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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour l’isolement de Salmonella typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec biotine et streptavidine.

Résumé

Salmonella typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les vésicules appelés phagosomes afin d’être dégradée. Isolement de S. Typhimurium-phagosomes contenant ont été largement utilisées pour étudier comment S. Typhimurium infection modifie le processus de maturation du phagosome pour empêcher la dégradation bactérienne. Classiquement, l’isolement des bactéries contenant les phagosomes a été réalisée par centrifugation en gradient de saccharose. Toutefois, ce processus prend du temps et nécessite un équipement spécialisé et une certaine dextérité. Décrite ici est une méthode simple et rapide pour l’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec des billes magnétiques conjugué streptavidine-biotine. Les phagosomes obtenus par cette méthode peuvent être suspendus dans un buffer quelconque de choix, ce qui permet l’utilisation des phagosomes isolés pour un large éventail de tests, tels que l’analyse de protéines, lipides et métabolite. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est précis, efficace, rapide, nécessite l’équipement minimal et est plus souple que la méthode classique d’isolement par gradient de saccharose-ultracentrifugation.

Introduction

Macrophages circulent des cellules phagocytaires spécialisées qui détectent, engloutissent et dégradent toute particule étrangère présente dans les tissus périphériques, allant des cellules apoptotiques à envahir les micro-organismes comme les bactéries. Dès la surface médiée par les récepteurs de reconnaissance de marqueurs spécifiques pathogène communément présentes à la surface des microorganismes (appelés profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés ou PAMPs), macrophages initier une réorganisation complexe de la membrane cellulaire en afin d’entourer et de phagocyter l' agent pathogène1.

L’agent pathogène phagocytée figure ensuite par les macrophages dans une vésicule intracellulaire appelé phagosome. Grâce à une série de fusion et d’événements de fission avec autres vésicules comme endosomes et les lysosomes, le phagosome contenant des agents pathogènes acquiert un ensemble de protéines nécessaires à l’élimination du contenu phagosome. Par conséquent, la composition enzymatique du phagosome est très variable au cours de ce processus, appelé phagosome maturation2.

Peu de temps après la phagocytose, les multimères complexe ATPase vacuolaire (v-ATPase) est incorporé dans la membrane du phagosome par fusion avec les endosomes3. Ce complexe utilise l’ATP aux protons de la pompe du cytosol vers la lumière du phagosome4. L’acidification du phagosome est essentielle pour les événements de fusion avec d’autres vésicules5 et pour l’activation d’un grand nombre d’enzymes de dégradation dépend du pH6. Un autre complexe enzymatique multimériques qui est rapidement monté sur la membrane du phagosome est le complexe NADPH oxydase (NOX). NOX complexe oxyde NADPH afin de produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont sécrétés dans la lumière du phagosome et qui contribuent significativement à la mise à mort des micro-organismes ingérés7.

Pendant les premières étapes de maturation, phagosomes présentent marqueurs généralement comme Rab5 et Rab7 des endosomes précoces et tardifs respectivement avec la sous-unité de0 V de la v-ATPase8. Fusion des phagosomes avec les lysosomes et endosomes fin se traduit par l’exposition de l’agent pathogène phagocyté à une grande variété d’enzymes hydrolytiques telles que la cathepsine protéases, lipases et9de la β-galactosidase. L’acidification de la lumière est également nécessaire pour l’activation de ces enzymes. Par exemple, le clivage de la cathepsine D pour produire la forme abrégée active est dépendante du pH10. Ces enzymes dégradent l’agent pathogène et agir comme médiateur de la production de peptides courts pathogène dérivées qui sont présentés par les macrophages majeur d’histocompatibilité (MHC) classe II des molécules complexes de lymphocytes T pour déclencher une réponse immunitaire adaptative11.

Par conséquent, maturation phagosome est cruciale pour la réponse immunitaire innée et relie les bras innées et adaptatives du système immunitaire. C’est sans surprise que les pathogènes ont évolué des stratégies pour surmonter l’élimination par les macrophages à travers le processus décrit ci-dessus de la maturation du phagosome. Par exemple, la bactérie intracellulaire, Mycobacterium tuberculosis et Legionella pneumophila empêche la maturation phagosome par Assemblée de v-ATPase inhibiteur et lumen conséquente l’acidification12,13 . D’autres bactéries, comme Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induisent la formation de pores dans la membrane du phagosome s’échapper dans le cytosol14,15. En revanche, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) est capable de modifier les propriétés du phagosome dans la vacuole pour le transformer en un endroit approprié pour sa réplication16. Cette capacité en fait S. typhimurium un modèle très intéressant pour étudier les interférences induite par l’agent pathogène de la maturation du phagosome.

S. typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les phagosomes17. Certains rapports ont décrit précédemment S. Typhimurium-phagosomes contenant présentent à thé pour les endosomes et les lysosomes18, et autres études ont révélé la fusion phagosome-lysosome empêchée sur S. Typhimurium infection19.

Au départ, phagosome maturation sur S. Typhimurium infection a été étudiée par microscopie d’immunofluorescence. Le développement des techniques d’isolement de bactéries contenant les phagosomes a permis une étude plus précise du contenu en termes de marqueurs endosome et lysosome phagosome. À ce jour, la principale méthode utilisée pour l’isolement des bactéries contenant les phagosomes est le fractionnement subcellulaire le saccharose étape dégradés18,20. Toutefois, cette méthode nécessite plusieurs étapes de centrifugation qui peuvent causer des dommages mécaniques aux phagosomes, peuvent influer sur la stabilité des composants phagosome (protéines et lipides) et prend du temps. En outre, il nécessite l’utilisation d’une ultracentrifugeuse : une pièce d’équipement spécialisé qui n’est pas accessible pour tous les laboratoires.

Récemment, une nouvelle approche a été appliquée à l’isolement bactérien contenant des phagosomes, dans lequel les bactéries pathogènes sont étiquetés avec lipopetide biotinylé (Lipobiotin) et plus tard extraite à l’aide de billes magnétiques conjugué streptavidine21 . Nous vous proposons une méthode alternative complémentaire par marquage bactériennes surfaces contenant des amines macromolécules avec NHS-biotine suivie de billes magnétiques conjugué streptavidine. Les phagosomes obtenus par cette méthode sont fortement enrichis en marqueurs endosome et lysosome et peuvent être utilisés pour un large éventail de tests, de l’analyse de la protéine à omics analyse. En outre, il ne nécessite pas d’équipement spécialisé comme ultracentrifugeuses. De plus, en éliminant les étapes de centrifugation, les dommages mécaniques aux phagosomes tant la quantité de temps employé sont réduites considérablement. Cette méthode peut être facilement adaptée pour l’isolement des phagosomes contenant d’autres bactéries telles que les Gram positif Staphylococcus aureus, également inclus dans ce manuscrit. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est un simple, rentable, et moins de temps que l’isolation classique de saccharose gradient-ultracentrifugation, rendu hautement enrichi phagosomes contenant des bactéries.

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Protocole

toutes les étapes impliquant l’utilisation de pathogènes S. Typhimurium doit être effectué dans un BSL-2 ou supérieure installation de niveau de sécurité biologique. La culture et le revêtement de l’art. Typhimurium, ainsi que l’infection des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination. L’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes peut être exécutée sur n’importe quel banc de laboratoire BSL-2.

l’extraction de la moelle osseuse de souris pour sa différenciation en macrophages a été réalisée conformément aux lignes directrices sur le bien-être animal et approuvée par l’Agence d’Etat de Rhénanie du Nord-Westphalie pour la Nature, Environnement et Protection des consommateurs [Landesamt für Natur, Umwelt et Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen ; N° du greffe : 84-02.05.40.14.082 et 84-02.04.2015.A443] et l’Université de Cologne.

1. Culturing S. typhimurium

  1. ensemencer S. Typhimurium (Souche SL1344) d’une seule colonie bactérienne dans 5 mL de bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI) en utilisant une boucle bactérienne.
  2. Incuber la suspension bactérienne dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit, avec agitation.
  3. Le lendemain, transvaser 1 mL de la suspension bactérienne dans 19 mL de bouillon BHI dans une fiole conique et incuber à 37 ° C dans un incubateur avec agitation.
  4. Surveiller l' S. croissance de Typhimurium en mesurant la densité optique (do) à 600 nm (OD 600) avec un spectrophotomètre. Mesures environ chaque 30 min.
  5. OD lorsque 600 atteint 1,0, retirer une suspension bactérienne de l’incubateur et le transfert en tube de 50 mL. Centrifuger les bactéries à 5 400 g pendant 15 min à 4 ° C.
  6. Supprimer le surnageant et remettre en suspension dans 10 mL de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS).
  7. Centrifuger à 5 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  8. Enlever le surnageant et remettre en suspension les bactéries en 4,9 mL de PBS stérile.

