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Résumé

Cette étude a mis en place le séquençage du génome entier pour l’analyse des mutations dans les gènes conférant une résistance aux médicaments antifongiques dans Candida glabrata. C. glabrata isolats résistants aux échinocandines, dérivés azolés et 5-flucytosine, ont été séquencés pour illustrer la méthodologie. Profils des isolats en corrélation avec la présence ou l’absence de motifs spécifiques de mutation dans les gènes de susceptibilité.

Résumé

Candida glabrata peut acquérir rapidement des mutations qui entraînent la résistance aux médicaments, surtout pour les dérivés azolés et les échinocandines. Identification des mutations génétiques est essentielle, comme la résistance observée in vitro peut souvent être corrélée avec l’échec clinique. Nous avons examiné la possibilité d’utiliser le séquençage du génome entier (WGS) pour l’analyse du génome de la résistance aux médicaments antifongiques dans c. glabrata. Le but était concrètement catalyseurs et obstacles dans la mise en place de groupes de travail et mesure son efficacité. Cet article décrit les points de contrôle clés contrôle de la qualité et les éléments essentiels de la méthodologie groupes de travail pour étudier les marqueurs génétiques associés à une sensibilité réduite aux agents antifongiques. Il estime également l’exactitude de l’analyse des données et tour-temps de test.

Une sensibilité phénotypique de 12 cliniques et une souche ATCC de c. glabrata a été déterminée par des tests de sensibilité aux antifongique. Ces trois inclus isolent paires, de trois patients, qui a mis au point la hausse des concentrations minimales inhibitrices de drogue. Dans deux paires, la seconde souche de chaque paire développé de résistance aux échinocandines. Le deuxième isolat de la troisième paire développé une résistance aux 5-flucytosine. Le reste comprend sensibles et résistantes aux azolés isolats. Simples de nucléotide simple (SNP) dans les gènes liés à la résistance échinocandine, azole et 5-flucytosine ont été confirmés dans des isolats résistants à travers WGS utilisant le séquençage de la génération suivant.  Non-synonymes SNP antifongique résistance gènes tels que FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 et FCY2 ont été identifiés. Dans l’ensemble, une moyenne de 98 % des lectures WGS des isolats de c. glabrata mappées sur le génome de référence avec une couverture d’environ 75-fold profondeur. Le délai d’exécution et le coût ont été comparables à Sanger séquençage.

En conclusion, WGS de c. glabrata était réalisable en révélant des mutations du gène cliniquement significatifs impliqués dans la résistance aux médicaments antifongiques différents classes sans nécessiter de multiples réactions de séquençage PCR/ADN. Il s’agit d’un pas positif vers la mise en place WGS capacité dans les laboratoires cliniques pour la détection simultanée des substitutions attributive de résistance aux antifongiques.

Introduction

Candida glabrata est un pathogène de plus en plus rencontré avec importance comme une espèce qui montre résistance les azoles ainsi que plus récemment, les échinocandines1,2,3. À la différence des diploïdes c. albicans, le génome haploïde de c. glabrata peut lui permettre d’acquérir des mutations et de développer la multirésistance plus facilement. Co la résistance aux deux classes de médicaments a également été rapportée4. Par conséquent, l’évaluation précoce de sensibilité aux antifongique et détection de la résistance aux antituberculeux au c. glabrata sont cruciales pour le bon traitement ciblé ainsi que dans le contexte de l’intendance antifongique pour limiter les facteurs de résistance aux antimicrobiens1 , 5 , 6. création d’un workflow efficace pour détecter rapidement la présence de mutations confirmation liés aux biomarqueurs de résistance dans des isolats résistants va également contribuer à une meilleure prescription les décisions et les résultats cliniques.

Sensibilité aux antifongique est généralement évaluée en mesurant la concentration minimale inhibitrice (CMI) qui est définie comme la plus faible concentration de drogue qui se traduit par une réduction significative de la croissance d’un microorganisme comparée à celle d’une croissance sans drogue contrôle. La clinique et le Laboratory Standards Institute (CLSI) et le Comité européen sur Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ont normalisé la sensibilité des méthodes d’essai afin de rendre la détermination MIC plus précise et cohérente7, 8. Cependant, l’utilité de MIC antifongique reste limitée surtout pour les échinocandines, en particulier en ce qui concerne les comparaisons interlaboratoires où différentes méthodes et les conditions sont utilisés9. Il existe également une corrélation incertaine des PRI avec la réponse au traitement d’échinocandine et incapacité à distinguer WT (ou sensibles) isolats de celles hébergeant FKS mutations (souches résistantes échinocandine)10,11. Malgré la disponibilité de confirmation monogéniques RFT et Sanger séquençage des marqueurs de résistance aux antifongiques, réalisation des résultats est souvent retardée à l’absence de détection simultanée de multiples résistance marqueurs5,12. Par conséquent, détection simultanée des mutations conférant la résistance à différents endroits dans le génome, activée par l’analyse basée sur le séquençage du génome entier, offre des avantages significatifs sur les approches actuelles.

(WGS) le séquençage du génome a été implanté avec succès afin de suivre la transmission de la maladie au cours des flambées, mais aussi une approche de test dans les bactéries et les virus13de résistance évaluation et drogues risque de génome. Avances récentes en technologie de séquençage des acides nucléiques ont fait le séquençage du génome entier (WGS) d’agents pathogènes dans un tour-autour-temps cliniquement exploitable techniquement et économiquement faisable. Séquençage de l’ADN offre d’importants avantages par rapport aux autres méthodes d’identification de l’agent pathogène et caractérisation employées dans les laboratoires de microbiologie14,15,16. Premièrement, il fournit une solution universelle avec la qualité, la vitesse et à haut débit. Séquençage peut être appliqué à l’un des micro-organismes et permet des économies d’échelle dans les laboratoires les ou régionaux. Deuxièmement, il génère des données dans un format « évolutif » se prêtent à la comparaison aux niveaux nationales et international. Enfin, l’utilité potentielle des groupes de travail en médecine a été augmentée par la croissance rapide des bases de données publiques contenant les génomes de référence, qui peuvent être reliés à des bases de données équivalentes qui contiennent des métadonnées supplémentaires de cliniques et épidémiologiques17 ,18.

Des études récentes ont démontré l’utilité des groupes de travail pour l’identification des marqueurs de résistance aux antifongiques des isolats cliniques de Candida spp. 10 , 19 , 20. c’est principalement en raison de la disponibilité des séquenceurs haut débit benchtop, pipelines de bioinformatique établis et diminuant le coût du séquençage21,22. L’avantage de WGS fongique sur Sanger séquençage est que WGS permet le séquençage des génomes de plusieurs sur un même essai. En outre, WGS des génomes de Candida peut identifier des mutations nouvelles cibles de médicaments, la piste évolution génétique et l’émergence des séquences-types cliniquement pertinents20,22,23. Plus important encore, en cas de multirésistance intrinsèque, WGS peut aider à la détection précoce des mutations mutantes résistantes avant traitement sélection22,24.

Ici, nous avons examiné la faisabilité du dépistage WGS-activé des mutations associées à la résistance à différentes classes d’agents antifongiques. Nous présentons une méthodologie pour la mise en œuvre des groupes de travail de l’utilisateur final et les perspectives de laboratoire de diagnostic mycologique. Nous avons inclus dans cette analyse trois isoler des paires d’échantillons de trois cas cliniques distinctes dans lequel in vitro la résistance aux échinocandines et 5-flucytosine au fil du temps suite à un traitement antifongique.

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Protocole

Aucune approbation déontologique a été requise pour cette étude.

1. préparation sous-culture et inoculum à Candida glabrata

  1. Sélectionnez un groupe d’isolats de C.glabrata à étudier qui devrait également inclure au moins un c. glabrata American Type Culture Collection (ATCC) modèle de sensibilité connue.
  2. Sous-culture un isolat en touchant une seule colonie à l’aide d’une boucle en plastique jetable stérile et les rayures sur un de Sabouraud dextrose agar (SDA) plaque8.
  3. Incuber la plaque SDA pendant 24 à 48 heures à 35 ° C pour une culture pure d’isolat avec une bonne croissance.

