La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

Résumé

Ce manuscrit fournit un protocole pour l’analyse des cassures double brin de l’ADN par la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

Résumé

Cassures double brin de l’ADN (DSB) sont de graves lésions de l’ADN. Analyse de la formation et la réparation d’ORD est pertinente dans un large éventail de domaines de recherche, y compris l’intégrité du génome, génotoxicité, radiobiologie, vieillissement, le cancer et le développement de médicaments. En réponse à l’ORD, l’histone H2AX est phosphorylé à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase formant discrètes foyers nucléaires détectables par microscopie d’immunofluorescence. En outre, 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine favorisant l’ORD importante favorisant la réparation de l’ORD par fin-joining non-homologues tout en empêchant la recombinaison homologue. Selon les fonctions spécifiques de γH2AX et 53BP1, l’analyse combinée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une approche raisonnable pour une analyse détaillée de l’ORD. Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape complété par des notes méthodiques pour effectuer la technique. Plus précisément, l’influence du cycle cellulaire sur les habitudes des foyers γH2AX est démontrée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF. En outre, la valeur des foyers γH2AX comme biomarqueur est représentée dans les lymphocytes de radiographie irradié d’un individu sain. Enfin, instabilité génétique est étudiée dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë par microscopie d’immunofluorescence de γH2AX et 53BP1.

Introduction

ADN est endommagé en permanence par endogène (par exemple, la réplication stress, espèces réactives de l’oxygène, l’instabilité intrinsèque de l’ADN) et exogènes (par exemple, des radicaux chimiques, irradiation) sources (Figure 1)^{1,2 ,3,4}. Parmi les lésions de l’ADN, cassures double brin de l’ADN (DSB) sont particulièrement graves lésions et peuvent induire la mort cellulaire ou la carcinogenèse. Environ 50 ORD peut-être survenir par cellule et cycle cellulaire⁵. Dans les cellules de mammifères, la recombinaison (HR) et non-homologues fin-rejoindre (NHEJ) mis au point comme principales voies pour la réparation d’ORD (Figure 2). HR se produit à la fin de la phase S/G2 et utilise une sœur intacte chromatid comme gabarit pour réparation potentiellement exempt d’erreurs. En comparaison, NHEJ est active tout au long du cycle cellulaire et potentiellement mutagènes comme paires de bases peuvent être ajoutés ou réséqués avant la ligature de l’extrémité cassée. En outre, la fin alternative-rejoindre peut être engagé comme un mécanisme lent mutagènes réparation de secours en cas de carence NHEJ^6,7.

DSB induit la phosphorylation de l’histone H2AX à sérine 139 dans une région de plusieurs paires de megabase autour de chaque ORD. Les foyers nucléaires formant sont nommées γH2AX foyers et sont détectés par immunofluorescence microscopie⁸. ΓH2AX favorise le recrutement des autres protéines sensibles à la DSB et participe au remodelage de la chromatine, la réparation de l’ADN et de transduction de signal⁹. Comme chaque accent γH2AX est considéré comme un simple ORD, la quantification de l’ORD par microscopie d’immunofluorescence est possible, ce qui a été démontrée dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons de patient^{10,11, 12 , 13 , 14}. 53BP1 (p53 GRB2 1) est une autre protéine clé dans la médiation réparation ORD. Il est impliqué dans le recrutement de DSB-souples protéines, signalisation de point de contrôle et la synapse de DSB se termine¹⁵. En outre, 53BP1 joue un rôle essentiel dans le choix de voie de réparation ORD. Il déclenche la réparation d’ORD vers NHEJ, tandis que les RH sont empêchés¹⁶. Si l'on considère les véritables fonctions de γH2AX et 53BP1 dans la réparation de l’ORD, l’analyse simultanée de γH2AX et 53BP1 par la microscopie en immunofluorescence peut être une méthode utile pour l’analyse précise de la formation et la réparation de l’ORD.

Ce manuscrit fournit un protocole étape par étape pour l’exécution de la microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 dans les noyaux des cellules. Plus précisément, la technique est appliquée dans les fibroblastes normaux de la lignée cellulaire NHDF, dans les lymphocytes de radiographie irradié d’une personne en bonne santé et dans les cellules CD34 + d’un patient souffrant de leucémie myéloïde aiguë. Les détails de la méthode sont soulignées dans le contexte des résultats présentés.

Protocole

toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité d’éthique II de Mannheim faculté médicale de l’Université de Heidelberg. Écrit le consentement éclairé a été obtenu de tous les individus.

1. préparation des matériaux

1. solution d’Anticoagulant : préparer une solution anticoagulante de 200 UI héparine par millilitre dans le chlorure de sodium 0,9 %. Remplir chacun des tubes de collection (dessiner volume 9 mL) avec 2 mL de la solution anticoagulante avant retrait des échantillons de sang ou de moelle osseuse.
2. Solution de lyse des globules rouges : Prepare le 10 x solution de lyse des globules rouges avec 82,91 g de chlorure d’ammonium, bicarbonate d’ammonium 7,91 g et 2 mL de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique 0,5 M à un pH de 8,0 en dissolvant les agents de eau bidistillée pour un volume total de 1 L.
3. Solution de fixation : 8.3 Ajouter µL d’une solution 1 M d’hydroxyde de potassium paraformaldéhyde 360 mg (PFA) dans un tube de microplaques. Remplir le tube avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) jusqu'à la marque de 1 mL du tube et le tube dans un bloc chauffant à 95 ° C pour obtenir 1 mL d’une solution PFA de 36 % de chaleur. Transférer la solution PFA de 36 % de 1 mL dans un tube avec une capacité de 15 mL. Ajoutez 8 mL de PBS à la solution 1 mL des PFA 36 %, pour obtenir 9 mL d’une solution mère de PFA de 4 %. Aliquote de la solution-mère 4 % PFA et conserver à-18 ° C jusqu’au utilisent pour la fixation des cellules.
   ATTENTION : la solution d’hydroxyde de Potassium 1) est corrosive. Soyez conscient de protection oculaires et cutanées. 2) PFA est cancérigène. Éviter le contact avec la peau et inhalation. Préparer la solution de fixation sous une hotte à.
4. Solution perméabilisation : ajouter 50 µL Octoxinol 9 à 50 mL PBS pour obtenir une solution d’environ 0,1 % Octoxinol 9.
5. Solution de blocage : préparer 5 % et 2 % des solutions de blocage en mélangeant l’agent bloquant de protéine avec PBS et magasin à 6 – 8 ° C.

2. Préparation des échantillons,

1. fibroblastes en culture cellulaire : cultiver des fibroblastes humains de la lignée cellulaire NHDF dans un humidifié 5 % CO ₂ atmosphère à 37 ° C dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum de veau foetal, 4 mM glutamine et 1 % la pénicilline/streptomycine.
   1. Préparation d’une lame de microscope avec adherent fibroblastes
      1. enlever le support du flacon (zone de croissance de ² 75 cm) avec en croissance exponentielle des fibroblastes NHDF. Ajouter 10 mL de PBS dans le ballon. Lavez les fibroblastes adhérents doucement en agitant manuellement pendant 1 min.
      2. Supprimer le PBS et ajouter la trypsine 1 mL dans le flacon. Agiter le flacon doucement pour s’assurer que toutes les cellules adhérentes sont couverts par la trypsine. Enlever le ballon de la trypsine. Placer la fiole dans l’incubateur pendant 5 min à 37 ° C.
      3. Prendre le ballon hors de l’incubateur et ajouter 10 mL de milieu RPMI 1640 médium dans le ballon. Déposer le support de haut en bas plusieurs fois pour disperser les fibroblastes.
      4. 0,3 mL des fibroblastes dispersés sur chacun des deux champs de la lame de microscope, déposer et mettre la lame dans l’incubateur pendant 24 h pour que les fibroblastes adhèrent à la diapositive. Pour immunostaining des γH2AX et 53BP1 dans les noyaux des fibroblastes, passez à étape 3.1.
2. Des échantillons de patients
   1. des échantillons de sang : utilisez les tubes de prélèvement qui ont été remplis avec 2 mL de la solution anticoagulante et ajoutez 7 mL de sang dans les tubes. Stocker les échantillons pendant une nuit à température ambiante (c.-à-d., 18-20 ° C). Le lendemain, isoler la phase G0/G1 au repos des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité (étape 2.2.3).
   2. Des échantillons de moelle osseuse : utilisez les tubes de prélèvement qui ont été remplis avec 2 mL de la solution anticoagulante stock (point 1.1) et ajouter la moelle osseuse 7 mL dans les tubes. Stocker les échantillons pendant une nuit à température ambiante (c.-à-d., 18-20 ° C). Le lendemain, isoler la phase G0/G1 au repos des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité (étape 2.2.3). Utilisez CD34 microbilles et cellules de colonnes de séparation pour isoler des cellules CD34 +.
   3. Isolation des cellules mononucléaires par centrifugation en gradient de densité
      Remarque : Les cellules mononucléaires sont isolées du sang et des échantillons de moelle osseuse par centrifugation en gradient de densité ^{17 , 18 , 19}.
      1. Diluer l’échantillon de sang hépariné dans un rapport de 1:1 avec du PBS et l’échantillon de moelle épinière hépariné dans un ratio de 1:3 avec du PBS. Suspendre les cellules doucement en les dessinant deux fois dans et hors de la pipette.
      2. Ajouter un volume de milieu de gradient de densité à un nouveau tube. La couche doucement le sang dilué ou la moelle osseuse sur le dessus du milieu de gradient de densité. Prendre soin de ne pas pour mélanger les deux couches.
      3. Centrifuger le tube pendant 30 min à température ambiante et 400 x g. Retirer la couche de plasma supérieur avec la pipette. Ensuite soigneusement récolter les cellules mononucléées dans la couche au-dessus du milieu de gradient de densité. Transférer les cellules mononucléaires dans un nouveau tube.
      4. Ajouter au moins trois volumes de PBS aux cellules mononucléaires dans le tube. Suspendre les cellules doucement en dessinant dans et hors de la pipette deux fois. Centrifuger le tube pendant 10 min à température ambiante et 400 x g.
      5. Le spin, éliminer le surnageant et ajouter 10 mL de 4 ° C, 1 x solution de lyse des globules rouges. Remettre en suspension les cellules doucement en dessinant dans et hors de la pipette deux fois et placer le tube sur la glace pendant 5 min. Ajouter 30 mL de PBS à 4 ° C, puis centrifuger le tube pendant 10 min à température ambiante et 400 x g.
   4. Préparation de le cytospins
      1. préparer deux cytospins avec des cellules mononucléaires des patients échantillons (c'est-à-dire, un cytospin pour γH2AX immunofluorescence souillant et un cytospin pour γH2AX et 53BP1 combiné d’immunofluorescence souillant) par centrifugation (300 x g, 10 min) de 1,0 x 10 ⁵ cellules, pour chaque préparation ( figures 3 et 4).