2. Revêtement de S. typhimurium avec billes magnétiques conjugué NHS-biotine/streptavidine

  1. Ajouter 100 µL de 10 mg/mL de biotine reliant solution (NHS-biotine dissous dans le diméthylsulfoxyde, DMSO) fraîchement préparée, à la suspension bactérienne préparé à l’étape précédente. Par exemple, diluer de 5 mg de NHS-biotine dans 0,5 mL de DMSO stérile. Mélanger correctement en pipettant également monter et descendre plusieurs fois.
  2. Diviser le mélange en cinq tubes de 1,5 mL.
  3. Laisser incuber pendant 2 h à température ambiante (RT) sur un thermoblock avec agitation constante à 350 tr/min.
  4. Centrifuger les tubes à 15 000 x g pendant 10 min à RT et éliminer le surnageant.
  5. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile, centrifuger à 15 000 x g pendant 10 min à RT et éliminer le surnageant.
  6. Répéter l’étape 2.5 deux fois plus pour supprimer complètement la biotine excès reliant solution.
  7. Après le dernier lavage, resuspendre le culot dans 1 mL de PBS stérile.
  8. Transférer 100 µL de solution de billes magnétiques conjugué streptavidine 10 mg/mL dans un tube de 1,5 mL et laissez-le sur le support magnétique pendant 5 min.
  9. Supprimer le solvant avec une pipette, prendre la solution de billes magnétiques conjugué streptavidine-de la grille magnétique et il resuspendre avec 1 mL de suspension bactérienne enduite de biotine préparée à l’étape 2.7.
  10. Laisser incuber pendant 1 h à RT sur un thermoblock avec agitation constante à 350 tr/min.
  11. Placer la solution sur la grille magnétique ; attendre 5 min et puis retirez avec une pipette les bactéries qui n’adhèrent pas au mur (Gardez-le dans un tube étiqueté comme " non couché bactéries "). La fraction adhérant à la paroi du tube en contact avec l’aimant est la bactérie biotine-streptavidine.
  12. Enlever le tube contenant la bactérie étiquetée de la grille magnétique et remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile.
  13. Placer à nouveau sur le support magnétique, attendre 5 min et utilisez une pipette pour supprimer le PBS.
  14. Répéter les étapes 2.13 et 2.14 deux fois plus pour éliminer toutes les bactéries qui ne sont pas recouvertes de billes magnétiques conjugué streptavidine.
  15. Après le dernier lavage, remettre en suspension les bactéries recouvertes dans 500 µL de PBS stérile et le tube sous l’étiquette " enduit bactéries ".
  16. Compter la colonie (UFC) d’unités des deux formant " bactéries non couché " et " enduit bactéries " solutions en ensemençant des dilutions en série sur plaques de gélose BHI. Environ la 2 x 10 8 UFC/mL de bactéries recouvertes sont obtenus à partir de 20 mL de la suspension bactérienne avec OD 600 de 1.0. Garder la suspension bactérienne couché à 4 ° C à utiliser le jour suivant pour infecter les macrophages.

3. Infection de BDMDs

  1. le jour même où les bactéries sont recouvertes de biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine, plaque entièrement différenciés BMDMs 22 dans les plats de 6 cm à une densité de 5 x 10 6 cellules / plat.
  2. Le lendemain, centrifuger la suspension bactérienne enduit à 15 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Enlever le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) à une concentration de 10 x 10 6 UFC/mL.
  4. Pour infecter les macrophages à une multiplicité d’infection (MOI) de 10, retirer le support des BMDMs et ajouter 5 mL de suspension bactérienne enduit préparée. MOI optimale peut être évalué pour chaque type de cellule ou but expérimental des phagosomes isolés.
  5. Incuber à ta pendant 10 min pour synchroniser phagocytose.
  6. Incuber à 37 ° C dans une étuve à 2 CO 5 % pendant 30 min à ouvrir la phagocytose. Autres types de cellules peuvent nécessiter des temps d’incubation différents afin d’assurer l’internalisation des bactéries.
  7. Enlever le support contenant des bactéries de la vaisselle et laver les cellules avec RPMI trois fois pour éliminer les bactéries non intériorisé.
  8. Enfin ajouter 10 mL de milieu RPMI contenant 10 % de SVF et 50 µg/mL de gentamycine pour tuer toutes les bactéries non-phagocytose.
  9. Incuber les BMDMs infectés à 37 ° C, avec 5 % de CO 2 jusqu'à ce que le point de la durée désirée. Le point de la durée souhaitée doit être déterminé expérimentalement selon les bactéries et cellules du type utilisé et le but de l’analyse. Pour l’étude des événements de fusion phagosome-endosome précoce en S. Typhimurium infectés par BMDMs, il est recommandée d’une incubation de 30 min. Pour l’analyse des événements ultérieurs, les phagosomes peuvent être extraites après 2 h ou 4 h d’incubation. Incubation prolongée des macrophages avec S. Typhimurium au-delà de 24h entraîne la mort des macrophages. Avant l’extraction du phagosome pourrait probablement mener à la dégradation des molécules de biotine a étendu l’infection intracellulaire. Cependant, nous n’avons pas observé perte de biotine sur enduit-bactéries jusqu'à 24 h.

4. Isolement de S. Typhimurium-contenant des Phagosomes

tampon d’isolement
  1. Prepare le volume du phagosome requis un (50 mM tuyaux, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) en ajoutant le dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 1 mM, la cytochalasine B vers une finale concentration de 10 µM et protéase et phosphatase des inhibiteurs tel que recommandé par le fabricant.
    NOTE : TNT et cytochalasine B doivent être ajoutés pour les tampons d’isolement phagosome A toujours immédiatement avant leur utilisation. Cytochalasine B perturbe le cytosquelette, faciliter la rupture de la membrane cellulaire.
  2. Au moment voulu pointer, retirer le support des cellules infectées et laver avec du PBS stérile réchauffée à RT.
  3. Ajouter 750 µL de phagosome isolation tampons A par plat et incuber 20 min sur la glace. Lorsque vous utilisez le nombre de cellules différentes, le volume des tampons d’isolement A doit être ajusté proportionnellement.
  4. Ajouter 250 µL de tampon d’isolement phagosome B (tubes de 50 mM, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM de Mannitol et saccharose 68 mM). Roche la plaque pour faire en sorte que la mémoire tampon atteint la surface complète du plat. Lorsque vous utilisez le nombre de cellules différentes, le volume de tampon isolation B doit être ajusté proportionnellement.
  5. Enlever les cellules de la capsule en grattant doucement à l’aide d’une spatule en caoutchouc et transférez-les sur un tube préalablement réfrigérées 1,5 mL.
  6. Passer la suspension cellulaire à travers une aiguille 26G à l’aide d’une seringue de 1 mL au moins 15 fois (une aspiration plus une éjection des suspension de globules en une seule fois). C’est assez pour libérer le contenu cytosolique de BMDMs. Le nombre de passes par l’intermédiaire de l’aiguille doit être optimisé pour chaque type de cellule.
  7. Placer la suspension cellulaire sur la grille magnétique et attendre 5 min. Les particules attachées à l’aimant sont les phagosomes contenant couché - S. Typhimurium. La suspension contient le reste des composants cellulaires.
  8. Transférer la suspension dans un tube de 1,5 mL étiqueté comme " cytosol ".
  9. Retirer le tube avec les phagosomes isolés de la grille magnétique et les remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile.
  10. Placer la suspension phagosome sur la grille magnétique, attendre 5 min et retirer le PBS.
  11. Répéter les étapes 4.9 et 4.10 pour laver l' isolé S. Typhimurium-contenant des phagosomes.
  12. Enfin supprimer les PBS et remettre en suspension les phagosomes dans la mémoire tampon requise, par exemple, dans une immunoprécipitation (RIPA) tampon pour l’analyse des protéines. Environ 50-200 µg de protéine est obtenue par l’échantillon suivant ce protocole, selon le montant initial des cellules et le ministère de l’intérieur de l’infection.

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Résultats

Isolement des bactéries contenant les phagosomes par ce protocole requiert la biotinylation des bactéries dans un premier temps. Nous avons donc évalué l’efficacité de l’art. Typhimurium biotinylation par analyse de microscopie confocale de BMDMs infecté par biotinylé mCherry -S. typhimurium marquées avec la Streptavidine-Cy5. Brièvement, les BMDMs étaient infectés comme décrit dans le présent protocole avec mCherry -S. Typ...

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Discussion

Une nouvelle méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes en enduisant les bactéries avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine est décrite ici. Après perturbation douce de la membrane cellulaire, phagosomes contenant des bactéries peuvent être facilement extraites à l’aide d’un support magnétique. Nous montrons que l’étiquetage des bactéries conserve la capacité de l’agent pathogène d’induire une inflammation et n’altère pas la propriété p...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Recherche au laboratoire de la Robinson est financée par Cologne Cluster d’Excellence sur les réactions de Stress cellulaire dans les maladies Aging-Associated, Université de Cologne, Allemagne (CECAD ; subventionné par la DFG au sein de l’Initiative d’Excellence de la fédérale et gouvernements des États) et les subventions accordées par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune et Maria-Pesch Fondation de l’Université de Cologne (Allemagne).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
EZ-Link NHS BiotinThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
PIPESCarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SucroseCarl Roth4621.1
MannitolCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific1861280
Cytochalasin BSigmaC6762
DYNAL or DynaMag MagnetThermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 SpectrophotometerBio-Rad170-2501
Bacterial loop (10µl)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-streptavidinInvitrogenSA1011
anti-beta-actin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-47778
anti-mCherry antibodyThermo Fisher ScientificPA5-34974
anti-Rab5 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46692
anti-Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20943
anti-cathepsin D antibodySanta Cruz Biotechnologysc-6486
anti-Tomm20 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-17764
anti-calnexin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46669
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20357

Références

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