2. détermination de la sensibilité aux antifongique

  1. Utiliser une boucle en plastique jetable stérile pour prendre 4-5 colonies d’environ 1 mm de diamètre d’une individualisation fraîchement c. glabrata isoler sur plaque SDA. Resuspendre dans 3 mL d’eau distillée stérile. Bien mélanger en douce de pipetage pour obtenir une suspension homogène.
  2. Ajuster la densité des cellules à 0,5 McFarland, qui est équivalent à 1 x 106 à 5 x 106 cellules/mL à l’aide d’un densitomètre 8.
  3. Les épreuves de sensibilité à l’aide de test commercial (voir Table des matières et réactifs) sur tous les c. glabrata isole suivant instructions du fabricant. Interpréter la sensibilité des isolats issu des micros résultantes des médicaments antifongiques, conformément aux lignes directrices CLSI et préparer le rapport (tableau 1)8.

3. génomique extraction de l’ADN pour le séquençage

  1. Remettre en suspension une anse de colonies sur une plaque SDA fraîchement cultivée dans 300 µL de 50 mM EDTA dans un tube de 1,5 mL.
  2. Ajouter 40 µL de zymolyase (10 mg/mL) à la suspension et doucement la pipette 5 fois jusqu'à ce que la suspension est uniforme.
  3. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 à 2 h digérer la paroi cellulaire. Laisser refroidir à température ambiante pendant 5 min.
  4. Centrifuger la suspension à 14 000 x g pendant 2 min et puis retirer délicatement le surnageant.
  5. Extraire l’ADN genomic DNA extraction kit directives (voir Table des matières).
  6. Remettre extrait granule d’ADN dans 50 µL de 10 mM tampon Tris (pH 7,5-8,5) au lieu de la mémoire tampon d’élution fourni dans le kit.
  7. Vérifier la pureté de l’ADN par la mesure de la densité optique (O.D) à 260/280 nm25.

4. génomique quantification de l’ADN

  1. Préparer un 1 x tampon Tris EDTA (TE) fourni dans le kit de test basé sur les directives du fabricant pour le test de détection de fluorescence (voir Table des matières).
  2. Diluer l’échantillon d’ADN en ajoutant 2 µL à 98 µL de 1 x tampon TE (volume final de 100 µL, dilution facteur 01:50) dans un plaque bien 96 jetables. Cette étape de dilution peut être effectuée soit manuellement en utilisant une pipette multicanaux ou par manipulation workstation de liquides automatique.
  3. Préparer l’éventail des normes en diluant le lambda de l’ADN (100 µg/mL) fourni dans le kit de test de fluorescence (tableau 2) et notamment pour la mesure ainsi que des échantillons.
  4. Ajouter 100 µL de colorant fluorescent à 100 µL dilué des échantillons d’ADN et de normes pour la réaction. Incuber 5 min à température ambiante, abrie de la lumière.
  5. Mesurer la fluorescence de tous les échantillons, fondées sur les directives du fabricant.
  6. Tracer la courbe d’étalonnage à l’aide de la lecture de fluorescence et calculer la concentration initiale des échantillons ADN.
  7. Déterminer le volume de l’ADN et un tampon Tris 10 mM (pH 8) d’être ajouté à ajuster la concentration en ADN à 0,2 ng/µL.
  8. Effectuer des dilutions de l’ADN à l’aide de liquides automatique station de travail. Cette étape est également possible de pipetage manuel.

5. préparation de bibliothèque d’ADN

Remarque : Préparation de la bibliothèque et le séquençage a été réalisée suivant les protocoles et les lignes directrices fournies par la société (Figure 1A) du fabricant (voir Table des matières).

