Une approche Simple pour induire une névrite auto-immune expérimentale chez la souris C57BL/6 pour les évaluations fonctionnelles et neuropathologiques

Résumé

Ce rapport présente une approche simple pour provoquer avec succès l’expérimental névrite auto-immune (EAN) à l’aide de la protéine de la myéline zéro (P0)_180-199 peptide en combinaison avec adjuvant complet de Freund et la toxine coquelucheuse. Nous présentons un modèle sophistiqué capable d’évaluer avec précision l’ampleur des déficits fonctionnels et neuropathologie qui se produisent dans cette EAN.

Résumé

Névrite auto-immune expérimentale (EAN) est un modèle expérimental fort apprécié des maladies démyélinisantes périphériques auto-immunes. Maladie de l’EAN est induite par l’immunisation de souris avec des peptides neurogènes pour diriger une attaque inflammatoire vers les composants du système nerveux périphérique (PNS). Les progrès récents ont permis à l’induction de l’EAN dans la lignée de souris C57BL/6 relativement résistante à l’aide de la protéine zéro (P0)_106-125 ou P0_180-199 peptides livrés en adjuvant combinée à l’injection de la toxine de la coqueluche. La capacité d’induire l’EAN dans la souche C57BL/6 permet l’utilisation des nombreux outils génétiques qui existent sur cette toile de fond la souris et permet ainsi l’étude sophistiquée de la pathogenèse de la maladie et à l’interrogatoire de l’action mécanique de thérapeutiques novatrices dans combinaison d’approches transgéniques. Dans cette étude, nous démontrons une approche simple pour provoquer avec succès l’EAN en utilisant le peptide de_180-199 P0 chez les souris C57BL/6. Aussi, nous exposons un protocole pour l’évaluation des déficits fonctionnels qui se produisent dans ce modèle, accompagné d’un tableau de caractéristiques neuropathologiques. Ainsi, ce modèle est un puissant modèle expérimental pour l’étude de la pathogenèse de neuropathies démyélinisantes périphériques humains et pour déterminer l’efficacité des thérapies potentielles qui visent à favoriser la réparation de la myéline et protéger contre les dommages de nerf dans auto-immunes névrite.

Introduction

Les neuropathies périphériques peuvent être origine génétique ou acquise, avec neuropathies acquises ayant soit métabolique, ischémique, précipitants inflammatoires ou toxiques. Ces maladies sont également utilement classées comme axonale ou demyelinative à l’origine. Le plus souvent acquis démyélinisantes les neuropathies périphériques sont la polyneuropathie démyélinisante inflammatoire aiguë (paid, aussi connu comme le syndrome de Guillain-Barré, GBS) et Polyneuropathie inflammatoire chronique démyélinisante (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; les deux sont pathogenetically caractérisées par une réaction auto-immune dirigée contre la gaine de myéline, causant la démyélinisation des nerfs périphériques. Dans ces maladies, les lymphocytes T activés traversent la barrière de nerf de sang et de génèrent une réaction immunitaire dans le PNS. Activation des macrophages dans le nerf puis provoque la démyélinisation soit directement via attaque phagocytaire, soit indirectement par l’intermédiaire de médiateurs de l’inflammation sécrétées, entraînant des troubles cliniques tels que paralysie et dysfonctionnement sensoriel⁵. Tandis que les axones démyélinisés conservent la capacité d’être remyelinated après la démyélinisation, remyélinisation est souvent retardée ou incomplète, entraînant la susceptibilité des axones nus à des dommages irréversibles, qui est la cause principale de la clinique permanent personnes handicapées. Actuellement, les traitements les plus efficaces sont des immunomodulateurs, mais malgré leur efficacité, dans de nombreux cas la récupération est souvent lente et environ 25 % des patients éprouveront des déficits fonctionnels résiduels qui réduisent considérablement leur qualité de vie de^{6, 7}.

