Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Résumé

Nous présentons une méthode combinant les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière et deux photons d’imagerie pour enregistrer des transitoires de Ca^{2 +} en dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë.

Résumé

Imagerie de calcium (Ca^{2 +}) est un outil puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle de Ca^{2 +} signaux intracellulaires dans les dendrites neuronales. Ca^{2 +} fluctuations peuvent se produire à travers une variété de membrane et mécanismes intracellulaires et jouent un rôle crucial dans l’induction de la plasticité synaptique et la régulation de l’excitabilité dendritique. La capacité d’enregistrer différents types de signaux de Ca^{2 +} en ramifications dendritiques est donc précieuse pour des groupes d’étudier comment dendrites intègrent l’information. L’avènement de la microscopie biphotonique a fait ces études beaucoup plus facile en résolvant les problèmes inhérents à l’imagerie dans les tissus vivants, tels que la diffusion de la lumière et le photovieillissement. En outre, grâce à la combinaison de techniques électrophysiologiques classiques avec deux photons Ca^{2 +} imagerie, il est possible d’étudier Ca^{2 +} fluctuations locales dans les dendrites neuronales en parallèle avec les enregistrements de l’activité synaptique Soma. Nous décrivons ici comment utiliser cette méthode pour étudier la dynamique des locaux Ca^{2 +} transitoires (chats) dans les dendrites des interneurones inhibiteurs GABAergiques. La méthode peut être également appliquée à l’étude dendritiques Ca^{2 +} signalisation dans différents types de neurones dans des tranches de cerveau aiguë.

Introduction

La contribution d’un neurone à l’activité du réseau est en grande partie déterminée par la nature dynamique des entrées synaptiques qu’il reçoit. Traditionnellement, la principale méthode de caractérisation de l’activité synaptique dans les neurones s’est fondé sur les enregistrements de patch-clamp de la cellule entière somatique des courants postsynaptiques évoqués par stimulation électrique des axones de passage. Toutefois, la seule activité des synapses situées dans la partie proximale est véridiquement signalée dans ce cas¹. En outre, afin d’évaluer les mécanismes spécifiques à synapse, enregistrements de paires de neurones et de dendrites à un endroit précis ont été utilisés pour cibler les synapses d’intérêt et les mécanismes d’intégration dendritique, respectivement. Une percée majeure dans le domaine de la physiologie synaptique a été atteint par un mariage des techniques optiques et électrophysiologiques. Excitation biphotonique microscopie à balayage laser (2PLSM) en combinaison avec les outils d’optogenetic et de Ca^{2 +} imagerie peut révéler des détails extraordinaires de l’organisation dynamique de l’activité synaptique à connexions neuronales spécifiques dans des tranches de cerveau dans vitro et in vivo.

Plusieurs avantages principaux faits 2PLSM se démarquer de l’excitation classiques, un photon microscopy²: (1) en raison de la nature non linéaire d’excitation à deux photons, la fluorescence est générée uniquement dans le volume focal, et représentent tous les photons émis signaux utiles (pas besoin de trou d’épingle) ; (2) longueurs d’onde, utilisés en 2PLSM, pénètrent dans les tissus de diffusion plus efficacement ; en outre, les photons dispersés sont trop diluées pour produire l’excitation biphotonique et fluorescence de fond ; (3) le photovieillissement et phototoxicité sont également limités à plan focal. Par conséquent, malgré le coût élevé des systèmes 2 photons par rapport aux microscopes confocaux classiques, la 2PLSM reste une méthode de choix pour enquête à haute résolution de structure neuronale et la fonction dans les tissus vivants épais.

La première application de 2PLSM dans les tissus de diffusion a été à l’image de la structure et la fonction des épines dendritiques³. 2PLSM en combinaison avec Ca^{2 +} imagerie a révélé cette fonction d’épines comme des compartiments isolés biochimiques. Puisque de nombreux types de neurones, il y a une correspondance biunivoque entre les épines et les synapses individuels⁴, deux photons Ca^{2 +} imagerie bientôt est devenu un outil de reporting de l’activité des synapses individuelles en tissu intact^{5, 6,7,8}. En outre, 2PLSM Ca^{2 +} imagerie a été utilisée avec succès pour surveiller l’activité des canaux calciques unique et les interactions non linéaires entre les conductivités intrinsèques et synaptiques, ainsi que d’évaluer l’État et l’activité dépendante- régulation du Ca^{2 +} signalisation neuronale dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}.