  1. Tagmentation et PCR amplification
    1. Une nouvelle plaque 96 puits rigide de paroi mince de l’étiquette.
    2. Ajouter 5 µL de quantifiés entrée ADN à 0,2 ng/µL (1 ng au total) pour chaque échantillon de puits de la plaque.
    3. Ajouter 10 µL de tampon de tagmentation et 5 µL de tampon de l’amplification à chaque bien contenant de l’ADN et Pipetez doucement pour bien mélanger. Sceller la plaque avec un joint de la plaque adhésive.
    4. Placer la plaque dans un thermocycleur et exécutez le programme PCR suivant : 55 ° C pendant 5 min et maintenez à 10 ° C. Lorsque l’échantillon atteint 10 ° C, procéder immédiatement à neutraliser.
    5. Ajouter 5 µL de tampon de neutralisation à la plaque à neutraliser la réaction de l’amplicon et Pipetez doucement le mélange. Sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    6. Ajouter 15 µL d’indexation mastermix PCR aux échantillons.
    7. Utilisez une boîte de tubes d’apprêt index disponibles pour une configuration du format de la plaque à 96 puits, afin que chaque échantillon obtient une combinaison unique d’indices basés sur le modèle de l’index (tableau 3).
    8. Disposer les tubes d’apprêt index dans l’index Egouttoir (Figure 1B) en utilisant l’ordre indiqué dans le modèle au tableau 3 et enregistrer la position des indices sur le gabarit.
    9. Placer la plaque tagmentation avec ajouté mastermix PCR sur l’indice Egouttoir avec les tubes de l’index dans l’ordre.
    10. Mettre tubes amorce 1 index à disposition verticale et indice amorce 2 tubes en disposition horizontale sur le panier de l’indice. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter avec précaution 5 µL d’amorces d’index pour chaque échantillon.
    11. Remplacer vieux bouchons de tubes de l’indice avec nouveaux plafonds pour éviter la contamination croisée entre les indices.
    12. Sceller la plaque à l’aide de chasseurs de plaque 96 puits clair et effectuer la deuxième PCR comme suit : 95 ° C pendant 30 s, 12 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 5 min.
  2. Nettoyage de la PCR
    1. Transférer le produit PCR pour PCR-nettoyage, de la plaque tagmentation sur une plaque de fond de puits (voir Table des matières).
    2. Vortex la solution commerciale de billes magnétiques (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant et ajoutez 30 µL de perles à chaque produit de la PCR dans la plaque de fond de puits.
    3. Secouer la plaque sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 2 min et incuber à température ambiante sans agiter pendant 5 min.
    4. Placer la plaque sur un support magnétique pendant 2 min jusqu'à ce que le liquide surnageant a été compensé.
    5. Jeter le surnageant soigneusement avec la plaque encore sur le support magnétique.
    6. Ajouter 200 µL d’éthanol à 80 % fraîchement préparée avec la plaque sur le support magnétique.
    7. Incuber les plaques sur le support magnétique pendant 30 s et soigneusement retirer et jeter le liquide surnageant sans déranger les perles.
    8. Répéter l’étape de lavage et laisser les perles à sécher à l’air pour l’éthanol excès de 15 min. Retirer le cas échéant.
    9. Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 52,5 µL de tampon de resuspension aux talons.
    10. Secouer la plaque sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 2 min et incuber à température ambiante pendant 2 min sans agiter.
    11. Placer la plaque sur le support magnétique et permettent le surnageant effacer.
    12. À l’aide d’une pipette multicanaux, transvaser avec soin 50 µL de surnageant de la plaque de nettoyage pour une nouvelle plaque rigide.
  3. Normalisation de la bibliothèque
    1. Décongeler les réactifs de normalisation bibliothèque conformément aux directives du fabricant (voir Table des matières).
    2. Transférer 20 µL du liquide surnageant de la plaque de nettoyage pour une nouvelle plaque de puits profonds.
    3. Ajouter 45 µL de suspension de billes magnétiques et sceller la plaque avec un film adhésif.
    4. Secouez la plaque sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 30 min. Ce temps d’incubation est essentiel et ne doit pas être dépassé.
    5. Placer la plaque sur un support magnétique pendant 2 min et confirmer que le surnageant a été compensé (Figure 1B).
    6. Retirer et jeter le surnageant dans un conteneur approprié des déchets dangereux avec la plaque encore sur le support magnétique.
    7. Retirer la plaque du support magnétique et laver les billes avec 45 µL de tampon de lavage.
    8. Secouez la plaque tampon de lavage sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 5 min.
    9. Placer la plaque sur support magnétique pendant 2 min, puis jeter le surnageant lorsqu’il devient clair.
    10. Retirer la plaque du support magnétique et répéter le lavage avec le tampon de lavage.
    11. Retirer la plaque du support magnétique et ajouter 30 µL de NaOH 0,1 N.
    12. Secouez la plaque avec NaOH 0,1 N sur un agitateur de microplaques à 1800 tr/min pendant 5 min, puis placer la plaque sur le support magnétique pendant 2 min ou jusqu'à ce que le liquide est clair.
    13. Ajouter 30 µL de tampon d’élution dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 96 puits rigide paroi mince final bibliothèque normalisée.
    14. Transférer 30 µL de surnageant de plaque de normalisation à la plaque finale bibliothèque normalisée pour rendre le volume final 60 µL. Les bibliothèques sont maintenant prêts à être séquencé.
  4. Détermination de la Concentration de bibliothèque d’ADN par qPCR
    1. Décongeler le mastermix, les apprêts et les normes fournies dans le kit de qPCR conformément aux directives du fabricant (voir Table des matières).
    2. Combiner les mastermix réactif PCR et les amorces fournies dans le kit de qPCR suivant instructions du fabricant et aliquotes peuvent être conservés à-20 ° C.
    3. Pour déterminer la concentration de bibliothèque d’ADN, faire une dilution de 1/8000 des bibliothèques d’ADN à l’aide d’un tampon Tris 10 mM (pH 8) en effectuant une dilution au 1/100 (bibliothèque d’ADN µL 1,5 à 148,5 µL de tampon Tris) suivie d’une dilution de 1 : 80 (2 µL de 1/100 à 158 µL de tampon Tris).
    4. Secouer la plaque de dilution à 700 tr/min pendant au moins 1 min et centrifuger à 14000 × g pendant 1 min.
    5. Préparer 20 µL de réaction PCR finale en mélangeant 4 µL de bibliothèque d’ADN dilué ou de normes de l’ADN et 16 µL de mastermix.
    6. Effectuer la PCR, les paramètres du constructeur dans le thermocycleur suivants : 95 ° C pendant 5 min, 35 cycles de 95 ° C pendant 30 s et 60 ° C pour 45 s et final 65 ° C et 95 ° C pour l’analyse des courbes de fusion.
    7. Obtenir les valeurs de Ct des bibliothèques d’échantillons de l’ADN et des normes de la qPCR thermocycleur.
    8. Générer une courbe d’étalonnage de la valeur de Ct des normes (Figure 2). Définir la plage QC inférieure et supérieure de ± 3 cycles de la moyenne. Par exemple, si la valeur Ct moyenne est de 13 cycles puis le QC se situe entre 16 et 10 cycles.
    9. Déterminer les concentrations de bibliothèque individuelle et moyenne (ALC) de la courbe d’étalonnage et les valeurs de Ct.
    10. Déterminer le volume des bibliothèques regroupées totales (PAL) à utiliser basée sur calcul donné ci-dessous pour l’ordonnancement final étant donné que la concentration de bibliothèque cible est entre 1,4-13:08.
      Remarque : Bibliothèque concentration obtenue de qPCR moyenne = ALC ; Total des bibliothèques regroupées (PAL) = ALC / 2 ; Dénaturé PAL (DAL) = PAL * 0,666
      Selon le volume du DAL qui est mélangée au tampon, est la concentration de bibliothèque pour être ajouté à la cellule de flux. Par exemple, si 65 µL de bibliothèque est ajouté à 835 µL de tampon, puis à partir de cette dilution (Dil 1) 195 est ajouté à un volume total de 1300 µL : (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = Concentration finale (doit être entre 1,4-13:08)

6. Bibliothèque mise en commun et le séquençage de Initiating Benchtop séquenceur

  1. Cartouche de réactif de dégel conformément aux directives du fabricant. Souscrire à une nouvelle cellule d’écoulement de son emballage de stockage de 4 ° C et porter à température ambiante au moins 30 min avant l’ordonnancement. Sortir de la cartouche de mémoire tampon et tampon de séquençage prechill avant utilisation (voir Table des matières).
  2. Préparer une bibliothèque de contrôles en mélangeant 5 µL de bibliothèque (1 nM) et 5 µL de 0,2 N NaOH. Vortex brièvement et laisser incuber 5 min à température ambiante pour dénaturer la bibliothèque de contrôles torons.
  3. Ajouter 5 µL de 200 mM Tris-HCl, pH 7 et vortex. Ajouter 235 µL de tampon de séquençage prérefroidies et mélanger doucement. Le volume total est de 250 µL avec concentration finale de contrôle bibliothèque à 20 h.
  4. Bibliothèques d’ADN de piscine en transférant 5 µL de chaque bibliothèque d’échantillons à séquencer de la plaque finale bibliothèque normalisée dans un tube unique basse-bind 1,5 mL.
  5. Ajouter 30 µL de bibliothèque regroupée et 30 µL de 0,2 N NaOH pour dénaturer les bibliothèques dans un autre tube de liaison faible.
  6. Vortex de la basse-bind tube et laisser incuber 5 min à température ambiante pour dénaturer les bibliothèques torons.
  7. Ajouter 30 µL de 200 mM Tris-HCl, pH 7 à tube avec des bibliothèques dénaturés à neutraliser la réaction.
  8. Ajouter 65 µL de suspension neutralisée bibliothèques dénaturé et 835 µL de tampon de séquençage préalablement réfrigérées et vortex pour bien mélanger.
  9. Dans un tube de liaison faible final combiner ce qui suit : 195 µL de bibliothèques dénaturés neutralisées, 1.30 µL de bibliothèque de contrôles et 1103.70 µL de tampon de séquençage. Mélanger correctement.
  10. Charger le mix final de bibliothèque (1300 µL) dans l’endroit indiqué sur la cartouche de réactif.
  11. Mise en place le séquençage géré par entrer dans les détails de projet et l’échantillon dans le séquenceur désigné site suivant les directives.
  12. Séquençage initier suivant les lignes directrices. Charger la cellule d’écoulement, la cartouche de réactif avec les bibliothèques et la cartouche de mémoire tampon dans le séquenceur de benchtop.
  13. Enregistrer les numéros de lot de toutes les trousses de réactifs et de cartouches utilisées dans le séquençage.

7. données téléchargement du site Web de séquençage

  1. Télécharger des fichiers FASTQ, suivez les instructions du fabricant fournies sur le site Web.
  2. Pour une bonne qualité tourner vérifier que le pourcentage Q30 est ≥ 75 % et cluster densité est entre 170-280 K/mm2 avec optimum à 200-210 K/mm2 (tableau 4).

8. analyse de données de séquençage

  1. Importer des fichiers FASTQ d’échantillons séquencées dans le progiciel intégré d’analyse données (voir la Table des matières).
  2. Créer un flux de travail de séquençage dans le logiciel en ajoutant des fonctionnalités de liste à savoir tailler, cartographie de référence (référence select du génome), remaniement des locaux et analyse variante (Figure 3A) en utilisant les paramètres figurant dans le tableau 5.
  3. Exécuter le workflow en sélectionnant un seul échantillon ou un lot de fichiers d’exemple FASTQ et enregistrer des fichiers de sortie dans des dossiers désignés échantillon.
  4. Générer rapport pour la profondeur de la couverture de séquence, régions cartographiées et liste des variantes structurelles au génome (Figure 3B).
  5. Liste des variantes structurelles permet de rechercher des synonymes polymorphismes (SNP) dans les gènes conférant la résistance et virulence.
  6. Préparer le rapport en énumérant les SNP, gène et nombre d’isolats résistants ou sensibles (tableau 6).

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Résultats

Treize c. glabrata , comprenant des souches ATCC 90030 et 12 c. glabrata du laboratoire de référence clinique de mycologie (isolats CMRL1 à CMRL12), l’hôpital Westmead, Sydney ont été étudiés (tableau 1). Il s’agissait de trois paires d’isolats CMRL-1/CMRL-2, 3/CMRL CMRL-4 et CMRL-5/CMRL-6 obtient avant et après traitement antifongique sans aucun lien épidémiologique entre eux 24 (tableau 1).

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Discussion

Cette étude a déterminé faisabilité, délais approximative et la précision de détection WGS-guidée de la pharmacorésistance dans c. glabrata. Le délai (TAT) pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage a été de quatre jours et la déclaration des jours d’une à deux résultats analysés. Cela se compare au moins un montant similaire TAT pour des analyses de sensibilité des plaques de culture et Sanger sequencing avec un nombre significativement plus élevé d’échantillons. Environ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ont aucun intérêts financiers concurrents et aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Centre d’infectiologie et de microbiologie, de la santé publique. Les auteurs n’ont pas reçu tout autre financement pour cette étude. Les auteurs remercient les Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann et Ranjeeta Menon de leurs conseils d’experts et d’assistance avec l’expérience de séquençage du génome entier.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

Références

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
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