Sérum et Plasma copie numéro détection par PCR en temps réel

Résumé

Ce manuscrit décrit l’analyse de variation numéro de copie exécutée dans l’ADN de sérum ou de plasma à l’aide de la méthode PCR en temps réel. Cette méthode convient pour la prédiction de la pharmacorésistance chez des patients de cancer de la prostate résistant à la castration, mais ça pourrait être instructif aussi pour d’autres maladies.

Résumé

Sérum et plasma cellulaire ADN gratuit (cfDNA) a été établi comme une source informative et non invasif de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer, pronostic, surveillance et prévision de résistance au traitement. À partir de l’hypothèse que le nombre de copies de gènes androgène récepteurs (AR) (CN) gain est un événement fréquent de cancer de la prostate métastatique castration résistance (CRPC), nous proposons d’analyser cet événement dans cfDNA comme biomarqueurs prédictifs potentiels.

Nous avons évalué AR CN en cfDNA à l’aide de 2 différents tests de PCR en temps réel et de 2 gènes de référence (RNaseP et il Y A1). Quantité d’ADN de 60 ng a été utilisée pour chaque combinaison de dosage. AR Gain CN a été confirmée par PCR numérique comme une méthode plus précise. Analyse de la variation de CN a déjà été démontré d’être informatif pour la prédiction de la résistance au traitement dans le cadre de la CRPC, mais il pourrait être utile également à d’autres fins dans des milieux différents patients. Analyse CN sur cfDNA présente plusieurs avantages : il est non invasif, rapide et facile à exécuter, et il commence à partir d’un petit volume de matière de sérum ou de plasma.

Introduction

Cellulaire gratuit ADN (cfDNA) dans le sang en circulation a été démontrée pour être une source optimale de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer, pronostic, surveillance et prévision de traitement resistance^1,2. De nombreuses études ont montré une bonne concordance entre les altérations de l’ADN (mutations, exemplaire numéros variations, modifications épigénétiques dans les tissus) et ceux que l'on trouve dans le plasma échantillons correspondant¹, confirmant que l’ADN de tumeur (ADNct) en circulation est instructif pour les tumeurs primaires et métastatiques tissu altérations³. La possibilité d’étudier ADNct permet ainsi à la reconstruction des réarrangements génomiques et variations de numéro (CNV) copie spécifique oncogènes⁴, identifier les cellules potentiellement métastatiques clonales et subclonal. ADNct s’est avéré être cliniquement utile surtout pour le suivi des traitements du cancer car il abrite des mutations spécifiques et CNV, associés à des thérapies ciblées spécifiques^5,6. Il surmonte la nécessité pour les biopsies tissulaires et permet des résultats pouvant être obtenus à des moments différents au cours d’un traitement de cancer spécifique de façon non invasive.

En ce qui concerne le cancer de la prostate, une corrélation significative entre la circulation acellulaire androgène CNVs récepteur (AR) et traitement réponse à abiratérone et enzalutamide il a été établi, indiquant nombre copies gène AR (CN) en cfDNA peut être un biomarqueur prometteur capable de prévoir le traitement résistance^7,8,9,10,11. CNV de gènes spécifiques dans ADNct peut être évaluée à l’aide de différentes approches avec sensibilité différente, coût et rapidité (e.g. PCR en temps réel, numérique et Next Generation Sequencing).

Nous décrivons ici une approche simple et rapide, basée sur les analyses de duplex dans la technologie PCR en temps réel, pour l’évaluation de CN AR en cfDNA du sérum et du plasma échantillons^7,8. Nous avons examiné deux différentes épreuves PCR conçus sur deux différentes régions génomiques dans l’intron 5 d' AR (Xq12) et deux autres gènes, comme des gènes de référence standard interne connus pour avoir un statut de numéro de copie normale dans le cancer de la prostate (RNaseP, Situé sur la 14q11 ; Il Y A1, situé sur 1 p 34). Nous avons sélectionné des gènes de référence deux, plutôt qu’un, pour augmenter la précision et la sensibilité des résultats. Une quantité d’ADN de 60 ng a été amplifié pour chaque combinaison de test (test combiné pour AR-assay_1 + RNaseP et AR-assay_2+ ans1). Trois échantillons d’ADN sérum ou le plasma des hommes en bonne santé ont été mis en commun et utilisés comme un étalon. Nous avons examiné les seuils de > 1,5 pour le gain de l’AR et < 0,5 pour la suppression. L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle est souple et que des autres gènes peuvent aussi être évalués, changer les gènes de référence interne, sur la base du type de tumeur et caractéristiques.

Protocole

Le protocole consiste en l’isolement de l’ADN d’échantillons de sérum ou de plasma pour effectuer la PCR en temps réel pour l’analyse nombre de copie. Extraction d’ADN, contrôle de quantité d’ADN (spectrophotomètre) et la PCR en temps réel pour des objectifs spécifiques ont été réalisés. Dans la Figure 1, un résumé des procédures et des délais sont signalés.

Le protocole suit les directives de l’IRST Human Research Ethics Committee.

1. traitement et collecte de sérum

1. Recueillir environ 5 mL de sang total dans un tube de sérum sans anticoagulant pour obtenir sérum. Maintenir les tubes de sang à 4 ° C jusqu’au traitement.
2. Tubes à centrifuger à 1 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
3. Transvaser avec soin sérum dans tubes de 2 mL.
4. Jeter le tube collecteur et congeler immédiatement le surnageant à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

2. traitement et collecte de plasma

1. Recueillir environ 10 mL de sang total dans un tube à plasma EDTA pour obtenir le plasma. Remplir le tube et puis inverser 8 fois. Maintenir les tubes de sang à 4 ° C jusqu’au traitement.
2. Centrifuger le tube à 1 800 g pendant 15 min à température ambiante avec aucun réglage du frein sur la centrifugeuse.
3. Transvaser avec soin la partie supérieure du plasma dans des tubes de 2 mL. Répétez le transfert, en laissant au moins 1 mL du surnageant au-dessus de la couche leucocytaire.
   NOTE : Transfert de la partie supérieure du liquide surnageant réduit le risque de contamination par des cellules ou des débris cellulaires.
4. Jeter le tube collecteur et congeler immédiatement le surnageant à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. isolement du sérum ou du Plasma

NOTE : Isolement de l’ADN du sérum ou du plasma doit être effectuée en utilisant le protocole commercial modifié dans les étapes suivantes.

1. Décongeler une aliquote (contenant de 0,5 à 2 mL) de sérum ou de plasma à la température ambiante.
2. Vortex et mélanger l’échantillon et transférer 0,5 mL de sérum ou de plasma dans un tube transparent de 1,5 mL. Congeler le reste du matériel à-80 ° C.
3. Ajouter 50 µL de protéinase k (20 mg/mL) directement dans l’échantillon.
4. Ajouter 0,5 mL de tampon de lyse à l’échantillon et mélanger bien en pipettant également.
5. Fermer les tubes et les incuber les échantillons à 56 ° C pendant 15 min dans le bloc chauffant.
6. Ajouter la quantité d’éthanol 100 % indiquée au tampon de lavage 1 et 2, comme indiqué par le fabricant.
7. Ramener les échantillons à la température ambiante et ajouter 0,5 mL d’éthanol absolu et mélanger bien en pipettant également.
8. Ajouter 650 µL du mélange obtenu à l’étape de 3,7 à la colonne de séparation et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.
9. Jeter le tube contenant le débit à travers et placer la colonne sur un nouveau tube de prélèvement propre. Répétez les étapes 3.8 et 3.9 une fois de plus.
10. Ajouter 500 µL de tampon de lavage 1, sans mouiller le rebord de la colonne et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.
11. Jeter le tube contenant le débit à travers et remplacez-le avec un nouveau tube de prélèvement propre.
12. Ajouter 500 µL de tampon de lavage 2, sans mouiller le rebord de la colonne et centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 3 min.
13. Jeter le tube contenant le débit à travers et remplacez-le avec un nouveau tube de prélèvement propre.
14. Centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 3 min enlever n’importe quel tampon de lavage résiduelle.
15. Placer la colonne dans un tube propre 1,5 mL. Ajouter 150 µL de tampon d’élution et attendre 7 min afin d’assurer que cette mémoire tampon mouille la colonne.
16. Centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min.
17. Pipetter l’élution de l’étape 3.16 encore une fois dans la même colonne et centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 1 minute afin de garantir une récupération maximale de l’ADN.

4. dilution et Quantification de l’ADN

1. Effectuer la quantification de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Utiliser 2 µL de l’échantillon sur un spectrophotomètre de table selon les instructions du fabricant.
   Remarque : Si la quantité d’ADN ne suffit pas de procéder à la PCR en temps réel (au moins 120 ng), effectuer un nouveau processus d’isolement de l’ADN.
2. Diluer l’ADN du sérum ou du plasma à 2,5 ng/µL dans un volume suffisant pour tous les Real-time PCR (environ 50 µL).

5. Real-time PCR

1. Dégel copie numéros tests, test de gène de référence, des échantillons d’ADN dilué et calibrateurs regroupés au sein de la glace. Équilibrer à température ambiante le mélange maître qui est stocké à 4 ° C.
2. Préparer un mélange de 1 µL de dosage cible 1 µL de test de gène de référence et 10 µL du mélange maître pour 3 répétitions de chaque échantillon et calibrateurs mis en commun. Préparer le mélange, y compris un contrôle négatif (eau) et 2 échantillons supplémentaires.
3. Dans une plaque 96 puits, aliquote 12 µL du mélange dans chaque puits. Ne pas les tubes pipette ou spin.
4. Ajouter 8 µL (concentration de 2,5 ng/µL) de chaque échantillon d’ADN et les calibrateurs mis en commun dans chaque puits. Ne pas les tubes pipette ou spin. Changer le cône pour chaque puits.
   Remarque : 30 échantillons d’ADN peuvent être traitées pour chaque expérience en temps réel à l’aide de la plaque à 96 puits : 30 x 3 échantillons + contrôle de mise en commun + négatif calibrateurs de 1 x 3 = 94.
5. Tourner brièvement vers le bas de la plaque à 1 000 x g.
6. Exécutez la plaque en utilisant le protocole suivant : tenir la scène à 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min.

6. interprétation et analyse des données

1. Dans la section « option », sous les résultats de terrain amplification, définissez le seuil de Ct à 0,2 pour le premier gène cible analysé. Répétez l’ensemble pour les gènes de chaque cible ou de référence. Pour exporter le fichier PCR en temps réel dans l’extension .txt, appuyez sur « Exporter » dans la barre d’outils. Drapeau que les « résultats » dans la sélection des données à exporter → choisissent comme type de fichier l’extension .txt → presse « démarrer l’exportation » → fermer l’outil d’exportation.
2. Ouvrez le logiciel d’analyse et importez le fichier .txt (importation → barre d’outils).
3. Sélectionnez le nom du fichier à analyser et sélectionner le paramètre d’analyse de la barre d’outils (symbole de jeu).
4. Spécifier l’échantillon étalon et le nombre d’exemplaires de la cible (par exemple, 1 exemplaire pour le gène AR ) connu. Appuyez sur « appliquer ».
5. Pour chaque échantillon, omettre un puits avec différent delta Ct (ΔCt) en comparaison avec d’autres puits.
6. Effectuez une nouvelle analyse de l’expérience (press play symbole).
7. Évaluer les résultats par le nombre de copies bar parcelle ou de la table.
   NOTE : Le tableau de résultats contient de nombreux paramètres comme la confiance, de Z-score et répétitions analysées qui pourraient être utiles pour l’interprétation des résultats.

Résultats

Total cfDNA concentration était quantifiable par spectrophotométrie pour tous les échantillons analysés, apparaître une médiane de 6,12 ng/µL (gamme : 2.00-23,71 ng/µL) pour les échantillons de sérum et une médiane de 3,21 ng/µL (gamme : 2.31-8,49 ng/µL) pour les échantillons de plasma. Nous avons analysé un total de 115 échantillons par des expériences PCR en temps réel.

La sensibilité du test a été éval...

Discussion

AR Analyse de la CN dans l’échantillon de sérum et le plasma représente une nouvelle approche non invasive pour la stratification des patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration (fonciers). Il a été démontré récemment que le CN AR est capable de prédire les résultats chez les malades fonciers avec abiratérone et enzalutamide, avant et après chimiothérapie^7,8,9,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Serum Tubes	Becton Dickinson	367814	whole blood tube for serum
BD Vacutainer EDTA Tubes	Becton Dickinson	366643	whole blood tube for plasma
Ethanol absolute	VWR		the user could use also other companies
TaqMan Copy Number assay	Thermo Fisher Scientific	4400291	Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modified)	Thermo Fisher Scientific	4467084	Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4326708	Master mix for Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Qiagen	51304	DNA extraction kit
MicroAmp 96-Well Plates	Thermo Fisher Scientific	N8010560	plates for realt time PCR
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	-	the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA
7500 Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystem	-	the user could use also other real time instrument
CopyCaller Software	Applied Biosystem	-	Software for copy number analysis