EAN est un modèle animal couramment des maladies démyélinisantes neuropathie périphérique qui a fourni des renseignements précieux sur pathogenèse et un moyen d’évaluer de nouveaux agents thérapeutiques⁴. Ce modèle peut être induit chez les différentes espèces comme les lapins, rats, souris et les cochons d’Inde et est induite par l’immunisation avec des antigènes neurogènes. Toutefois, en fin de compte l’induction EAN réussie repose sur une réponse immunitaire appropriée pour la maladie de se produire. Compte tenu des variations de l’espèce (et inter-espèce/souche) la fonction immunitaire, plusieurs combinaisons d’antigènes et adjuvants ont été développés pour provoquer avec succès l’EAN. En ce qui concerne les outils de génétiques murines, le C57BL/6 est la plus largement utilisée ; Toutefois, le peptide de protéine P2 traditionnel 57-81 (P2_57-81) qui se traduit par la maladie dans la souche de souris sensibles SJL⁸ est incapable de pathogenèse illicite conduisant à des déficits fonctionnels chez la souche C57BL/6. Heureusement, les paradigmes de sensibilisation utilisant le P0_106-125 ou P0_180-199 peptides, livré en adjuvant combiné avec l’injection de la coqueluche, la toxine peut surmonter cet obstacle, permettant aux outils sophistiqués de génétiques être utilisés dans le modèle murin de EAN.

Ici, on présente une méthode simple pour l’induction de l’EAN chez les souris C57BL/6. En outre, une approche globale et détaillée permettant d’évaluer les déficits fonctionnels et neuropathologiques associés à la maladie est fournie. Le P0_180–199 peptide⁹ a été choisie plutôt que le remplacement de P0_57-81 ¹⁰. Le modèle de₁₉₉ P0_180–a été décrit pour produire des signes cliniques moins sévères par rapport à l' alternative de P0_57-81 ¹⁰et est donc susceptible de résister à l’introduction de potentiellement des perturbations génétiques délétères, récupérer des interventions chirurgicales (par exemple, implantation de pompe osmotique) et se prête à la fonction de marche tapis roulant stable⁴. Cependant, le tapis roulant démarche tests de la fonction et histologiques protocoles décrits ici pourraient facilement être appliquées lors de l’étude de la maladie dans une variante de_57-81 induite par P0.

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Protocole

toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’Institut Florey pour les neurosciences et le Comité d’éthique de la santé mentale (Centre de cerveau de Melbourne) Animal et suivre le Code de pratique australienne pour l’utilisation des animaux pour scientifique Application.

1. Induction EAN

Remarque : EAN peut être induite avec succès chez les souris C57BL/6 mâles âgés de 6 à 8 semaines. Le protocole d’induction dure 9 jours au total. Jour 0 désigne le jour de la première vaccination. Pour ce protocole, les injections ont été réalisées sous anesthésie (voir étape ci-dessous 1.1.2).

1. Lors de la journée -1 :
   1. préparer la toxine de la coqueluche (voir Table des matières) solution de 1,6 µg/mL à l’aide de phosphate 0,1 M souris-isotonique stérile solution saline tamponnée (MT-PBS).
   2. Anesthetization à l’isoflurane :
      ,
      1. Placez votre souris (C57BL/6, mâle, 6 à 8 semaines) dans la chambre d’anesthetization et de régler le débit d’oxygène à 1 L/min.
      2. Allumez le vaporisateur isoflurane, réglez-le à 2,5 % pour anesthetization et le moniteur de respiration et attendez pendant 2 min, ou jusqu'à ce que les réflexes primaires (limbe cornéen et postérieur) sont sensibles n’est plus
   3. Retirer la souris de la chambre d’anesthetization et d’administrer les 250 µL de la solution ci-dessus de la toxine pertussique via une injection intrapéritonéale (i.p.) à l’aide d’une seringue 0,5 mL avec une aiguille de 30 ^1/2 G.
   4. Préparation de l’inoculum injectable pour la vaccination :
      1. Prepare Solution A à l’aide de 2 mg/mL de solution de peptide de _180-199 P0 (avec > 98 % de pureté, séquence S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) dans la solution saline à 0,9 %.
      2. Préparation de Solution B à l’aide de 20 mg/mL de solution de Mycobacterium tuberculosis (voir Table des matières) dans Freund ' adjuvant complet de s (FCA, comprenant : 15 % mannide monoolate + 85 % d’huile de paraffine et 0,5 mg/mL des morts et secs desséchés M Mycobacterium butyricum).
      3. Faire l’inoculum final d’injection, combiner des parties de volume égal de Solutions A et B dans un batteur de perle et mélangez-les à une vitesse maximale de 1 min à température ambiante.
         Remarque : Des Solutions A et B peuvent être gardées en stock et stockées à 4 ° C pendant un maximum d’un mois mais l’inoculum final combiné doit être fraîchement préparée le jour de l’injection de la souris.
2. Lors de la journée 0, administrer 50 µL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) dans une souris via une injection sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 23 G.
   Remarque : L’injection peut être placée entre les omoplates, ou entre les membres postérieurs et la queue sur le dos de caudal.
3. Le jour 1, font de la solution de la toxine pertussique de 1,2 µg/mL (en MT-PBS) et administrer 250 µL dans une souris par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue 0,5 mL avec une aiguille de 30 ^1/2 G.
4. Le jour 3, répéter l’étape 1.3 ci-dessus.
   NOTE : Solutions mères A et B peuvent être constituées et stockées à 4 ° c pendant un maximum d’un mois. Toutefois, l’inoculum injectable final, produit par la combinaison des solutions mères A et B, doit être fait le jour de l’injection de.
5. Le jour 8, administrer 50 µL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) dans une souris par une injection sous-cutanée (Voir l’étape 1.2 ci-dessus), sur le même site d’injection comme à l’étape 1.2 (pour chaque animal)

