In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Résumé

Le but du présent protocole est de permettre à détection d’in vivo antigène-spécifiques, tuant d’une cellule cible dans un modèle murin.

Résumé

Les méthodes actuelles pour meurtre d’antigène-spécifiques sont limités à usage in vitro ou utilisées dans les modèles de maladies infectieuses. Cependant, il n’y a pas un protocole spécifiquement destiné à mesurer l’antigène-spécifique meurtre sans une infection. Ce protocole est conçu et décrit des méthodes pour surmonter ces limites en permettant la détection d’antigène spécifique mise à mort d’une cellule cible par CD8⁺ T cells in vivo. Ceci est accompli en fusionnant un modèle de vaccination avec une cible marquée CFSE traditionnelle tuant dosage. Cette combinaison permet au chercheur de d’évaluer le potentiel CTL spécifiques de l’antigène directement et rapidement car le dosage n’est pas tributaire de la croissance de la tumeur ou une infection. En outre, l’affichage est basée sur la cytométrie en flux et doit donc facilement accessible à la plupart des chercheurs. La limitation majeure de l’étude consiste à déterminer la chronologie in vivo qui convient à l’hypothèse testée. Variations dans la force de l’antigène et des mutations dans les cellules T pouvant résulter en fonction cytolytique différentielle doivent être évaluées avec soin pour déterminer la période optimale de récolte de cellules et d’évaluation. La concentration appropriée de peptide pour la vaccination a été optimisée pour hgp100_25-33 et ovules_257-264, mais également validation serait nécessaire pour les autres peptides qui peuvent être plus appropriés à une étude donnée. Dans l’ensemble, ce protocole permet une évaluation rapide du meurtre function in vivo et peut être adapté à un antigène donné.

Introduction

Plusieurs protocoles existent pour évaluer le potentiel de cytotoxiques (CTL) d’un CD8⁺ ou CD4⁺ T-cell. Cette évaluation peut être facilement faite en vitro sous des conditions contrôlées,^1,2,3. En outre, des modèles de maladies infectieuses, comme la CML, ont examiné classiquement fonction CTL grâce à l’utilisation de différentiellement CFSE (5-(and 6)-carboxyfluorescéine diacétate succinimidyl ester) étiqueté cellules cibles où la CFSE^Salut-cellules marquées sont pulsé avec un peptide et CFSE^lo-étiquetés de cible les cellules restent pulsésent. Les cellules sont ensuite injectées dans un rapport 1:1 et évalués pour la perte de la CFSE^Salut-étiqueté cibles pulsés par écoulement cytometry⁴. Modèles de vaccin et le rejet ont également utilisé des stratégies similaires pour évaluer in vivo de massacre par les deux CD8⁺ et CD4 des cellules ainsi que les cellules NK^5,6+ T. C’est un dosage puissant, mais nécessite l’utilisation d’agents infectieux qui amorce le système immunitaire avant l’injection de la cible.

Ce protocole, d’autre part, ne nécessite aucune infection préalable de l’hôte et utilise plutôt une stratégie de vaccination pour amorcer le système immunitaire avant l’injection de la cible. Cette vaccination est composée d’une formulation à base d’eau de vaccin peptidique qui exige la fourniture d’un cocktail d’immunostimulantes appelé covax⁷, composé d’un récepteur de type Toll 7 (TLR7) agoniste (imiquimod crème), un agoniste anti-CD40 anticorps et interleukine 2 (il-2), conduisant à une combinaison synergique d’agents immunostimulantes pour le déclenchement du peptide spécifique d’amorçage et de la réponse immunitaire. Ainsi, ce test fournit une lecture rapide de fonction CTL que le vaccin est administré avec des cellules pour l’évaluation de la fonction que trois jours avant l’injection des cellules cibles. En outre, l’amorçage covax est suffisamment forte pour que la capacité de mise à mort de la cellule de T antigène-spécifiques apprêtée peut être vu entre 4 et 24 h après l’injection.