Le calcium est un omniprésent second messager intracellulaire, et son organisation spatio-temporelle subcellulaire détermine la direction de réactions physiologiques, de modifications de la force synaptique à la régulation des ions canaux, croissance dendritique et la colonne vertébrale, comme Bien que la mort cellulaire et la survie. Dendritiques Ca^{2 +} élévations se produisent via l’activation de multiples voies. Potentiels d’action (PA), backpropagating pour les dendrites, ouvrir de canaux voltage-dépendants de calcium¹² et produire des transitoires relativement globales Ca^{2 +} (chats) dans les dendrites et les épines¹³. La transmission synaptique est associée à l’activation de postsynaptique Ca^{2 +}-récepteurs perméables (NMDA, Ca^{2 +}-perméable AMPA et kaïnate), déclenchement synaptique chats^6,14,15. Enfin, SUPRALINÉAIRE Ca^{2 +} événements peuvent être générés en dendrites sous certaines conditions^11,12,13,16.

Deux photons Ca^{2 +} imagerie en combinaison avec les enregistrements électrophysiologiques de patch clamp emploie synthétique Ca^{2 +}-indicateurs fluorescents, qui sont généralement livrés par le biais de l’électrode de patch pendant les enregistrements de cellules entières . Une méthode standard pour la quantification de Ca^{2 +} dynamique repose sur l’indicateur de double méthode^17,18. Il utilise deux fluorophores avec des spectres d’émission bien séparées (par exemple, une combinaison d’un rouge Ca^{2 +}-insensible colorant vert Ca^{2 +} indicateurs, tels que l’Oregon vert BAPTA-1 ou Fluo-4) et présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de l’indicateur unique. Tout d’abord, un Ca^{2 +}-colorant insensible est utilisé pour localiser les petites structures d’intérêt (ramifications dendritiques et épines) où l’imagerie^{2 +} Ca sera effectuée. Deuxièmement, le rapport entre la variation de la fluorescence verte et rouge (ΔG/R) est calculé en guise de [Ca^{2 +}], qui est pratiquement insensible aux variations de fluorescence de base en raison de fluctuations [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. en outre, les changements de fluorescence peuvent être calibrés en termes absolus, Ca^{2 +} concentration¹⁹.

Une préoccupation générale lors de l’exécution de deux photons Ca^{2 +} imageries expériences en tranches aiguës est la cellule santé et la stabilité de l’acquisition d’image en raison de la puissance du laser haute généralement utilisée. En outre, dans les^{2 +} expériences d’imagerie, de Ca on se préoccupe de la perturbation et l’importante surestimation de subcellulaire Ca^{2 +} dynamique dû au fait que servent d’indicateurs de Ca^{2 +} très mobiles exogène Ca^{2 +} mémoires tampons. Ainsi, le choix de l’indicateur de Ca^{2 +} et sa concentration dépend du type neuronal, l’amplitude attendue des chats et la question expérimentale.

Nous avons adapté la méthode biphotonique Ca^{2 +} imagerie pour recherche de Ca^{2 +} fluctuations de dendrites de GABAergique interneurones^{9,10,11,20,21 , 22}. alors que la majeure partie des premiers Ca^{2 +} études d’imagerie ont été effectuées dans les principaux neurones, interneurones inhibiteurs présenter une grande variété de mécanismes^{2 +} Ca fonctionnels qui sont distincts de ceux des cellules pyramidales^{20 , 23 , 24}. ces mécanismes interneurone spécifiques (par exemple, Ca^{2 +} perméables récepteurs AMPA) pourraient jouer un rôle spécifique dans la régulation de l’activité des cellules. Dendritiques Ca^{2 +} signalisation dans des interneurones est une cible tentante pour complément d’enquête, deux photons Ca^{2 +} imagerie dans les dendrites des cellules présente des difficultés supplémentaires, d’un diamètre plus mince des dendrites et manque d’épines pour une particulièrement élevé Ca^{2 +} liaison capacité endogène. Comme nos recherches portent sur l’étude des interneurones hippocampe, le protocole suivant, alors qu’il y a lieu à différentes populations de neurones, a été adapté pour faire face à ces défis.