2. score clinique

1. effectuer des cliniques marquant à partir de tous les jours le jour 0.
2. Donnez chaque souris un score de 0, 1, 2, 3 ou 4 selon les critères publiés ⁴. Voir le tableau 1 pour la notation clinique EAN.
   Remarque : Par souci de cohérence, un effort doit être fait pour marquer la souris en même temps quotidiennement par le même chercheur.

3. Évaluation de la fonction de moteur

Remarque : le rendement moteur est évalué en parallèle avec un score clinique de la même cohorte d’animaux. L’appareil d’évaluation de la fonction motrice doit être connecté à un ordinateur qu’a un système d’imagerie de fonction de démarche (voir Table des matières) installé. Il est également recommandé que toutes les souris à évaluer doivent être habitués à la tâche en cours d’exécution avant l’induction de l’EAN. Pour ce faire, les pistes de pratique (2 séries de tests par souris) sont exécutées trois jours avant l’induction de la maladie (journée -3).

1. Ouvrir l’appareil d’évaluation de la fonction motrice et allumez le bouton lumière.
2. Scruff la souris fermement et encrer ses pieds en l’abaissant dans un récipient rempli d’encre rouge tout en tenant sa queue.
   Remarque : Cette étape est requise pour la souche C57BL/6, mais peut être ignorée si une souche de souris avec une couleur de la robe blanche est utilisée.
3. Placez votre souris dans le compartiment en marche et régler la vitesse du tapis roulant à 15 cm/s.
4. Tourner sur le tapis roulant et cliquez sur le " dossier " bouton pour capturer la requête en cours d’exécution de la souris à l’aide de la fonction de marche système d’imagerie (voir Table des matières).
5. Utiliser un timer et mesurer chaque course pour 36 s. Après 36 s, arrêter l’enregistrement et arrêt du tapis roulant.
   Remarque : Les souris qui ne peut pas terminer avec succès la tâche en cours d’exécution pour cet intervalle s 36 sont considérés comme ayant échoué.
6. Enregistrer le fichier vidéo dans le dossier.
7. Répéter les étapes ci-dessus pour chaque souris pour être évalué. Les souris avec la même tâche en cours d’exécution de test tous les 3 jours.
8. Analyser les fichiers vidéo édités à l’aide de logiciels pour les paramètres de fonction de démarche (voir Table des matières).
   Remarque : Les détails de la façon d’analyser les différents paramètres du moteur varient entre logiciels donc veuillez consulter le fabricant ' instruction s avant l’analyse. Pour obtenir une preuve histologique d’axonal et myéline par immunohistochimie ou microscopie électronique, animal tissus peuvent être pris à la toute étape post motricité évaluation selon les objectifs spécifiques de la recherche.

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Résultats

Peptide de_180-199 P0 induite par EAN dans des chenaux de souris C57BL/6 pour une maladie monophasique avec score clinique début de post 6 jours premier gravité score de vaccination (dpi) et maximale est observée du dpi 25 suivi par certains score clinique amélioration de 40 dpi durée (Figure 1)^4,9. En termes de fonction de la démarche, les souris commencent à échouer à une tâche e...

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Discussion

Le présent rapport décrit une méthode simple pour provoquer l’EAN utilisant le peptide de_180-199 P0 chez les souris C57BL/6, qui permet la quantification des principaux déficits neuropathologiques et fonctionnelles chez la souris induits avec EAN. Distincte pour le protocole d’induction EAN décrit ici est l’utilisation de l’anesthésie, tout en effectuant les injections de vaccination. L’utilisation de l’anesthésie isoflurane améliore grandement la capacité de faire en sorte que le volume t...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc