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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce manuscrit décrit comment incision-comme des lésions sur des monocouches de cellules épithéliales cultivées idéalement modèle embobiné guérison in vitro, permettant pour l’imagerie confocale ou microscopie à balayage de laser, et qui peuvent fournir de haute qualité données quantitatives et qualitatives pour l’étude de comportement de la cellule tant les mécanismes impliqués dans la migration.

Résumé

La migration cellulaire est un aspect obligatoire pour la cicatrisation des plaies. Création artificielle plaies sur des modèles animaux de recherche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, tandis que potentiellement manque de précision. In vitro culture de lignées de cellules épithéliales fournit une plate-forme appropriée pour des recherches sur le comportement migratoire de cellule dans la cicatrisation des plaies et l’impact des traitements sur ces cellules. La physiologie des cellules épithéliales est souvent étudiée dans des conditions non-confluent ; Toutefois, cette approche ne peut pas ressembler à conditions de cicatrisation naturelle. Perturbant l’intégrité de l’épithélium par des moyens mécaniques, génère un modèle réaliste, mais peut faire obstacle à l’application des techniques moléculaires. En conséquence, les techniques de microscopie basée sont optimales pour l’étude de la migration de cellules épithéliales in vitro. Nous détaillons ici deux méthodes spécifiques, le dosage zéro blessure artificiel et le dosage avant migration artificielle, qui peut obtenir des données quantitatives et qualitatives, respectivement, sur les performances migratoires des cellules épithéliales.

Introduction

La migration cellulaire est nécessaire pour la cicatrisation des plaies, car elle est responsable de la fermeture définitive de l’écart épithélial et de la restauration de la surface perturbée1. Effectuant des blessures artificielles dans des modèles animaux permet la réplication de ce processus complexe en proches des conditions physiologiques2. Toutefois, cette approche entraîne souvent des procédures expérimentales ainsi que coûteuses, qui potentiellement manquent de précision pour l’étude des processus distincts, étant donné la nature complexe du processus de cicatrisation.

In vitro culture de lignées de cellules épithéliales fournit une alternative utile aux modèles animaux pour des recherches sur le rôle que ces cellules jouent dans la cicatrisation des plaies et les effets du traitement sur le comportement migratoire de cellule. La physiologie des cellules épithéliales est souvent étudiée par des techniques moléculaires à l’aide de cultures non-anastomosé3,4,5,6; Cependant, la rupture de l’intégrité de l’épithélium est habituellement obtenue par fines incisions mécaniques. En culture cellulaire, cela implique qu’un nombre négligeable de cellules peut-être être exposé à l’écart de la plaie, et qu’ils représentent un échantillon trop petit pour les techniques de biologie moléculaire. Cependant, ces lésions peuvent être étudiées à l’échelle microscopique, en profitant des propriétés migrateurs innées de certaines lignées de cellules épithéliales, comme le poumon de vison Epithelial cell (Mv1Lu) ou la cellule spontanément immortalisées humain des kératinocytes (HaCaT) lignes.

Ici, nous avons décrit une méthode de microscopie qui convient obtenir des données quantitatives sur la migration des cellules épithéliales dans le contexte de la cicatrisation3,4,7,8. Par ailleurs, nous présentons des méthodes supplémentaires qui sont utiles pour étudier les changements qualitativement moléculaires et morphologiques qui se produisent sur des monocouches épithéliales pendant la migration. Dans l’ensemble, ces méthodes fournissent un cadre pour étudier la dynamique et les changements morphologiques impliqués avec le comportement de cellules épithéliales et de réponse aux traitements durant la cicatrisation.

