Évaluation de la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique par perfusion intraveineuse d’albumine marquée FITC dans un modèle murin de la maladie neurodégénérative

Résumé

Dans cette étude, nous présentons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la rupture de la barrière hémato - encéphalique au titre de maladies neurodégénératives. Pour atteindre notre objectif, nous avons infusé de haut poids moléculaire isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine dans la jugulaire de souris de la veine et évalué sa fuite dans le parenchyme du cerveau par microscopie à fluorescence.

Résumé

Perturbation de l’intégrité de la barrière hémato - encéphalique (BHE) est une caractéristique commune de différentes maladies neurologiques et neurodégénératives. Bien que l’interaction entre perturbée BBB homéostasie et la pathogenèse des maladies du cerveau a besoin d’une enquête plus approfondie, le développement et la validation d’une procédure fiable pour détecter avec précision les modifications BBB peuvent être crucial et représentent un outil utile pour prédire la maladie potentiellement la progression et le développement ciblé des stratégies thérapeutiques.

Nous présentons ici une procédure simple et efficace d’évaluation de fuite BBB dans une affection neurodégénérative comme ça qui se produisent dans un modèle murin préclinique de la maladie de Huntington, dans lesquels tout défaut de la perméabilité du BBB est clairement décelable précocement dans la maladie. Plus précisément, le poids moléculaire élevé l’isothiocyanate de fluorescéine étiqueté (FITC)-albumine, qui est capable de traverser la BHE uniquement lorsque ce dernier est altérée, est parfaitement infusée dans une veine jugulaire de souris et de sa distribution dans les districts de vasculaires ou parenchymateuses est alors déterminé par microscopie à fluorescence.

Accumulation du vert fluorescent-albumine dans le parenchyme du cerveau fonctionne comme un indice de perméabilité BBB aberrant et, lorsque quantifiée à l’aide de logiciels de traitement d’Image J, est signalée comme l’intensité de Fluorescence verte.

Introduction

L’homéostasie dans le système nerveux central (CNS) est une condition sine qua non pour la bonne communication et la fonction des cellules neuronales. Le parenchyme de la CNS est hermétiquement bouclé de la périphérie de l’endothéliale – barrière hémato encéphalique (BHE), qui représente l’interface entre le cerveau et le sang périphérique et joue un rôle essentiel dans la diaphonie entre ces deux districts^{1 ,2}. La BHE est un complexe et dynamique structure tridimensionnelle composée principalement de spécialisées micro-navire cellules endothéliales (CE) reliés entre eux par l’intermédiaire de complexes de jonction intercellulaires - jonctions serrées (TJs) - et entouré de péricytes, neurone terminaisons et astrocyte pied processus^1,2.

Dans des conditions physiologiques, la très faible perméabilité de la BHE intacte assure le strict règlement du transport des nutriments et autres molécules dans et hors du cerveau et fournit le système nerveux central avec une protection unique contre les changements qui se produisent dans la composition du sang susceptibles d’influencer l’activité neurale et contre potentiel périphérique insulte^1,2,3.

Perturbation de l’intégrité BBB et sa perméabilité améliorée sait depuis longtemps pour constituer un élément clé pour beaucoup neurologiques et neurodégénératives troubles⁴ , y compris la maladie de Huntington (MH)^5,6, toutefois , si un tel dysfonctionnement est un phénomène causal ou un événement de propagation au cours de la maladie est encore peu clair. Le moment de la rupture BBB aussi reste insaisissable, cependant, des preuves de notre groupe et autres nouvelles indique que perturbé BBB intégrité ne représente pas un événement tardif dans la progression de la maladie, mais plutôt une étape précoce^{6,7 , 8}, qui peut avoir des conséquences à long terme.

Dans cette optique, il est important de révéler précocement rupture de BBB neurodégénérescence afin d’élaborer des stratégies utiles pour prédire la progression de la maladie et des lésions cérébrales et de développer des interventions alternatives et plus ciblées capables d’avec succès atténuer les conséquences cliniques de cette perturbation. L’imagerie fiable de déficience de BBB est donc d’une importance majeure dans la recherche expérimentale et prise en charge clinique des maladies du cerveau.

Dans cet article, nous décrivons une procédure simple et efficace pour l’évaluation de la perméabilité BBB dans un modèle murin de HD à l’aide de la masse moléculaire élevée fluorescéine isothiocyanate-albumine marquée (FITC-albumine). Extravasation de FITC-albumine, qui normalement ne peut pas traverser la barrière, dans le parenchyme du cerveau a été mesurée comme indice de fuite BBB. Cette technique est facilement adaptable à des rats et d’autres pathologies caractérisées par cerebrovasculature déficience^9,10.