3. γH2AX et 53BP1 Immunofluorescence souillant

1. Fixation et permeabilization : fixer les cellules avec 200 µL de 4 % PFA pendant 10 min. Après fixation, laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de PBS de 5 min chacun sur un agitateur de laboratoire. Puis permeabilize les cellules avec 200 µL de 0,1 % 9 Octoxinol pour 10 min. laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de solution de blocage de 5 % de 5 min chacun sur un agitateur de laboratoire. Bloquer les cellules dans 30 mL de frais 5 % bloquant la solution pendant 1 h.
2. 1. L' incubation avec l’anticorps incuber une préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1/500) et l’autre préparation des cellules avec un anticorps monoclonal anti-γH2AX de souris (1/500) et un anticorps anti-53BP1 d’anticorps polyclonal de lapin (1/500) pendant une nuit à 4 ° C.
   2. Après incubation des cellules lave doucement 3 fois avec 30 mL de solution de saturation de 2 % pour chaque 5 min sur un agitateur lab.
   3. Enlever la solution de blocage et incuber la première préparation de cellules avec un anticorps secondaire de conjugué Alexa488 chèvre anti-souris (1/500) et la deuxième préparation des cellules avec un conjugué Alexa488 chèvre anti-souris anticorps secondaire ( 1/500) et d’un âne Alexa555 conjugué anti-lapin anticorps secondaire (1/500) pendant 1 h à température ambiante.
3. Milieu de montage : mettre la lame avec les cellules dans un bol et laver les cellules doucement trois fois avec 30 mL de PBS pour chaque 5 min sur un agitateur de laboratoire. Retirez le PBS et montez les cellules avec support de montage contenant 4, 6-diamidino-2-phénylindole. Mettre prudemment un lamelle couvre-objet sur le dessus du milieu de montage, afin qu’aucune bulle d’air ne sont Embedded. Attendre au moins 3 h pour la trempe du milieu de montage avant d’analyser les cellules en microscopie par fluorescence.

4. Analyse des γH2AX et 53BP1 foyers

1. la microscopie de Fluorescence : analyser les foyers de γH2AX et 53BP1 dans le noyau de la cellule avec un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI, Alexa 488 et Cy3 pendant la formation image à un objectif X 100 grossissement. Enregistrer des images avec un appareil photo et de traiter les images avec des logiciels d’imagerie appropriées.

Résultats

Analyse des foyers de γH2AX dans les cellules est plus précis dans la phase G0/G1 et la phase G2 quand γH2AX foyers apparaissent comme des points distincts de fluorescence (Figure 5 a). En revanche, analyse des foyers de γH2AX dans les cellules en phase S est compliquée par taches dispersées γH2AX pan-nucléaire causées par le processus de réplication (Figure 5 b).

Discussion

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 est une méthode utile pour analyser la formation et la réparation de l’ORD dans un large éventail de domaines de recherche. Les paramètres essentiels qui influencent les résultats des expériences sont la phase du cycle cellulaire, les agents utilisés pour la fixation et la perméabilisation des cellules, le choix de l’anticorps et le matériel et les logiciels de la microscopie à fluorescence.

L’influence du cycle cellulaire...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Sigma-Aldrich	R0883	Medium for cell culture
Heparin sodium	ratiopharm	PZN 3029843	Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%	B. Braun	PZN 1957154	Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscope slides
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Tabletop centrifuge
Cytospin device
Lid	Heraeus	76003422	Lid for working without micro-tubes
Cyto container	Heraeus	75003416	Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier	Heraeus	75003414	Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert	Heraeus	75003417	Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M	Merck Millipore	109107	Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation agent
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	Balanced salt solution
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572	Secondary antibody
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1200	Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camera system for digital recording
Isis software	Metasystems	Not applicable	Microscope software