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Protocole

1. artificiel plaie gratter dosage pour des études quantitatives

  1. Préparation de monocouches de cellules
    1. Travaillant dans des conditions stériles, des graines et la croissance des cellules épithéliales Mv1Lu ou HaCaT dans des flacons de culture utilisant le milieu additionné de sérum. Actualiser le support une fois toutes les 24-48 h. Lorsque les cellules atteignent 80 % confluence, détacher les cellules en utilisant une méthode appropriée, c'est-à-dire, la trypsinisation9.
      Remarque : Mv1Lu et HaCaT des lignées de cellules épithéliales sont cultivées à l’aide de milieu de culture EMEM et DEMEM, respectivement, additionné de 2 mM de L-Glutamine et incubé à 37 ° C, avec une atmosphère contrôlée de 5 % de CO2. Chaque lignée cellulaire doit être dosée minutieusement afin de déterminer la concentration cellulaire et le calendrier nécessaires pour atteindre la pleine confluence. Généralement pour les cellules Mv1Lu ou HaCaT, 2-4 x 104 ou 4-6 x 104 cellules/puits, respectivement, sont ensemencées dans un flacon de culture de2 175 cm, et à 80 % confluence donne jusqu'à 35 x 106 Mv1Lu ou cellules HaCaT 1 x 107 .
    2. En soit une plaque de 12 puits ou 24 puits de culture, graines dans chaque puits 2 mL de cellules. Actualiser les moyens une fois chaque 24-48 h. s’assurer que nombre de cellules sont suffisamment élevées pour atteindre le confluent de 100 % après 2 ou 3 jours.
    3. Lorsque les cellules atteignent la confluence, enlevez le milieu additionné de sérum et laver deux fois avec un milieu sans sérum frais. Garder les cellules dans un milieu sans sérum pendant 24 h avant le grattage.
      NOTE : Des cellules Mv1Lu ou HaCaT n’ont pas d’exigences de substrat spécial ; Toutefois, pour les lignées de cellules sensibles à la détacher spontanément dans des conditions de milieu sans sérum, revêtement avant de la surface de plaque de culture à l’aide d’une solution de la poly-L-lysine faudrait10.
  2. Monocouche rayer
    1. Travaillant dans un environnement stérile, gratter la couche de culture faisant glisser fermement l’extrémité étroite d’un 20 µL ou embout de micropipette stérile µL 200, selon la largeur désirée de gratter. Gardez la pointe perpendiculaire à la surface de culture afin d’optimiser l’homogénéité de l’écart.
      1. Placer les plaques de culture sur une surface sombre de suivre clairement la monocouche de cellules. Si nécessaire, effectuer deux rayures perpendiculaires (en forme de croix) sur chaque puits d’étudier jusqu'à 4 zones de migration.
    2. Laver les cellules individuelles en retirant doucement doucement en ajoutant un milieu sans sérum frais et milieu de culture. Répéter deux fois, ou jusqu'à ce que plus les seules cellules ont été supprimées.
  3. Collecte de données et procédure expérimentale
    1. Prendre jusqu'à 4 images de référence avant traitement centrés sur le fossé scratch de chaque bien en utilisant un microscope à contraste de phase inversée intégrant une caméra CCD. Sélectionnez les domaines d’intérêt en alignant le bord du champ du microscope jusqu'à l’intersection adjacente de rayures.
      Remarque : En règle générale, les images sont acquises à l’aide d’un grossissement de 10 x et une taille d’image de 1 280 x 1 024 pixels. Sélection des zones d’intérêt tel que décrit ci-dessus permet pour une localisation facile et validation des mesures jusqu'à 4 / puits.
    2. Une fois que toutes les images sont acquises, désigner des puits de traitement ; échange d’un milieu frais qui contient les traitements sélectionnés au milieu dans les puits.
      NOTE : Alternativement, produits chimiques ou des composés qui ne dérangent pas homogénéité de milieu de culture, les traitements peuvent être inoculés directement dans le milieu de culture.