Ce protocole a été exécuté avec un microscope confocal de deux photons commercial, qui était équipé de deux détecteurs externes, non-descanned (NDDS™), modulateur électro-optique (MOE) et un Dodt balayage dégradé contraste (CGT) et installé sur une table optique. Le microscope a été couplé avec un laser Ti : Sapphire de multiphoton mode bloqué à 800 nm (> 3 W, 140 impulsions fs, 80 Hz fréquence de répétition). Le système d’imagerie était équipé d’une plate-forme d’électrophysiologie standard, y compris une chambre de perfusion avec contrôle de température, une plateforme de traduction avec deux micromanipulateurs, un amplificateur de la microélectrode contrôlé par ordinateur, un numériseur, une stimulation appareil et logiciel d’acquisition de données.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées selon les orientations de bien-être de l’Animal Protection Comité de Université Laval et le Conseil canadien de protection des animaux.

1. préliminaire préparation (facultatif : préparer 1 jour à l’avance)

1. Préparer trois types de solution liquide céphalorachidien artificiel (FSCA) (Normal, saccharose et Solutions de récupération, 1 L ; voir tableau 1). Ajuster l’osmolalité des solutions à 300 ± 10 mOsm²⁵ et refroidir le FSCA-Sucrose jusqu'à un point près du point de congélation (0-4 ° C).
   Remarque : L’utilisation d’une solution de découpe de faible teneur en sodium (ACSF-saccharose) permet de préserver la viabilité des neurones dans les couches superficielles des tranches aiguë²⁶.
2. Préparation de 0,75 mL de patch-solution contenant un fluorophore rouge (p. ex., Alexa-594) et un indicateur de calcium synthétique vert (p. ex., Oregon vert BAPTA-1 ; voir tableau 1). Inclure la biocytine (voir tableau 1) dans la solution de patch si post hoc d’identification morphologique des cellules enregistrés est nécessaire.
3. Ajuster l’osmolarité de la solution à 280 ± 5 mOsm et pH à 7,35 ± 0,5. Conserver la solution dans le réfrigérateur ou sur la glace en permanence.
   Nota : Choix de l’indicateur de calcium doit être fondée sur sa gamme dynamique et sur la nature de l’enquêtés événements^{2 +} Ca.
4. À l’aide d’un extracteur de micropipette, préparer des pipettes de patch de capillaires en verre borosilicate (voir Table des matières) avec une pointe de 2 µm ≈ (résistance de pipette de MΩ 3-5) et de pipettes de stimulation de capillaires en thêta-verre borosilicaté (voir Table de Matériaux) avec une pointe de 2 à 5 µm.
   Remarque : Les paramètres extracteur pour faire des pipettes d’une forme et un diamètre donné seront déterminés par le type de filament extracteur et les résultats de test de rampe pour un type donné de verre.

2. préparation de la tranche hippocampe

1. Anesthésier la souris (P13-20 ; la souche et le sexe de la souris est déterminé par la question expérimentale étant adressée) avec 1 mL d’isoflurane, placé sur une serviette en papier dans une chambre de narcose par inhalation. Lorsque l’animal est profondément anesthésié, comme en témoigne d’un manque de mouvement et la respiration lente, retirez-la de la chambre de narcose et décapiter à l’aide d’une guillotine.
2. Exposer le crâne en coupant la peau avec une petite paire de ciseaux à l’arrière du crâne vers le nez. Une petite paire de pinces-gouges mini OS permet de faire un trou au niveau du bregma. Puis utilisez les ciseaux pour faire une coupe caudal-à-rostral le long de la suture sagittale. Avec les pinces-gouges saisir l’arrière de chaque lambeau de crâne et ascenseur vers le haut et vers l’extérieur pour enlever le crâne couvrant chaque hémisphère.
3. Après que le cerveau est complètement exposé, sapent les nerfs optiques avec une petite spatule. Enlever le cerveau du crâne et la mettre dans une boîte de Pétri contenant continuellement oxygéné, froid ACSF-saccharose (voir le tableau 1 pour la concentration de saccharose).
   1. Si les tissus des souris âgées est nécessaire, effectuer une perfusion intracardiaque avec une seringue (25G) contenant 20 mL de glacee ACSF-Sucrose avant l’extraction du cerveau pour obtenir des tranches de bonne qualité.
4. Préparer des tranches d’hippocampe du cerveau animal extrait.
   1. Laissez le froid de cerveau pendant environ 2 min. Placez un morceau de papier filtre sur un plat de Pétri sous glace, transférer le cerveau sur le papier filtre. Disséquer les deux hémisphères.
   2. Coller les hémisphères disséqués (l’orientation est déterminée par l’objectif expérimental pour obtenir des tranches de coronal, transversale, ou horizontale) sur une table vibratome et plongez-le dans le bac de vibratome rempli glacé oxygéné ACSF-saccharose. Faire des tranches épaisses à une température d’environ 1 ° C 300 µm en utilisant un refroidisseur vibratome ou en plaçant la glace autour de la barre d’État vibratome.
   3. À l’aide d’un pinceau plat, s’accumulent les tranches contenant l’hippocampe (jusqu'à 6 tranches par hémisphère) dans un bain contenant oxygéné ACSF-récupération chauffée à 37 ° C.
   4. Laissez les tranches dans le bain de l’ACSF-récupération pendant au moins 45 min.