Protocole

toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le Conseil d’examen du soin de Animal IRCCS Neuromed et " Istituto Superiore di Sanità " (numéro de permis : 1163/2015-PR) et étaient conformes aux lignes directrices de l’Union européenne Directive 2010 / 63/EU pour l’expérimentation animale.

1. préparation de la Solution FITC-albumine pour être injecté dans la veine jugulaire

Remarque : toutes les expériences ont été contrôle réalisé dans manifeste (11 - semaine vieux) HD R6/2 souris et en âge et sexe assortie sauvage (WT) littermates.

1. Dissoudre FITC-albumine poudre (voir la Table des matières) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 10 mg/ml.
   Remarque : Pour des résultats optimaux, cela doit être préparée fraîche pour chaque réaction étiquetage.

2. Préparation de l’équipement à être utilisé pendant l’intervention

1. énoncent les instruments chirurgicaux préalablement stérilisés à l’autoclave (voir Table des matières).
2. Nettoyer le banc chirurgical avec de l’alcool (70 % de solution d’éthanol). Préparer la zone chirurgicale (45 x 45 cm) avec un drap serviette jetable stérile chirurgicale et mis en place le fonctionnement stéréomicroscope.

3. Une intervention chirurgicale pour perfusion FITC-albumine dans la veine jugulaire

1. enregistrer le poids de la souris pour l’anesthésie.
2. Souris anesthésier avec une injection intrapéritonéale (i.p) d’une dose appropriée de la kétamine (100 mg/kg) - solution de xylazine (10 mg/kg).
3. Moniteur animale sédation par pinch doux orteil retirer réflexe, comme l’a démontré en Walantus et al. ^{11 , 12}.
4. Placer la souris anesthésiée en position couchée face vers le haut et fixer les quatre pattes et la queue sur le workbench chirurgical avec du ruban adhésif.
5. Après que la souris est sécurisée, soigneusement raser la marge chirurgicale appropriée sur le cou avec un rasoir électrique (voir Table des matières) et les désinfecter avec de l’éthanol 70 % et de solution de povidone-iode.
6. Sécher la surface exposée rasée avec des cotons-tiges.
7. Doucement tirer la peau rasée et faire une incision longue longitudinale de 1,5 cm, par scalpel, dans la claviculaire ligne à mi-chemin sur le thorax et de son prolongement pour juste en dessous du cou.
8. Soigneusement étirer dehors du tissu conjonctif avec une pince sous observation microscopique (grossissement de X 5) pour exposer la veine jugulaire externe.
9. S’assurer un espace suffisant sur la droite et à gauche de la veine jugulaire pour faciliter l’insertion de l’aiguille de 30½ G pour l’infusion de la solution d’albumine-FITC.
10. Injecter par voie intraveineuse de l’animal (à droite veine jugulaire) lentement (plus de 3 min) avec 100 µL de 10 mL/kg FITC-albumine à l’aide de l’aiguille 30½ G.
11. Après 15 minutes, euthanasier la souris par décapitation, rapidement enlever le cerveau du crâne comme décrit précédemment ¹³ et plongez-le pendant 15 min dans au moins 10 x le volume du cerveau lui-même de l’isopentane préalablement refroidi.
12. Déplacer l’isopentane congelés cerveau dans un tube préalablement réfrigéré et la stocker dans un congélateur à-80 ° C jusqu'à coupes histologiques.

4. Histologiques de sectionnement du cerveau imprégné FITC-albumine

1. Embed congelés cerveau en température de coupe optimale (OCT) composé (voir Table des matières) avant la découpe du cryostat.
2. En série couper le cerveau en coupes épaisses de 20 µm, avec un cryostat (voir Table des matières) et les monter sur lames de microscope vitre.
3. Effectuer la FITC-albumine/laminin coloration conjointement l’aide spécifique à un anticorps anti-laminine (voir Table des matières) comme décrit plus haut ⁶.
   1. Brièvement, incuber les sections avec l’anticorps primaire anti-laminine (1/1000 de la pAb) pendant la nuit et aller de l’avant avec l’anticorps secondaire approprié conjugué à Cy3.
   2. Lamelle glisse avec support de montage contenant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (pic d’absorption = 360 nm, le pic d’émission = 460 nm (voir Table des matières).
   3. Laisser la lame sécher pendant la nuit à 4 ° C dans l’obscurité.
   4. Observer la fluorescence coloration sous un microscope à fluorescence (voir Table des matières) à un grossissement de X 20, équipée de deux FITC (pic d’absorption = 495 nm, le pic d’émission = 525 nm) et les filtres de Cy3 (pic d’absorption = 550 nm ; émission PIC = 570 nm).
      1. Pour visionner les exemples immédiatement après la coloration, fixer la lamelle dans les coins à l’aide de vernis à ongles et les examiner au microscope comme ci-dessus (4.3.3).

5. Réglage vers le haut le Microscope à Fluorescence et Acquisition d’Images en couleur

1. mis en place le microscope de fluorescence ainsi.
   1. Allumez la lampe à fluorescence environ 10 minutes avant utilisation. Allumez l’appareil photo numérique, l’ordinateur connecté et le microscope. Exécutez le logiciel d’analyse de l’image (voir la Table des matières).
   2. Utiliser l’objectif approprié pour la collecte de signal optimale et une résolution spatiale et sélectionnez les filtres appropriés.
2. Acquisition d’Images en couleur
   1. , sélectionnez la commande [en direct] sur le logiciel d’analyse de l’image (voir la Table des matières) et définir les paramètres d’éclairage optimal pour chaque filtre.
   2. Sélectionner la commande [freeze] pour prendre l’image en couleurs monocanal et la barre d’échelle (' Edit > Burn échelle ')
   3. Enregistrer chaque image en la ' .tiff ' format.
   4. Fusion de chaînes en une seule image en sélectionnant ' fichier > fusion canal ' et enregistrez-le dans le
   5. tiff ' format.
   6. Acquérir un minimum de vingt quatre bits couleur pictures (2200 µm x 3400 µm) par tranche de cerveau (6 sections par diapo).

6. Évaluation de l’Extravasation FITC-albumine

1. analyser l’intensité de fluorescence pour chaque canal unique en utilisant l’utilisier ImageJ ^{14 , 15}.
2. Normaliser l’intensité totale des signaux fluorescents de la FITC-albumine par l’intensité de fluorescence CY3-laminine totale par chaque image et de faire rapport à l’albumine épanchements dehors les navires comme l’intensité de Fluorescence vert.

Résultats

Bonne infusion de FITC-albumine dans les résultats de la veine jugulaire dans l’extravasation du traceur fluorescence verte de la circulation sanguine dans le cerveau de parenchymawhen que la BHE est compromise⁶. Dans des conditions physiologiques, distribution d’albumine fluorescent infusée est restreinte à l’intérieur des vaisseaux du cerveau et aucun signal dans le parenchyme de domaine et/ou cerveau périvasculaires environnant n’est détectable (

Discussion

La technique que nous décrivons ici est principalement utile pour détecter les fuites BBB dans des conditions de maladie cérébrale. Dysfonctionnement BBB gagne l’attention comme une caractéristique commune des divers troubles neurologiques⁴. Précédemment, nous avons utilisé cette approche pour décrire le dérangement au début de l’intégrité de la BBB dans un modèle murin d’une maladie neurodégénérative rare comme HD⁶.

Cette ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate	SIGMA	A9771-100MG
pAb anti-Laminin	Novus Biologicals	NB300-144
CY3 anti-rabbit made in goat	MILLIPORE	AP132
SUPERFROST PLUS	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mm	Thermo Scientific (DIAPATH)	61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound	Bio Optica	05-9801
VECTASHIELD Mounting Media	VECTOR	H-1500	Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe	RAYS Health & Safety	INS1ML26G13
30G 1/2"	BD Microlance	304000	Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel Handle	F.S.T.	91003-12
#22 Disposable Scalpel blads	F.S.T.	10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cm	F.S.T.	14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm	F.S.T.	11251-35
Graefe Forceps 10 cm	F.S.T.	11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm	F.S.T.	11251-20
Medical patch	Medicalis	34788
Sterile disposable towel drape	Dispotech	TVO50VE
Stereoscopic Microscope	NIKON	SMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2)	NIKON	1003167	Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	932162	Epifluorescence Microscope
Microscope digital Camera	Nikon	DS-Ri2	Microscope camera
Intenslight	Nikon	C-HGFI	Microscope lamp
NIS-Elements 64 bit	Nikon	AR 4.40.00	Analysis Software
Electric Razor	Gemei	GM-3007