La limitation majeure de ce protocole consiste à déterminer la chronologie in vivo pour la détection de l’assassinat de cible qui convient à la fois l’antigène et l’hypothèse testée. Attention évaluation doit être effectuée, comme les variations de la force de l’antigène ainsi que des altérations génétiques mis à l’essai dans les lymphocytes T peut entraîner de différentielle fonction CTL qui exige une détection synchronisation différente du meurtre de cible. En outre, alors que la concentration appropriée de peptide de vaccination a été optimisée pour mélanome humain antigène glycopeptide 100 (hgp100_25-33) et l’ovalbumine_257-264 (ovules_257-264)^8,9 _, l’utilisation d’un autre modèle d’antigène qui peut être plus approprié à une étude donnée nécessiterait davantage validation. En raison des écarts anticipés dans la capacité des antigènes d’une cible pour stimuler la fonction effectrice CTL en combinaison avec le covax comme adjuvant, optimisation de IL-2 dose concentration et dose fréquence peut-être être essentielle pour atteindre l’objectif souhaité. Dans l’ensemble, ce protocole permet une évaluation rapide du meurtre function in vivo et peut être adapté à un antigène donné.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Texas MD Anderson Cancer Center.

1. préparation du Peptide pour le vaccin

1. Dissoudre le peptide lyophilisé avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à la concentration appropriée et vortexer pendant 30 s.
   Remarque : Pour hgp100_25–33, la concentration finale est de 1 mg/mL et pour les ovules_257–264, la concentration finale est de 0,5 mg/mL. Reconstituer le peptide avant l’injection. Ne pas ranger après reconstitution.

2. isolement des splénocytes de souris transgénique

Remarque : L’isolement des cellules de la rate doit être exécuté de façon stérile.

1. Euthanasier la souris transgénique OT-1 en utilisant la méthode d’asphyxie approuvée CO₂ et retirer la rate.
   Remarque : Les souris transgéniques approprié sont utilisée dans cette étape spécifique pour le peptide de choix.
   1. Poser la souris sur son côté droit. Vaporiser le côté gauche de la souris avec 70 % d’éthanol (EtOH). Tirer la peau à l’aide de pinces et couper la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux ; la rate est visible dans la cavité péritonéale. Doucement ciel ouvert la cavité péritonéale pour accéder à la rate. Enlever la rate avec une pincette.
2. Ventiler la rate en le plaçant dans un filtre de 70 µm dans une boîte de Pétri avec 2 mL de milieu A (PBS avec 1 % sérum fœtal (SVF)) et brisant la rate avec la fin d’un piston.
   1. Recueillir les splénocytes de la boîte de Pétri et la placer dans un tube conique de 50 mL. Laver le plat de Pétri avec 5 mL de milieu A deux fois à recueillir toutes les cellules. Ajouter moyen un up pour 25 mL et centrifuger les cellules pendant 5 min à température ambiante à 475 x g.
3. Aspirer les cellules et remettre en suspension dans 1 mL / par tampon de lyse des globules rouges (RBC) rate. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 10 mL de milieu A et centrifuger à température ambiante comprise entre x 475 g. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu A et enlever les débris de filtrage de la suspension de cellules à travers un filtre de 70 µm dans une propre 50 mL conique.
4. Compter les cellules à l’aide de bleu trypan et un hémocytomètre. Remettre en suspension les cellules dans du PBS à une concentration finale de 10⁶ -⁶ 100 cellules/mL. Pour les ovules_257–264 spécifiques tuant, remettre en suspension à 10⁶ cellules/mL et pour hgp100_25–33 spécifiques tuant, resuspendre à 100⁶ cellules/mL.
   1. Spin le reste des cellules à température ambiante pendant 5 min à 475 x g. aspirer le surnageant et remettre en suspension dans du PBS froid 15 mL pour laver les cellules. Répétez l’étape de lavage une fois de plus. Spin, les cellules à température ambiante pendant 5 min à 475 x g. aspirer le surnageant et remettre en suspension dans du PBS froid selon le volume final déterminé à l’étape 2.4.
   2. Suspension monocellulaire de transfert à un tube de microtubes de 1,5 mL et maintenir sur la glace jusqu'à l’injection dans la souris C57/BL6 destinataire.

3. injection de splénocytes de souris transgéniques

1. Placer la souris C57/BL6 bénéficiaire dans une drisse avec la face dorsale vers le haut. Vaporiser superficie de base queue injection d’alcool isopropylique à 70 %. Administrer par voie intraveineuse 100 µL de suspension monocellulaire (section 2) dans la veine de queue à l’aide d’une aiguille de 27 G avec le biseau vers le haut.

4. Covax Administration

Remarque : Si les cellules sont injectées dans l’après-midi, covax devrait être administré le lendemain à 18 h de l’injection de cellules.

1. Placez votre souris dans une boîte de claire anesthésie à l’isoflurane 1 à 3 %. Après que souris sont complètement anesthésiés, transférer les souris dans les cônes de nez attachés au collecteur dans la chambre de l’anesthésie. Gardez la souris retenus par la face dorsale vers le haut.
   Remarque : Anesthetization est confirmée par une pincée d’orteil bref pour vérifier qu'une réponse de retrait n’est pas obtenue. La loi fédérale limite isoflurane utilisation sur ordre d’un vétérinaire licencié.
2. Vaporiser superficie de base queue injection d’alcool isopropylique à 70 %. Injecter 100 µL de solution de peptide (à partir de la section 1) par voie sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 27 G avec la seringue pénétrant 4-5 mm dans la région de base arrière, du côté de biseau de l’aiguille vers le haut.
   Remarque : Les souris sont vaccinés dans un flanc par injection sous-cutanée à la base de la queue¹⁰.
3. Injection latérale de l’anticorps (0,5 mg/mL de bouillon) anti-CD40 de 100 µL sur le site d’injection de vaccin.
4. Appliquer soigneusement imiquimod crème 50 mg/souris sur les sites de vaccination. Frotter l’imiquimod crème sur la surface jusqu'à ce que la crème ne soit plus visible et est complètement absorbée.
5. Injecter 100 µL de protéine rhIL-2 100 000 UI/mL par voie intrapéritonéale (i.p.) à la région abdominale inférieure. Observer la souris pendant 5 min après qu’ils se remettre complètement de l’anesthésie.
   NOTE : Expérience est suspendu à ce point pendant 3 jours.

5. isolement des splénocytes de cible pour l’étiquetage avec CFSE

Remarque : L’isolement des cellules de la rate doit être exécuté de façon stérile.

1. Euthanasier les souris C57BL/6 selon la méthode d’asphyxie approuvée de CO₂ . Supprimer spleen(s) comme au point 2.1.1. Ventiler la rate et laver les splénocytes tout comme aux étapes 2.2.1 - 2.2.3. Lyse des globules rouges, tout comme aux étapes 2.3 - 2.3.2.
2. Éliminer les cellules de comptage utilisant un hémocytomètre et calculer pour une concentration finale de cellules à 10⁶ cellules/mL dans une solution de marquage CFSE (décrite à l’étape 7). Faire tourner les cellules restantes à température ambiante pendant 5 min à 475 x surnageant aspirat g..

6. peptide impulsion de splénocytes de cible

Remarque : Peptide impulsions doivent être exécutés de façon stérile.

1. Remettre en suspension les cellules à 10⁶ cellules/mL dans les médias (media RPMI 1640 avec 10 % BF, 1 % L-glutamine (Gln-L), 1 % pénicilline/streptomycine (Pen/Strep)). Diviser les cellules en 2 tubes (coniques 15 mL). Etiqueter chaque tube pulsé ou pulsés.
2. Ajouter peptide au tube étiqueté pulsé. Pour les ovules_257–264 pulsé, ajouter 1 µg/mL et pour hgp100_25–33 pulsations, ajouter 2 µg/mL.
   Remarque : Les cellules pulsés subissent l’incubation de même que les cellules pulsés juste, sans l’ajout du peptide.
   1. Incuber les cellules + peptide à 37 ° C pendant 1 h.
3. Ajouter 10 mL de médias complet (RPMI 1640 médias avec 10 % BF, 1 % L-glutamine (Gln-L), 1 % pénicilline/streptomycine (Pen/Strep)) dans chaque tube pour laver les deux pulsé et pulsés de cellules cibles. Faire tourner les cellules restantes à température ambiante pendant 5 min à 475 x surnageant aspirat g..

7. préparation du CFSE pour l’étiquetage des splénocytes de cible

1. Préparer la solution marquage CFSE au cours de la cellule de lavage à l’étape 6.3 ; les cellules pulsés seront étiquetés comme CFSE^Salut et le pulsés comme CFSE^lo. Préparer 1 mL de solution de marquage CFSE 10⁶ cellules.
   Remarque : CFSE est sensible à la lumière et doit être protégé de la lumière à tout moment.
   1. Préparer le CFSE^Salut -étiquetage des médias en ajoutant 1 uL/mL CFSE (solution mère à 5 mM) pour une concentration finale de 5 µM/mL en milieu RPMI 1640 avec 2 % FBS.
   2. Préparer le CFSE^lo -étiquetage des médias en ajoutant 1 uL/mL CFSE (solution mère de 0,5 mM) pour une concentration finale de 0,5 µM/mL de milieu RPMI 1640 avec 2 % FBS.

8. étiquetage des splénocytes de cible avec CFSE

Remarque : CFSE étiquetage doit être exécuté de façon stérile.

1. Remettre en suspension les cellules-cibles pulsé et pulsés (de l’étape 6.3) à 10⁶ médias de CFSE-marquage de cellules/mL. Remettre en suspension les cellules pulsés avec prêt CFSE^Salut-étiquetage des médias et les cellules pulsés avec préparé CFSE^lo-étiquetage des médias.
2. Les cellules de Mix et CFSE-étiquetage des médias par inversion douce ou tourbillonnant. Ne pas mélanger au vortex. Incuber les cellules et CFSE-étiquetage des médias à 37 ° C pendant 15 min. Remix les cellules toutes les 5 min.
3. Ajouter 10 mL de médias complet à chaque cellules de suspension et un essorage à température ambiante pendant 5 min à 475 x g.
4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 10 mL de PBS froid. Faire tourner les cellules à 4 ° C pendant 5 min à 475 x g.
5. Répétez l’étape 8,4.
6. Compter les cellules et le mélange peptide-pulsé, CFSE^Salut-étiqueté avec pulsés, CFSE^lo-marqué des cellules dans un rapport 1:1 pour l’injection à des souris destinataires. Garder une partie aliquote de 1 x 10⁶ mixé de cellules à utiliser pour une évaluation de cytométrie de flux de base (article 11).
   Remarque : Le dernier volume d’injection est de 100 µL par souris. Le nombre de la dernière cellule est 10e6 cellules. Perte de volume dans la seringue et l’aiguille doit être pris en compte et doit être estimée à 500 µL.

9. l’injection de cellules cibles

Remarque : Conservez les cellules marquées CFSE abri de la lumière avant et Pendant l’injection autant que possible.

1. Placer des souris C57BL/6 bénéficiaires dans une drisse avec la face dorsale vers le haut. Vaporiser superficie de base queue injection d’alcool isopropylique à 70 %. Administrer par voie intraveineuse 100 µL de suspension monocellulaire dans la veine caudale avec le biseau vers le haut.

10. re-isolement de cellules cibles

NOTE : Le calendrier de cette étape est critique et dépendent de la cytotoxicité CTL et la force de l’antigène pour la stimulation. Pour l’évaluation de tuer une cible pulsée de_{264 257–}OVA, les cellules doivent être récolté 4 à 6 h après l’injection. Les cellules marquées CFSE étant légers rates sensibles, processus dans l’obscurité.

1. Euthanasier les souris C57BL/6 bénéficiaires selon la méthode d’asphyxie de₂ CO approuvée.
2. Supprimer spleen(s) comme au point 2.1.1. Ventiler la rate et laver les splénocytes tout comme aux étapes 2.2.1 - 2.2.3. Lyse des globules rouges, tout comme aux étapes 2.3 - 2.3.2.
3. Remettre en suspension les cellules dans la cellule à fluorescence activé 1 mL tampon (FACs) (1 % BSA + PBS) de tri pour évaluation par cytométrie en flux.

11. déclenchement logique pour déterminer l’activité CTL par cytométrie en flux

1. Effectuer l’évaluation de l’activité CTL utilisant un protocole de cytométrie de flux standard. Acquérir des cellules à l’aide de la chaîne FITC sur un cytomètre en flux avec un laser à 488 nm pour excitation¹¹.
   1. Porte sur les lymphocytes direct en utilisant les paramètres de diffusion (SSC) de côté de vs forward scatter (FSC). Subgate dans la porte de lymphocytes direct pour la population totale de CFSE séropositifs.
      Remarque : Les cellules injectées marqués au CFSE forment un petit sous-ensemble des lymphocytes totales présents dans la rate. Les cellules CSFE-positif doivent apparaître comme deux populations distinctes sur l’échelle logarithmique.
   2. Utiliser un format de l’histogramme pour déterminer le pourcentage de la pulsés (gauche pic, CFSE^lo) et pulsé (droite pic, CFSE^Salut) des populations. Perte des CFSE^Salut cellules indique l’activité CTL spécifiques de l’antigène.

Résultats

Avant l’injection de cellules cibles marquées CFSE, le mélange de 1:1 cellule est exécuté sur un cytomètre en flux pour déterminer les fréquences de base du CFSE^Salut et CFSE^lo les cellules cibles. Figure 1 A illustre la stratégie de blocage pour détecter des changements dans les populations CFSE, une grille initiale est faite en utilisant les paramètres FSC et SSC. Les cellules de CFSE positives au totales s...

Discussion

Bien que ce protocole soit simple, il y a quelques étapes cruciales qui doivent être effectués avec soin. L’amorçage covax après injection de l’antigène-des lymphocytes T spécifiques mis à l’essai est nécessaire pour voir n’importe quel meurtre des cibles pulsés. S’il est possible que la vaccination de base nautique covax crée une maladie inflammatoire aiguë, pour la phase inflammatoire chronique, remplaçant la formulation à base d’eau éphémère avec une approche à base d’huile de libérati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice	Charles River	027	C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice	Jackson Labs	003831
hgp10025–33	CPCScientific	834139	KVPRNQDWL
OVA 257–264	CPCScientific	MISC-012	SIINFEKL
Imiquimod cream 5%	Fougera	51672-4145-6	Aldara Cream
CD40-specific mAb	BioXcell	BE0016-2	clone FGK4.5
rhIL-2 protein	Hoffman LaRoche Inc	136	Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep	Kendall	S-17474
PBS	Life Technologies	10010-023	Phosphate Buffered Saline
FBS	Life Technologies	26140-079	fetal bovine serum
RBC lysis buffer	Life Technologies	A10492-01	red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
L-Glutamine	Life Technologies	25030081
Pen/Strep	Life Technologies	15140122	penicillin/streptomycin
CFSE	Life Technologies	C34554	5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
1.5 mL MCT graduated natural	Fisher	05-408-129	microcentrifuge tube
70% ethanol	Fisher	BP8201500	EtOH
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061
Hemocytometer	Fisher	267110
27 gauge needle	BD	305109
1 mL syringe	BD	309659