3. enregistrements de Patch-clamp de la cellule entière

1. Mise en place dans un bain positionné sous l’objectif d’une tranche de hippocampe (grossissement : 40 x, ouverture numérique : 0,8) d’un microscope biphotonique à balayage laser. Continuellement perfuse le bain oxygéné ACSF-normale chauffé à 30-32 ° C à raison de 2,5 à 3 mL/min.
2. Utiliser le contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) ou microscopie Dodt-SGC pour localiser une cellule d’intérêt à l’aide de sa taille, la forme et la position.
   Remarque : Selon la population de neurones ciblés, un modèle de souris transgénique permet de localiser facilement les cellules d’intérêt. Dans ce cas, cette étape peut être substituée avec utilisation d’une source lumineuse fluorescente.
3. Remplir une pipette de stimulation avec une solution de FSCA normale contenant le fluorophore rouge (p. ex., Alexa-594).
4. La valeur de la pipette de stimulation (connectée à un appareil de stimulation électrique) sur le dessus de la tranche pour que l’astuce est dans la même région que la cellule d’intérêt.
5. Après avoir remplir la pipette solution de patch et en l’attachant à un stade de tête, réglez-le sur la tranche afin que son extrémité soit directement au-dessus de la cellule d’intérêt.
6. Insérer une seringue dans un robinet à trois voies et connectez-le à la pipette-à travers le tube en plastique. Injecter une pression positive constante dans la pipette (≈ 0,1 mL) à l’aide de la seringue. Garder le robinet d’arrêt en position « close ».
7. Activer le module amplificateur contrôle et passer en mode voltage clamp en cliquant sur le bouton « VC ». Ouvrez le logiciel d’acquisition de données électrophysiologie (p. ex., clampex) pour l’acquisition de signaux électrophysiologiques et cliquez sur l’icône « Membrane Test » de l’avoir continuellement envoient une impulsion de tension carrée (5 mV, 10 ms), qui est nécessaire pour surveiller changements dans la résistance de la pipette.
8. Abaissez la pipette jusqu'à ce qu’il est juste au-dessus de la cellule cible. Lors de prise de contact avec la membrane cellulaire, enlever la pression en tournant le robinet d’arrêt en position « ouverte ».
   Remarque : Contact avec la membrane cellulaire est détecté lorsqu’une légère augmentation de la résistance de la pipette (≈ 0,2 MΩ) est considéré et une petite échancrure sur la cellule est causée par une pression positive.
9. Appliquer une légère pression négative à la pipette en utilisant une seringue vide insérée dans le robinet jusqu'à ce que la résistance de la pipette fournie par le logiciel atteigne 1 GΩ. Dans la fenêtre « Membrane Test » du logiciel d’acquisition de données, serrer la cellule à -60 mV.
10. Continuent jusqu'à ce que la cellule est ouverte et la configuration de la cellule entière est obtenue en appliquant une pression négative. Détection de cet état de la cellule est basée sur le changement soudain de la résistance de la pipette (à partir de 1 GΩ à MΩ de 70 à 500 selon le type d’interneurones) et l’apparition de forts transitoires capacitifs dans la fenêtre « Membrane ».