    3. Incuber la plaque rayée (37 ° C avec une atmosphère contrôlée contenant 5 % de CO2) tant que les conditions sous observation portée 90 % gratter des écarts. Éviter la fermeture complète.
      Remarque : Des écarts Total annule collection photo post-traitement comme territoires de référence ne sont pas détectables et la référence de temps pour la fermeture de l’espace ne peut être établie. Dans le cas des cellules Mv1Lu ou HaCaT, 16-19 h sont nécessaires pour atteindre le confluent de 90 %.
    4. Arrêter la migration cellulaire en fixant les cellules ; doucement, remplacer le milieu de culture expérimental avec 1 mL de 4 % de formol dans du PBS. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
    5. Laver les cellules pour enlever l’excès de formol ; remplacer doucement la solution dans les puits avec du PBS frais. Répétez au moins deux fois.
      Remarque : À ce stade, après scellage, plaques peuvent être stockés à 4 ° C indéfiniment.
    6. Prendre des images de référence après le traitement de chaque puits dans les zones de référence originale capturés après grattage. Utiliser le même équipement (microscope à contraste de phase optique inversée intégrant une caméra CCD) et des réglages d’image correspondante (grossissement et résolution numérique ou la densité).
      Remarque : Pour les cellules qui migrent individuellement et de combler la lacune indépendamment de la formation d’un front cohérent (par exemple, cellules humaines du cancer du sein MDA-MB-231), les images du temps peuvent permettre le calcul des vitesses de migration des cellules individuelles.
  4. Analyse d’image et de la quantification de la migration
    1. À l’aide de logiciels (par exemple, ImageJ) de traitement d’image, définir les limites de déficit zéro et déterminer la surface d’écart pour jusqu'à quatre mesures en images avant le traitement. Enregistrer les données sous forme de « surface de prétraitement gap » (PRÉGAP). Répétez la même procédure pour les photos après le traitement. Enregistrer les données sous forme de « surface de post-traitement gap » (POSTGAP).
      1. Ouvrez l’image enregistrée à l’aide de ImageJ. Dans le menu « image », définir le type d’image de 8 bits. Dans le menu de « processus », aller au sous-menu « filtres » et appliquer le filtrage « variance ».
      2. Dans le menu « image », entrez « ajuster » sous-menu et seuil définie en noir et blanc (B & W), assurez-vous que « Fond sombre » n’est pas sélectionnée. Dans le menu de « processus », aller au sous-menu « binaire » et sélectionnez « combler les trous ».
      3. Dans le menu « analyser », sélectionnez « définir les mesures » et activer « zone ». Puis dessinez la zone mesurable suivant le contour bord migrateurs, délimitant ainsi l’écart.
      4. Dans le menu « analyser », sélectionner « analyser les particules » et enregistrer les valeurs « superficie totale » pour la surface de la zone dessinée.
    2. Introduire des valeurs de superficie totale PRÉGAP et POSTGAP dans une feuille de calcul pour quantifier la migration absolue pour chaque série d’échantillons individuels comme la différence des mesures de surface de gap : PREGAP − POSTGAP [unités arbitraires]. En outre, normaliser les données de migration absolue de chaque condition d’échantillons témoins : (échantillon / contrôle) * 100 [%].
      Remarque : Pour les cellules qui migrent individuellement et de combler la lacune indépendamment de la formation d’un front cohérent (par exemple, cellules humaines du cancer du sein MDA-MB-231), la migration absolue peut être calculée en comptant les cellules envahir une centrale soit en bande le contrôle ou les échantillons traités.
    3. Tracer les sorties de quantification (voir Figure 1). Effectuer une analyse statistique si nécessaire.
Envisager le test t de Student lorsque l'on compare les deux conditions ou test d’analyse de la Variance pour le plus grand nombre de conditions.

2. artificiel Migration avant dosage d’études topographiques

  1. Préparation de monocouches de cellules
    1. Travaillant dans des conditions stériles, placer une couche de lamelles rondes stérilisé en plaques de culture vide jusqu'à ce que la surface de la plaque est entièrement recouvert.
      NOTE : Jusqu'à 12 et 33 lamelles couvre-objet d’ajustement sur 5 cm et plaques de 10 cm de diamètre, respectivement.
    2. Sur la plaque de culture, les semences délicatement un volume suffisant de cellules à une concentration qui permet de confluence de 100 % après 2 ou 3 jours. Assurez-vous que sans lamelle superpose à lamelles voisine et empêchent les lamelles de flottant en appliquant une pression douce avec une pointe de micropipette stérile. Actualiser le support toutes les 24-48 h.
      Remarque : Chaque lignée cellulaire doit être dosée minutieusement afin de déterminer la concentration cellulaire et le calendrier nécessaires pour atteindre la pleine confluence. Généralement pour les cellules Mv1Lu ou HaCaT, 2-3 x 106 ou 2.5-4 x 106 cellules/10 plaque de cm de diamètre, respectivement, sont semés. Pour les plus petites plaques, nombre de cellules doit être réduit.
    3. Lorsque les cellules atteignent la confluence, supprimez le milieu additionné de sérum et remplacez-les par un milieu sans sérum frais. Garder les cellules dans un milieu sans sérum pendant 24 h avant la blessure artificielle est effectuée.
      NOTE : Des cellules Mv1Lu ou HaCaT n’ont pas d’exigences de substrat spécial ; Toutefois, pour les lignées de cellules susceptibles de se détacher spontanément dans des conditions de milieu sans sérum, revêtement avant de la surface de la culture à l’aide d’une solution de la poly-L-lysine faudrait10.
  2. Monocouche blessant
    1. Utilisez des pinces stériles, déplacez doucement une lamelle sur une plaque propre 10 cm contenant un milieu sans sérum frais. Éviter d’endommager la monocouche en organisant la lamelle dans la périphérie avec des pincettes. Éviter une pression excessive qui pourrait entraîner le bris de la lamelle couvre-objet.
    2. Créer des blessures artificielles en faisant glisser une lame de rasoir stérilisée dans une ligne transversale sur le centre les lamelles. Faites glisser les 3-4 mm arrière-et-vient, afin d’éliminer complètement la bande centrale monocouche. Veillez à ce qu’aucun débris cellulaires ne reste attaché aux bords blessés.
      Remarque : sur un diamètre de 12 mm ronde lamelle couvre-objet, l’incision est faite à la mi de la lamelle. Veillez à laisser une traînée de cellules en face de la façade principale assez grande (au moins 2 mm de largeur) pour éviter le basculement de la lamelle dans les étapes suivantes.
    3. Transfert des lamelles blessés avec des cellules vers le haut, une plaque propre 6 puits contenant au moins 2 mL sans sérum milieu frais. Monter jusqu'à 4 lamelles/puits blessés.
    4. Laver délicatement deux fois à base de frais un milieu sans sérum pour éliminer les cellules individuelles.
  3. Échantillonnage et procédure expérimentale
    1. Doucement l’échange d’un milieu frais qui contient les traitements sélectionnés au milieu dans les puits.
      NOTE : Alternativement, produits chimiques ou des composés qui ne dérangent pas homogénéité de milieu de culture, les traitements peuvent être inoculés directement dans le milieu de culture. Procéder avec prudence pour éviter tout potentiel détachement cellulaire.
    2. Maintenir la plaque à l’intérieur d’un incubateur de cellules (37 ° C, 5 % de CO2) pour le moment expérimental désiré.
    3. Arrêter la migration cellulaire en fixant les cellules ; doucement, remplacer le milieu de culture expérimental avec 1 mL de 4 % de formol dans du PBS. Incuber pendant 15 min à température ambiante.
      Remarque : Pour les temps de parcours des expériences, enlever les échantillons de la plaque de culture et fixez-les dans une assiette pour éviter les vapeurs de formol qui affectent les autres, en cours des conditions expérimentales.
    4. Laver les cellules pour enlever l’excès de formol ; remplacer doucement la solution dans les puits avec du PBS frais. Répétez au moins deux fois.
      Remarque : À ce stade, après scellage, plaques peuvent être stockés à 4 ° C indéfiniment.
  4. Immunofluorescence (IF) et l’analyse topologique
    1. Effectuer une coloration IF et l’imagerie des lamelles individuelles comme décrit ailleurs3,4,11.
      1. Permeabilize pendant 10 min en immergeant les lamelles dans une solution de Triton X-100 de 0,3 % dans du PBS.
      2. Bloc pendant 30 min à l’aide de la solution de blocage suivante : 0,3 % d’albumine sérique Bovine ; Sérum de veau fœtal de 10 % ; 5 % de lait écrémé ; 0,3 solution de Triton X-100 % dans du PBS.
        Remarque : Bloquant la solution sans lait peut être préparé à l’avance et conservé à-20 ° C.
      3. Incuber pendant 1 heure à température ambiante à l’intérieur d’une chambre humide, avec des anticorps primaire dilué dans une solution de blocage sans lait. Placer les lamelles à l’envers dans le 15 µL de solution d’anticorps pour assurer la distribution correcte.
        Remarque : La dilution de travail des anticorps est variable et dépendra de l’anticorps en cours d’utilisation. Par exemple, les anticorps de lapin anti-c-Jun nécessite une dilution au 1/100.
      4. Laver trois fois en plongeant les lamelles dans une solution de Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS.
      5. Incuber les lamelles couvre-objet en anticorps secondaire dilué dans un tampon bloquant sans lait pendant 30 min.
        Remarque : La dilution de travail des anticorps est variable et dépendra de l’anticorps en cours d’utilisation. Par exemple, la chèvre-anti-lapin (488) nécessite une dilution au 1/400 pour une résolution optimale. Les autres réactifs étiquetage telles que la phalloïdine et Hoechst 33258 peuvent être ajoutés au tampon d’incubation à ce stade.
      6. Laver trois fois en plongeant les lamelles dans une solution de Triton X-100 de 0,1 % dans du PBS.
      7. Monter les lamelles envers une 10 µL montage média chute (p. ex., Vectashield) placé sur une lame de microscope. Laissez les lames dans l’obscurité à température ambiante durant la nuit pendant le durcissement moyen de montage. Par la suite, conserver à 4 ° C dans l’obscurité indéfiniment.
    2. Obtenir épifluorescence ou images de microscopie confocale des changements structurels qui se produisent à l’extrémité avant migration.
      NOTE : Études topologiques peuvent être effectuées par la mosaïque de photos de l’avant migration à la monocouche intérieure. Études semi-quantitatifs sont possibles par analyse de logiciels basés sur les intensités de fluorescence locale.

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Résultats

Plaie artificiel Scratch test pour des études quantitatives : évaluer le facteur de croissance épidermique (EGF) Promotion de la Migration :

EGF est un inducteur bien connu de la prolifération de cellules épithéliales et de migration et donc un témoin positif de quantification de la promotion de la migration. Les monocouches de cellules Mv1Lu et HaCaT ont été utilisées dans les essais de zéro blessure et photos avant l...

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Discussion

Sur la peau ou les muqueuses perturbation, fonction de barrière est restaurée par les actions de nombreux types de cellules, y compris les fibroblastes ou les cellules épithéliales et immunitaires. Conjointement, ces cellules subissent un complexe processus impliquant l’apoptose, prolifération, différenciation et surtout, des fibroblastes et epithelial cell migration, qui est le mécanisme ultime responsable de la restauration du tissu perturbé et le fermeture de l’écart épithéliale superficielle

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous voulons rendre grâce pour les membres plus âgés du laboratoire qui aident à améliorer et affiner ces techniques à son état actuel : Dr Celia Martinez-Mora ; Dr Anna Mrowiec, Dr Catalina Ruiz-Cañada et Dr Antonia Alcaraz-García. Nous sommes redevables à l’hôpital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de soutenir fortement le développement de ces techniques. Aussi, l’Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I + D + I et Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant no : PI13/00794) ; www.ISCIII.es. Fondos FEDER « Una manera de hacer Europa ». Nous remercions également Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca et FFIS d’assistance et de soutien administratif. Enfin, nous voulons donner Merci Dr Isabel Martínez-Argudo et la Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo pour leur aimable soutien à céder volontairement le Biomédecine et laboratoire de biotechnologie de rendre possible la partie filmée du présent document.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FranceL0102-500Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662FOptional 10 % FBS supplement
L-GlutamineLonzaBE17-605EUse at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USADE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049Dilute as appropriate
Poly-L-LysineSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)Gibco by Life Technologies14200-067Dilute to 1x
24-well culture platesBD FALCON//SARSTED734-0020
6-well culture platesSARSTEDT83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAE9644Used 10 ng/mL
Round cover glassMENZEL-GLÄSERMENZCB00120RA020SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743Martor (through VWR)MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tipsVWR732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscopeMotic SpainMoticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscopeZEISS Microimaging, GermanyLSM 510 META
10 cm Culture dishBD FALCON353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibodySanta Cruz Biotechnologysc-1694Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488InvitrogenA11008Used 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA14530Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)InvitrogenA12381Used 1:100
Bovine Serum AlbuminSanta Cruz BiotechnologySC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT9284
Skim milkBD DIFCO232100
ImageJNational Institutes of Health, USARelease 1.50i
Zen LSM 510 image processing softwareZEISS Microimaging, GermanyRelease 5.0 SP 1.1

Références

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