	BD	DF0886	for liquid YPD media
glucose	Fisher	D16	for liquid YPD media
Qubit assay tubes	Thermo Fisher	Q32856	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fisher	Q32853	for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit	Thermo Fisher	Q32855	for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher	Q33216	for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system	Agilent	Bioanalyzer 2100	for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer	Illumina	HiSeq 2500	for sequencing libraries
automated liquid handling system	Wafergen	Apollo 324	for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit	Wafergen	400047	for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit	Wafergen	400039	for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter			https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command			http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat)			http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat			https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq			http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio)			https://cran.rstudio.com
R Studio (free version)			https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/