4. deux photons Ca^{2 +} imagerie

1. Si vous êtes intéressé dans les réponses postsynaptiques excitateurs, ajouter le gabazine de bloqueur du récepteur GABA_A (10 µM) et le bloqueur des récepteurs GABA_B CGP55845 (2 µM) dans le bain du fsca.
2. Dans le module amplificateur contrôle logiciel, définir la configuration de patch à courant-clamp en cliquant sur le bouton « CC » et enregistrer le modèle de mise à feu de la cellule en réponse aux injections somatiques de courant de dépolarisation (0,8 à 1,0 nA, 1 s). Attendez au moins 30 min pour la cellule à remplir avec les indicateurs présents dans la solution de patch.
   Remarque : Modèle de mise à feu et les propriétés actives de la cellule peuvent être utilisées pour identifier le sous-type de la cellule ; par exemple, cellules rapide-dopage. Il est important pour la concentration de l’indicateur à stabiliser par l’intermédiaire de diffusion avant de commencer pour enregistrer les chats (voir le tableau 2 pour le dépannage).
3. Chats évoquée par AP
   1. En utilisant le logiciel d’acquisition image, commencent à acquérir des images. Localiser une dendrite d’intérêt en utilisant le signal de fluorescence rouge. Afin d’assurer une réponse visible, tout d’abord, choisissez une dendrite proximale (≤ 50 µm) car l’efficacité de rétro-propagation AP peut décliner significativement avec la distance d’interneurones GABAergiques²².
   2. À l’aide de le « outil de sélection rectangulaire » dans le logiciel d’acquisition image, zoomer sur la région ciblée et passer à la "xt » (IRLS) mode. L’analyse du poste dans l’ensemble de la branche dendritique d’intérêt. Avec les contrôleurs d’intensité laser dans le logiciel d’acquisition, fixer le deux photons laser à un niveau de puissance minimale où fluorescence vert de base est à peine visible, afin d’éviter la phototoxicité.
   3. Dans le logiciel électrophysiologie d’acquisition données logiciel d’acquisition de fenêtre et de l’image « Protocole », créez un essai d’enregistrement de la durée désirée contenant une injection de courant somatique de l’amplitude souhaitée.
      1. À l’aide de logiciels d’acquisition de l’image, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » et acquérir la fluorescence en continu pendant 1-2 répéter s. l’acquisition de l’image 3 - 10 fois. Attendez au moins 30 s entre les balayages simples pour éviter le photovieillissement. Si l’acquisition de linescans en plusieurs points le long d’une dendrite, emmenez-les dans un ordre aléatoire pour éviter les effets d’ordre.
4. Synapses évoquée par les chats
   1. Localiser une dendrite d’intérêt en utilisant le signal de fluorescence rouge.
   2. Définissez la pipette de stimulation sur la surface de la tranche au-dessus de la dendrite d’intérêt. Abaissez lentement la pipette de stimulation en place, réduisant au minimum de mouvement pour ne pas perturber la configuration cellule entière. Placez la pipette à 10 à 15 µm de la dendrite.
   3. Pour visualiser l’emplacement des microdomaines synaptiques en dendrites d’aspiny, dans le logiciel d’acquisition image, basculez vers le 'xt' mode (IRLS) et positionner la ligne le long de la branche dendritique d’intérêt.
   4. Dans la fenêtre de « Protocole » (des logiciels d’acquisition de données électrophysiologie) et logiciel d’acquisition image, créer un essai d’enregistrement qui déclenche l’appareil de stimulation après le début du procès.
   5. En utilisant le logiciel d’acquisition, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » pour scanner le long de la dendrite en continu pendant 1-2 s. Repeat acquisition 3 - 5 fois, attendre 30 s entre les balayages pour prévenir le photovieillissement.
      Remarque : La durée de scan peut être ajustée selon la cinétique de la manifestation évoquée, mais devrait être réduite au minimum pour éviter le photovieillissement (voir le tableau 2 pour le dépannage).
   6. Répétez l’étape 4.5.5 dans des conditions différentes (par exemple, différente intensité/durée de la stimulation, l’introduction d’un bloqueur pharmacologique, etc.) selon la question traitée.
   7. L’acquisition s’arrête lorsque la cellule montre des signes de détérioration de la santé : dépolarisation au-dessous de -45 mV, augmentation du niveau de base niveau^{2 +} Ca, détérioration morphologique des dendrites (p. ex., blebbing, fragmentation ; voir tableau 2 pour le dépannage).
   8. Pour obtenir des renseignements préliminaires sur la morphologie de la cellule et tenir un registre de l’emplacement de la pipette de stimulation, acquérir une Z -pile de la cellule dans le canal rouge. En utilisant le logiciel d’acquisition dans 'xyz' mode, défini les limites supérieures et inférieures de pile à toute la cellule d’image avec tous les processus inclus. Définir la « taille d’étape » à 1 µm et démarrer l’acquisition de la pile en utilisant le bouton « Démarrer l’enregistrement ».
   9. Lorsque le Z-acquisition de pile est terminée, utilisez l’option de « projection Maximum » dans le logiciel pour superposer tous les plans d’intervention de la pile et de vérifier la qualité de l’acquisition. Puis, rétracter lentement la pipette sur la tranche.
   10. Pour corriger la tranche pour identification morphologique post hoc , rapidement enlever la tranche de la baignoire à l’aide d’un pinceau plat et placez-le entre deux papiers filtres, dans un récipient Petri fsca. Remplacer le FSCA avec une solution de paraformaldéhyde (PFA) de 4 % et laisser le plat dans une pièce à 4 ° C ou le réfrigérateur une nuit.

5. immunohistochimie pour Post Hoc Identification morphologique des cellules enregistrés

Remarque : Après 1 nuit de fixation en PFA, les tranches peuvent être stockés dans un tampon phosphate (PB) avec azide de sodium (0,5 %) pendant environ 1 mois.

1. Mettre les tranches dans une solution saline tampon Tris (TBS) avec Triton X-100 (0,3 %) et d’effectuer 4 lavages (5-10 min chacun).
2. Mettre la tranche de SCT-Triton 0,3 % avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h.
3. Mettre la tranche de SCT-Triton 0,3 % à 1 %, NGS et un fluorophore conjugué streptavidine (p. ex., Alexa Fluor 546 conjugué streptavidine, 1 : 200) pour la nuit d’incubation.
4. Lavez 4 fois (5-10 min) dans les directives du SCT.
5. Monter les tranches sur lames de microscope et image à l’aide d’un microscope confocal. Pour avoir une reconstitution de la cellule complète, acquérir un Z-pile (taille d’étape : 1 µm) à l’aide d’un objectif 20 x. Pour l’imagerie une étiquette Alexa-546-conjugués, utilisez qu'un laser à 543 nm et une détection de 515-560 nm filtre choisi.

6. analyse des chats

1. Extraire les valeurs de la fluorescence des régions d’intérêt (ROIs) dans les images IRLS depuis les canaux rouge et verts et la moyenne des valeurs des multiples séquences répétées pour chaque condition réduire le bruit.
   Remarque : Lors de l’acquisition d’IRLS est effectuée le long de la dendrite, il est possible d’extraire des données de plusieurs ROIs, qui peuvent correspondre à des microdomaines dendritiques (2 à 5 µm), et permettant ainsi l’étude de la compartimentation Ca^{2 +} signal.
2. Pour chaque ROI, exprimer les changements Ca^{2 +} amplitude comme :
   
   NOTE : Ici G est la valeur de la fluorescence de la couche verte ; G₀ est la valeur de fluorescence de base de la couche verte pendant la période de stimulation préalable ; R est la valeur de la fluorescence de la couche rouge¹⁸. Comme excitation biphotonique est très localisée et ne génère pas d’une expérience significative, soustraction de fluorescence de fond n’est pas requise.

Résultats

En utilisant le protocole présenté ici, nous avons obtenu des chats évoquées par injection de courant somatique et par la stimulation électrique dans les dendrites des interneurones oriens/alveus dans la région CA1 de l’hippocampe. Après patcher un neurone, identifié selon sa forme et sa position, nous avons acquis linescans travers une dendrite proximale en plusieurs points au vu des distances depuis le soma (Figure 1 a). Nous avons observé une di...

Discussion

La méthode présentée ici montre comment la combinaison de deux photons Ca^{2 +} imagerie et électrophysiologie patch clamp peut être utilisée pour l’étude dendritiques Ca^{2 +} la signalisation dans les dendrites neuronales dans des tranches de cerveau aiguë. Cette méthode permet le suivi des deux locaux Ca^{2 +} élévations évoquées par AP électrique de stimulation ou backpropagating segments dendritiques et somatique réponse de la cellule. Ce qui rend un excellent outil pour étu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems