À l’aide de hybridation In Situ par Fluorescence (FISH) pour surveiller l’état des bras cohésion en prométaphase et métaphase j’ai Drosophila ovocytes

Résumé

Ce manuscrit présente une méthode détaillée pour la génération X-sondes de bras de chromosome et performants fluorescence in situ hybridation (poisson) pour examiner l’état de sœur cohésion des chromatides sœurs en prométaphase et métaphase que j’ai arrêté Drosophile ovocytes. Ce protocole est convenable pour déterminer si la cohésion bras méiotique est intacte ou perturbé dans différents génotypes.

Résumé

Chez l’homme, erreurs de ségrégation chromosomique dans les ovocytes sont responsables de la majorité des avortements et des malformations congénitales. En outre, comme l’âge des femmes, leur risque de concevoir qu'un fœtus aneuploïde augmente considérablement et ce phénomène est connu comme l’effet de l’âge de la mère. Une condition requise pour la ségrégation des chromosomes précis pendant les divisions méiotiques est entretien de sœur cohésion des chromatides sœurs pendant la période prolongée de la prophase que rencontrer des ovocytes. Cytologiques chez les humains et les organismes modèles suggèrent que la cohésion méiotique se détériore au cours du processus de vieillissement. En outre, des erreurs de ségrégation dans des ovocytes humains sont les plus répandus au cours de la méiose I, compatibles avec une perte prématurée de la cohésion des bras. L’utilisation d’organismes modèles est critique pour démêler les mécanismes qui sous-tendent la perte de fonction de l’âge de la cohésion. Drosophila melanogaster offre plusieurs avantages pour l’étude de la régulation de la méiose cohésion dans les ovocytes. Toutefois, jusqu'à tout récemment, seuls les tests génétiques étaient disponibles pour dosage pour la perte de cohésion du bras dans les ovocytes de génotypes différents ou dans des conditions expérimentales différentes. Ici, un protocole détaillé est fourni fluorescence in situ de l’hybridation (poisson) pour visualiser directement les défauts cohésion bras en prométaphase I et métaphase que j’ai arrêté les ovocytes de drosophile . En générant une sonde de poissons qui s’hybride au bras distal du chromosome X et la collecte des piles de Z confocale, un chercheur peut visualiser le nombre de signaux individuels de poissons en trois dimensions et déterminer si sœur chromatid bras sont séparés. La procédure décrite permet de quantifier les défauts cohésion bras dans des centaines d’ovocytes de drosophile . Par conséquent, cette méthode fournit un outil important pour étudier les mécanismes qui contribuent au maintien de la cohésion ainsi que les facteurs qui conduisent à sa disparition pendant le processus de vieillissement.

Introduction

La séparation des chromosomes pendant la mitose et la méiose exige que sœur cohésion des chromatides sœurs être créée, maintenue et publiée dans une manière coordonnée^1,2. Cohésion est établie au cours de la phase S et est véhiculée par la cohesin complexe, qui forme des liens physiques qui maintiennent la sœur chromatides ensemble. Lors de la méiose, distal par rapport à un crossover de cohésion peut également sert à tenir ensemble les homologues de recombinaison et cette association physique contribue à l’orientation correcte du bivalent sur la métaphase I de broche (Figure 1)^{3,4, 5}. Sortie du bras de cohésion à l’anaphase I permet les homologues de séparer vers les pôles opposés de broche. Toutefois, si la cohésion du bras est perdu prématurément, recombinés homologues seront perdent leur connexion physique et séparer aléatoirement, qui peut entraîner des gamètes aneuploïdes (Figure 1).

Dans les ovocytes humains, erreurs dans la ségrégation des chromosomes sont la principale cause des avortements et des malformations congénitales, comme le Syndrome de Down⁶, et leur incidence augmente de façon exponentielle avec l’âge maternel⁷. Cohésion des chromatides est établie dans les ovocytes fœtales et la recombinaison méiotique est terminée avant la naissance. Ovocytes puis arrêter au milieu de la prophase I jusqu'à l’ovulation et au cours de cette arrestation, l’association physique continue de recombinés homologues repose sur sœur cohésion des chromatides sœurs. Par conséquent, ségrégation précise au cours de la méiose et de la grossesse normale exige que cohésion reste intact pendant jusqu'à cinq décennies.

La perte prématurée de cohésion lors de l’arrestation de méiose prolongée d’ovocytes humains a été proposée de contribuer à l’effet de l’âge maternel et plusieurs lignes d’éléments de preuve appuient cette hypothèse^8,9. Toutefois, compte tenu des difficultés de l’étude méiotique cohésion dans des ovocytes humains, une grande partie de notre compréhension de ce phénomène repose sur l’utilisation du modèle organismes^{5,10,11,12, 13,14,15}.

Drosophila melanogaster ovocytes offrent de nombreux avantages pour l’étude de la ségrégation méiotique de cohésion et du chromosome. Un simple test génétique permet de récupérer des descendants de gamètes aneuploïdes et mesurer la fidélité de X-ségrégation des chromosomes sur une grande échelle^11,16,17. En outre, on peut également déterminer si erreurs de ségrégation chromosomique proviennent du fait que la recombinés homologues missegregate au cours de la méiose I, un phénotype qui correspond à une perte prématurée de bras cohésion^{11,18, 19}. direct observation de l’état de la méiose cohésion dans les ovocytes de la drosophile est également possible en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence (FISH). Bien que les oligonucléotides fluorescents qui s’hybrident aux séquences répétitives par satellite ont été utilisés pour plus d’une décennie pour surveiller la cohésion péricentromérique mature Drosophila ovocytes^4,20, analyse du bras la cohésion a été beaucoup plus difficile. Visualisation de l’état de la cohésion des bras nécessite une sonde qui s’étend sur une vaste région de l’exemplaire unique sequences et est assez brillante pour se traduire par des signaux visibles pour chaque sœur chromatides bras cohésion est absente. En outre, les conditions de fixation des ovocytes et la taille de l’ADN marqués doivent faciliter la pénétration²¹ dans l’ovocyte de drosophile mature gros (200 µm de largeur de 500 µm de longueur). Récemment, une sonde de bras a été avec succès utilisés pour visualiser les chromatides ovocyte de drosophile au cours de l’anaphase I, mais les auteurs a déclaré qu’ils ne pouvaient pas détecter un signal en prométaphase ou métaphase que j’ai arrêté les ovocytes²². Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la génération de X-bras chromosomique poisson des sondes et des conditions de préparation des ovocytes qui nous ont permis d’analyser pour une perte prématurée de la soeur de cohésion des chromatides sœurs en prométaphase I et métaphase I ovocytes. Ces techniques, qui nous ont permis d’identifier les produits des gènes qui sont requises pour le maintien de la cohésion méiotique, permettra à d’autres d’analyser pour sœur ovocytes matures de drosophile de génotypes différents vices de cohésion des chromatides sœurs.

Protocole

1. les préparatifs

1. Préparer des solutions pour l’hybridation in situ par fluorescence (FISH). Préparer toutes les solutions à l’aide de l’eau ultrapure.
   1. Préparer 5 x tampon de Robb modifiée : acétate de potassium de 275 mM, acétate de sodium 200 mM, saccharose 500 mM, 50 mM de glucose, chlorure de magnésium 6 mM, 5 mM chlorure de calcium, pH HEPES 500 mM = 7,4. Amener le pH à 7.4 en utilisant 10 N NaOH. Filtre à stériliser et conserver à-20 ° C. Décongeler et diluer jusqu'à 1 x au besoin et stocker 1 x aliquotes à-20 ° C.
   2. Préparer 10 x une solution saline tamponnée au Phosphate (PBS) à l’aide de 1,3 M NaCl, 70 mM Na₂HPO₄, 30 mM NaH₂PO₄. Amener le pH à 7.0 à l’aide de 10 N NaOH. Stériliser à l’autoclave ou filtre de stérilisation.
2. Préparer les lamelles poly-L-Lysine, un jour avant que nécessaire.
   1. Pipetter, éthanol à 70 % contenant 1 % d’acide chlorhydrique sur la surface d’une lamelle de 18 x 18 mm #1.5 et incuber 5 min. aspiration intra-utérine utilisation pour enlever le liquide. Répéter l’opération avec l’eau ultrapure stérile. Couvrir la surface de la lamelle couvre-objet avec 0,1 mg/mL poly-L-lysine et incuber pendant 10 min.
   2. Aspirez pour évacuer le liquide et laisser sécher pendant environ 10 minutes côté de poly-L-lysine de lamelles de Store vers le haut dans un récipient en plastique avec un couvercle bien ajusté pour éviter la poussière.
3. Préparer le Pasteur tiré pipettes à supprimer les solutions liquides sans enlever les ovocytes. Au-dessus d’une flamme du bec Bunsen, la chaleur au milieu d’une longue pipette Pasteur en verre tout en tirant doucement sur chaque extrémité jusqu'à ce que le verre fond et tire dehors.

2. génération de sonde de bras pour les poissons

Remarque : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à ~ 16 000-21 000 x g (vitesse maximale sur la plupart des microcentrifuges dessus de table). Centrifugeuse bref tours indiquent filature pour 5 à 15 s. Vortex indique vortex pour ~ 15 s au max vitesse sauf indication contraire.

Remarque : Les BACs pour sondes de bras peuvent provenir de BAC PAC ressources. Deux sondes de bras euchromatique du chromosome X ont été utilisés avec succès avec cette méthode. Une sonde de bras était composée de six clones BAC correspondant à cytologiques bandes 6E-7 b (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). L’autre sonde de bras se composait de six clones BAC correspondant aux bandes cytologiques 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs d’autres chromosomes de drosophile régions peuvent être visionnées sur : http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Deux sondes péricentrique qui reconnaissent la répétition de satellite bp 359 du chromosome X ont été utilisés avec succès avec cette méthode. Une sonde de 22 nucléotides a été largement utilisée et fonctionne bien (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)^19,23. Une sonde de 28 nucléotides a été récemment testée et aussi a bien fonctionné (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)²⁴. HPLC purifiée oligonucléotides 5' étiqueté avec un fluorophore spécifique a été commandé à une source commerciale (p. ex., intégration des Technologies de l’ADN).

1. Préparation d’ADN clone en suivant les instructions du kit tel que spécifié dans la Table des matières. Resuspendre le culot d’ADN obtenu à partir de 100 mL de culture en 200 µL TE ; la concentration d’ADN finale devrait se situer entre 5 et 40 ng/µL selon le clone de BAC.
2. Effectuer d’amplification d’ADN pour chaque BAC à l’aide du kit d’amplification, comme spécifié dans la table des matières et le protocole suivant. Processus d’ADN pour chaque clone individuellement. Utiliser des enzymes et des tampons fournis avec le kit en étapes 2.2.1 à 2.2.3.
   1. Fragmentation aléatoire de l’ADN : pour chaque BAC, permet de TE pour préparer 10 µL d’une solution d’ADN 1 ng/µL dans un tube PCR de 200 µL. Ajouter 1 µL de tampon de Fragmentation X 10. Placer le tube dans une machine PCR à 95 ° C pendant 4 min exactement immédiatement cool l’échantillon dans l’eau glacée et centrifuger brièvement. L’incubation est temps sensible et toute déviation peut modifier les résultats.
   2. Préparation de la bibliothèque
      Remarque : Cette méthode utilise des amorces aléatoires pour générer une bibliothèque de fragments amplifiables.
      1. Dans le tube contenant l’ADN ajouter ce qui suit : 2 µL de 1 x tampon de préparation de bibliothèque, 1 µL de Solution de stabilisation de bibliothèque. Homogénéiser au Vortex, centrifuger brièvement et placer le tube dans la machine PCR à 95 ° C pendant 2 min. refroidir immédiatement l’échantillon dans l’eau glacée et centrifuger brièvement.
      2. Ajouter 1 µL d’Enzyme de préparation de bibliothèque au tube PCR, mélanger et centrifuger brièvement. Place PCR tube dans la machine PCR et incuber comme suit : 16 ° C pendant 20 min, 24 ° C pendant 20 min, 37 ° C pendant 20 min, 75 ° C pendant 5 min, puis maintenez à 4 ° C.
      3. Prélèvement d’échantillons de la machine PCR et centrifuger brièvement. Les échantillons peuvent être amplifiés immédiatement ou conservés à-20 ° C pendant trois jours.
   3. Amplification de l’ADN de bac
      1. Ajouter les réactifs suivants à la réaction de fragments aléatoires 15 µL ensemble : 7,5 µL 10 x Amplification Master Mix, 47,5 µL nucléase eau libre, 5 µL WGA ADN polymérase. Homogénéiser au vortex et centrifuger brièvement.
      2. Place PCR tube dans la machine PCR et incuber comme suit : Initial dénaturation 95 ° C pendant 3 min, 14 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 15 s, suivie d’un recuit/extension à 65 ° C pendant 5 min, puis maintenez à 4 ° C.
      3. Après que le cyclisme est complet, dosage de la concentration d’ADN. La concentration d’ADN doit être au moins 800 ng / µL. conserver les échantillons à 4 ° C ou conserver à-20 ° C jusqu’au prêt pour la digestion. Éventuellement, évaluer taille de fragment d’ADN en exécutant 400 ng d’ADN sur un gel d’agarose à 2 %. Des fragments doit être comprise entre 200 bp à 3KO (Figure 2).
3. Enzyme de restriction digestion de l’ADN amplifié
   1. Place 20 µg d’ADN amplifié de la section précédente dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Ajouter 20 unités d’Angélique, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 unités de BfuCl, 0,5 µL x 100 BSA, 5 µL 10 x tampon de digestion d’enzymes de restriction et régler le volume à 50 µL en ajoutant la quantité appropriée d’ultrapure H₂O.
   2. Incuber le digest du jour au lendemain à 37 ° C dans un incubateur pour éviter la condensation sur le couvercle. L’éthanol précipiter l’ADN digéré. Ajouter au digest : 1 glycogène µL, acétate de sodium 3M volume 1/10, 2,5 volumes 100 % moléculaire éthanol. Incuber à-80 ° C pendant 1 h ou toute une nuit.
   3. Centrifuger pendant 30 min à 4 ° C. Granule d’ADN laver et 1 volume d’éthanol à 70 % temp ambiante et un essorage pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et laissez l’ADN granulé air sec ou séchez doucement avec un flux constant d’air.
   4. Resuspendre le culot d’ADN dans 36 µL stérile ultrapure H₂O et 1 µL d’ADN permet de doser la concentration d’ADN, qui devrait être environ 285 ng / µL. stocker l’ADN à-20 ° C.
   5. Éventuellement évaluer taille de fragment de DNA exécutant 400 ng d’ADN sur un gel d’agarose à 2 %. La plupart des fragments doit être comprise entre 100-200 bp, avec un signal plus faible jusqu'à 500 bp (Figure 2).
4. réaction de décantation de 3'
   1. Dénaturer l’ADN digéré à 100 ° C pendant 1 min dans un bloc chauffant. Refroidir immédiatement dans l’eau glacée. Pour les 35 µL d’ADN, ajouter ce qui suit : 50 µL cacodylate de sodium 400 mM, 1 µL 10 mM DTT et vortex bien. Ajouter 4 µL 25 mM CoCl₂, µL 2,5 mM 2 5-(3-aminoallyl)-dUTP Ares étiquetage trousse tel que spécifié dans la table des matières, 5 µL 1 mM dTTP, 18 µL tampon x TdT, 5et transférase terminale de deoxynucleotidyl de 1 µL (TdT) 400 U / µL. Vortex et centrifuger brièvement.
      ATTENTION : CoCl₂ est toxique, porter une protection appropriée.
   2. Incuber pendant 2 h à 37 ° C dans un incubateur pour éviter la condensation. Ajouter 1 µL de 250 mM EDTA pour arrêter la réaction et les vortexer brièvement pour mélanger. L’éthanol précipiter l’ADN à queue comme décrit ci-dessus (étapes 2.3.2 - 2.3.4). Resuspendre le culot d’ADN séché dans 10 µL stérile ultrapure H₂O. magasin l’ADN à-20 ° C jusqu’au moment de continuer.
5. Conduite de conjugaison de colorant fluorescent utilisant le kit de marquage ADN tel que spécifié dans la Table des matières.
   Remarque : Une fois colorant ajouté conserver les échantillons dans l’obscurité.
   1. Dénaturer l’ADN à queue à 95 ° C pendant 5 min dans un bloc chauffant. Refroidir immédiatement l’ADN dans l’eau glacée et centrifuger brièvement. Préparer le tampon de marquage selon les instructions de l’ensemble et ajouter 6 µL de chaque échantillon d’ADN. Resuspendre chaque tube de colorant dans 4 µL de DMSO dans le kit. Vortex et centrifuger brièvement.
   2. Utiliser un tube de colorant pour chaque réaction d’étiquetage. Ajoutez la solution de colorant à l’ADN, vortex et centrifuger brièvement. Incubez la réaction étiquetage à température ambiante pendant 2 h dans l’obscurité. Ajouter 3 µL de l’hydroxylamine 3M pour arrêter la réaction suivie de 77 µL sans nucléase H₂O de la trousse. Vortex et centrifuger brièvement.
6. Enlever le colorant non conjuguées à l’aide de la trousse de purification du PCR comme spécifié dans la table des matières. Suivez les instructions du fabricant. Éluer ADN de la colonne à l’aide de deux fois 40 µL de tampon d’élution chaque fois.
7. L’éthanol précipiter l’ADN marqué comme décrit précédemment (étapes 2.3.2 - 2.3.4). Resuspendre le culot d’ADN séché dans 10 µL de tampon d’élution.
8. Préparer le mélange de la sonde
   1. Pour l’ADN marqué, déterminer la concentration du fluorochrome colorant en pmol/µL. La concentration du fluorophore peut varier de 30 à 100 pmol/µL, selon le BAC. La concentration d’ADN peut varier de 300 à 800 ng/µL.
      Remarque : Le paramètre « microarray » fonctionne bien sur un spectrophotomètre microvolume, tel que celui spécifié dans la table des matières. Dans la fenêtre de microarray, sélectionnez ADN-50 et spécifiez le fluorochrome.
   2. Créer un mélange maître en combinant des quantités équimolaires (pmol fluor) de chacune des sondes BAC. Vortex 30 s avant la combinaison. Pour éviter les cycles de gel/dégel, préparer des aliquots de master mix, appliquer couche de paraffine sur les tubes pour éviter l’évaporation et stocker dans l’obscurité à-20 ° C.
      NOTE : Un mastermix contenant 250 pmol de chacun de la BAC individuel 6 sondes dans un volume total de 30 à 50 µL fonctionne bien. Une partie aliquote contenant 25 pmol (fluor) pour chaque BAC sera suffisante pour des réactions de l’hybridation de deux 40 µL, avec une concentration de la sonde de 0,31 pmol fluor/µL pour chaque BAC.

3. dissection et la Fixation des ovocytes

1. Collecter 30 adultes femelles vierges du génotype approprié. Pour enrichir pour les ovocytes étape tardive, tenir les femmes sans les hommes dans une cuvette de nourriture volée et levure sèche pendant 3-5 jours avant le²⁵de la dissection. La veille de la dissection, transférer les femelles sans gaz à un nouveau flacon avec de la levure.
2. Effectuer la dissection.
   Remarque : Voir la Figure 3 pour les outils nécessaires. Des solutions sont supprimées à l’aide d’une pipette Pasteur tirée sauf indication contraire. Lors du transfert des ovaires toujours utiliser un embout de la pipette recouvert d’une solution de BSA de 10 %.
   1. Dans un plat peu profond de dissection contenant un tampon de Robb modifiée, utilisez pince à enlever les ovaires d’une femme seule. Utilisation de forceps ou une aiguille de tungstène à doucement s’écrasent chaque ovaire, permettant la solution contact ovarioles intérieure. Transférer la paire d’ovaires écartés dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant tampon de 1 mL modifiée Robb.
   2. Répétez l’étape 3.2.1 d’accumuler les ovaires des femelles de 20 à 25 dans le tube de microtubes de 1,5 mL. Fini les dissections des femelles 20-25 dans les 10 min.
3. Effectuer la fixation comme suit.
   1. Avec une pipette Pasteur a tiré, éliminer le liquide dans le tube à centrifuger, un P1000 permet de rapidement ajouter 500 µL de solution de 37 ° C aux ovaires et puis immédiatement ajouter 500 µL de température ambiante heptane aux ovaires.
   2. Tube à centrifuger agiter pour mélanger et placer sur une nutator de 3 min. Retirer le tube à centrifuger de la nutator et la placer dans un portoir pendant 1 min permettre les ovocytes se déposer au fond. Le temps de fixation totale est de 4 min.
      Mise en garde : Solution de correction et d’heptane sont toxiques, portez une protection appropriée.
   3. Enlever la solution de correctif et rincer les ovaires 3 fois en 500 µL de PBS contenant 0,5 % de BSA et 0,1 % Triton X-100 (PBSBTx)
4. Répétez pour les génotypes restants.

4. Elimination des Chorions et Membranes Vitelline

Remarque : Voir la Figure 3 pour les outils nécessaires.

1. Ovocytes de stade fin séparé
   1. Ajouter 1 mL PBSBTx dans un plat peu profond de dissection. Utiliser un P200 avec une extrémité enduite de BSA pour transférer des ovaires fixes (à ~ 150 µL) dans le plat peu profond. Pipetter ovaires haut et en bas avec la pointe de pipette revêtus de BSA pour déloger les ovocytes matures des ovocytes moins matures.
   2. Lorsque les ovocytes stade tardif sont suffisamment séparées, transférer tous les tissus à un tube à centrifuger 500 µL. Enlever l’excès de liquide avec une pipette Pasteur extraite, laissant sur 150-200 µL dans le tube. Répéter la section 4.1 pour génotypes restants.
2. Se préparer à rouler
   1. Pré mouillage un puits profond plat avec 200 µL de couverture PBSBTx. et mettre de côté. Obtenir 3 lames de verre dépoli et set diapositive #3 côté. Frottez doucement, ensemble, les régions de verre dépoli de diapositives #1 et #2. Les rincer à l’eau déionisée pour enlever les échardes de verre et essuyer avec une lingette jetable.
   2. Enrober les régions givrées de diapositives #1 et #2 avec PBSBTx en ajoutant 50 µL de PBSBTx à une diapositive et en frottant cette région avec les autres diapositives. Enlever le liquide avec une lingette jetable.
   3. Placez les diapositives sous un microscope à dissection dans la configuration illustrée dans la Figure 4 a. Continuer à soutenir les régions givrées de diapositives #1 et #2 en contact, avec glissière #3 diapositive #2.
3. Rouleau d’ovocytes ; veiller à ce que le sens du laminage est toujours en ligne droite et jamais un mouvement circulaire.
   1. Pipette de prewet un P200 pointe en PBSBTx et disperser les ovocytes dans le tube à centrifuger de pipetage de haut en bas. Transférer 50 µL de liquides contenant les ovocytes au centre de la partie en verre dépoli de diapositive #1. Soulevez la diapositive #2 de le faire.
   2. Abaissez lentement diapositive #2 jusqu'à ce que la tension superficielle du liquide crée un joint entre les deux régions de verre dépoli. Il devrait y avoir suffisamment de liquide pour couvrir la zone givrée mais aucun ne devrait être qui s’infiltre sur. Si le liquide déborde, utiliser une pipette Pasteur tirée pour enlever l’excès de liquide.
   3. Tenir la lame de fond (#1) en place d’une main et utilisez l’autre main pour déplacer la glissière supérieure (#2) en arrière dans la direction horizontale, gardant la diapositive #2 niveau et pris en charge sur diapositive #3. Effectuer sous un microscope pour faciliter la visualisation des mouvements de l’ovocyte et de progrès.
      Remarque : Ce mouvement génère de friction et provoquer les ovocytes à « rouler » et perdre leurs chorions. Pression minimale doit être utilisée et mouvements doivent être court et rapide.
   4. Après quelques mouvements dans le sens horizontal, modifier légèrement l’angle du mouvement (Figure 4 b). En plusieurs tranches, augmenter progressivement cet angle à 90° jusqu'à ce que le mouvement de la glissière supérieure (#2) est perpendiculaire à la direction de départ (Figure 4 b). Notez que chorions vides sera visibles dans le liquide et ovocytes manque chorions apparaîtra plus longs et plus minces.
   5. Répétez les étapes 4.3.3 - 4.3.4 environ 7 - 10 fois jusqu'à ce que la solution devienne légèrement trouble. Arrêter quand la majorité des ovocytes (75-85 %) semble avoir perdu leur membrane vitelline.
      Remarque : Un bout pointu distinctif est souvent visible sur les ovocytes manque des membranes vitelline. Vitelline membranes sont plus difficiles à enlever que chorions. Légère pression peut être appliquée à la glissière supérieure (diapositive #2) tout en roulant pour obtenir le retrait des membranes vitelline. Essayer de supprimer les membranes vitelline de tous les ovocytes se traduit souvent par la destruction d’autres ovocytes.
   6. Soulevez délicatement la glissière supérieure (#2), en faisant glisser un de ses angles vers le centre de la région givré de la lame de fond (#1) afin que les laminés ovocytes s’accumulent dans le centre de la région de sablé. Rincez les ovocytes de deux diapositives avec PBSBTx dans le puits profond plat contenant PBSBTx.
   7. Nettoyez les lames #1 et #2 avec de l’eau ultrapure, sec avec une lingette jetable et re. Répétez les étapes 4.3.1 - 4.3.6 jusqu'à ce que tous les ovocytes de même génotype ont été laminés. Cela nécessite généralement 3-4 tours de roulage par génotype.
4. Enlever les débris après laminage
   1. Ajouter 1 mL PBSBTx dans un tube conique de 15 mL. Agiter le liquide pour enduire les parois du tube.
   2. À l’aide d’un PBSBTx enduit P1000 de pipette, transfert les ovocytes laminés à des profondeurs bien plat pour le tube à fond conique contenant 1 mL de PBSBTx. Ajouter 2 mL supplémentaire de PBSBTx dans le tube conique contenant les ovocytes.
   3. Laissez les ovocytes commencent à déposer au fond, puis enlever la partie supérieure de 2 mL de solution contenant des débris (chorions, vitellines, etc.) avec un P1000 et jeter. Le cas échéant, tenir le tube conique sur un fond sombre pour voir les ovocytes opaques comme ils sombrent.
   4. Ajouter 2 mL de PBSBTx supplémentaire pour les ovocytes et répétez l’étape 4.4.3. 4.4.3 répéter. pour un total de 3 séries d’enlèvement des débris.
   5. À l’aide d’un PBSBTx enduit P1000 de pipette, ovocytes transfert vers le tube à centrifuger original 500 µL. 20 - 25 femelles devraient produire environ 50 µL de laminés ovocytes matures.
5. Répéter la section 4 pour les génotypes restants à l’aide de diapositives givrées fraîches, un nettoyage profond bien plat et un nouveau tube conique pour chaque génotype.
6. Si le stockage est nécessaire, le transfert des ovocytes de PBS 1 x 0,1 % TritionX-100 et magasin pendant la nuit à 4 ° C. Entreposage à long terme n’est pas recommandé car la réticulation de formaldéhyde peut être renversée par les détergents non ioniques.

5. POISSON

NOTE : Tous les lavages sont exécutées sur un nutator à la température ambiante, sauf indication contraire. Les ovocytes qui ont été laminés prennent plus de temps pour déposer au fond du tube microtubes, surtout dans des solutions qui contient de la formamide. Il est important d’être patient lors du changement des solutions afin que les ovocytes ne soient pas perdus dans le processus. Cela peut nécessiter de 5 à 15 min d’attente pour laisser les ovocytes à s’installer après les rinçages et lavages. Notez également que les ovocytes en formamide sont moins opaques.

1. Traitement d’extraction et de la RNAse
   1. Rincer avec 500 µL de PBS contenant 1 % des ovocytes Triton X-100 (PBSTx). Retirer le liquide et ajouter 500 µL tampon d’Extraction (PBSTx contenant la RNAse). Incuber sur nutator à température ambiante pendant 2 h.
2. Hybridations des lavages
   1. Rincez les ovocytes 3 fois avec 500 µL 2 x Saline Citrate de Sodium contenant du Tween 20 (SSCT). Préchauffer une partie aliquote (~ 500 µL/génotype) de 2 x SSCT + 50 % formamide à 37 ° C.
      Attention : formamide est toxique, portez une protection appropriée.
   2. Laver les ovocytes 3 fois pendant 10 min chacun dans 500 µL 2 x SSCT. Lavez les ovocytes pendant 10 min à 500 µL 2 x SSCT + 20 % formamide. Lavez les ovocytes pendant 10 min à 500 µL 2 x SSCT + 40 % formamide. Lavez les ovocytes pendant 10 min à 500 µL 2 x SSCT + 50 % formamide.
   3. Éliminer le liquide et ajouter 500 µL de 37 ° C 2 x SSCT + 50 % formamide de l’étape 5.2.1 pour échantillonner et incuber pendant 2 h à 37 ° C, avec une rotation.
      Remarque : Un four à hybridation équipé d’un agitateur fonctionne bien pour cela. Un tube à centrifuger mousse « flotter » attaché à la coiffe peut servir à fixer les tubes.
3. Dénaturation et hybridation
   1. Pour chaque tube d’ovocytes, utilisez 40 µL de tampon d’hybridation de x 1 contenant 2,5 sonde centromérique ng/µL et 0,31 pmol fluor/µL de chaque sonde de BAC. Préparer une solution de sonde dans un tampon d’hybridation suffisant pour tous les génotypes. Vortex sonde mix 30 s avant d’ajouter.
   2. À l’aide d’une pointe de pipette P200-enduit de BSA, transférez les ovocytes dans un tube de PCR de 200 µL. Conserver les échantillons à 37 ° C et laisser ovocytes settle vers le bas, puis utilisez une pipette Pasteur tirée pour enlever autant de liquide que possible.
   3. Ajouter 40 µL de solution d’hybridation contenant sonde (établie à l’article 2) pour les ovocytes. Placer le tube PCR contenant les ovocytes dans la machine PCR et incuber comme suit : 37 ° C pendant 5 min, 92 ° C pendant 3 min, puis 37 ° C pendant la nuit. Après ajout de sonde pour les ovocytes, les garder dans l’ignorance autant que possible.
4. Lavages de poteau-hybridations
   1. Préchauffer le 2 x SSCT + 50 % formamide à 37 ° C et rangez-le dans l’incubateur de l’hybridation. Avec un BSA enduit P200 pointe de pipette, ajouter 100 µL de 37 ° C 2 x SSCT + 50 % formamide dans le tube PCR avec les ovocytes et transférez les ovocytes dans un tube à centrifuger nouveau 500 µL.
   2. Ajouter une supplémentaire de 400 µL de 37 ° C 2 x SSCT + 50 % formamide au même tube et laissez que les ovocytes s’établir à 37 ° C dans l’incubateur.
      Remarque : Régler souvent prend plus de temps à cette étape. Il n’est pas rare de prendre 15 min ou plus. Un manque de patience se traduira par une perte importante d’ovocytes.
   3. Lavez les ovocytes 3 fois pour chaque 20 min à 500 µL de 37 ° C 2 x SSCT + 50 % formamide à 37 ° C avec rotation. Garder les ovocytes à 37 ° C, alors qu’ils s’installent.
   4. Laver les ovocytes 3 fois pour chaque 10 min à 500 µL de 37 ° C 2 x SSCT + 50 % formamide à 37 ° C avec rotation. Garder les ovocytes à 37 ° C, alors qu’ils s’installent.
   5. À température ambiante, laver les ovocytes pendant 10 min à 500 µL 2 x SSCT + 40 % formamide sur un nutator. Lavez les ovocytes pendant 10 min à 500 µL 2 x SSCT + 20 % formamide. Laver les ovocytes pendant 10 min à 500 µL 2 x SSCT.
5. Tache au DAPI
   ATTENTION : DAPI est toxique, portez une protection appropriée.
   1. Laver les ovocytes pendant 20 min à 500 µL de solution DAPI (1 µg/ml) en 2 x SSCT sur le nutator. Rincez les ovocytes 3 fois en 500 µL 2 x SSCT. Laver les ovocytes 2 fois pour chaque 10 min à 500 µL 2 x SSCT sur le nutator. Échantillons peuvent être conservés pendant plus de 4 h à température ambiante dans l’obscurité jusqu'à ce qu’ils sont prêts à monter sur les lamelles.
6. Montage
   Remarque : Voir la Figure 3 pour les outils nécessaires.
   1. Placez une lamelle revêtue de poly-L-lysine sous le microscope à dissection. Éliminer le liquide du tube d’ovocytes, réglage du volume total d’environ 150 µL. Avec un BSA enduit P200 de pipette, pipette de haut en bas pour disperser des ovocytes dans l’ensemble de la solution et puis transférer 40 µL de la solution d’ovocytes/à une lamelle revêtue de poly-L-lysine.
   2. Partie du liquide retirer la lamelle à l’aide d’une pipette Pasteur a tiré jusqu'à ce que les ovocytes s’en tenir à la lamelle mais sont toujours entourés de liquide. Avec une pince, maintenez enfoncée la lamelle couvre-objet sur un côté et utiliser une aiguille de tungstène pour dissocier doucement les touffes d’ovocytes, en les déplaçant pour réaliser une seule couche d’ovocytes sans chevauchement.
   3. Enlever le reste du liquide dans les ovocytes avec une pipette Pasteur tirée. Prendre une lame de verre propre et utiliser des gaz comprimé pour souffler la poussière. Ajouter 22 µL de fixation médias (p. ex., allongent-or) au milieu de la diapositive. Abaissez lentement la dérive de la lamelle couvre-objet, avec le support de montage face à l’échantillon, jusqu'à ce que les médias touche l’échantillon. Tension superficielle provoque la lamelle d’adhérer à la diapositive.
   4. Placer les lames dans un récipient en plastique avec un couvercle étanche qui contient une couche de dessicant frais (p. ex., drierite). Laissez les diapositives sécher pendant 3 à 5 jours dans l’obscurité avant d’imagerie. Temps de séchage peut varier selon l’humidité de la pièce.

6. l’imagerie

1. Après suppression sèches diapositives dans la zone de dessicant, les nettoyer pour enlever toute particule de poussière. Sceller les lamelles couvre-objet avec vernis à ongles. Scellé de diapositives peuvent être conservés indéfiniment à-20 ° C.
2. Acquérir des images confocales utilisant un objectif à huile forte ouverture numérique 40 X avec zoom numérique 6 X à balayage laser.
   NOTE : Idéalement, système logiciel permettra de trouver et marquer l’emplacement de XY de chromosomes méiotiques pour plusieurs ovocytes tout en visualisant l’utilisation épifluorescence. Cette capacité fait gagner du temps lors d’une session d’imagerie. Rapide de blanchiment avec un objectif de forte ouverture numérique 60 X fait son utilisation impropre avec le système confocal choisi, mais il peut fonctionner pour d’autres systèmes.
3. Capturer une série Z pour chaque ovocyte, mise en haut et en bas de la série à l’aide du signal DAPI.
   Remarque : Le Gain, décalage, et puissance laser devra être déterminée empiriquement à l’aide d’un sous-ensemble des ovocytes. Une fois que les paramètres appropriés sont trouvent, seulement des ajustements mineurs devraient il faut faire.
   Si acquisition de modifié des paramètres sont requis, utilisez la pile d’images recueillies précédemment pour estimer les changements nécessaires. Pour éviter le blanchiment, s’abstenir d’imagerie avant la sonde bras avant la capture de la série Z. Avec une taille d’étape de 0,25 µm, la série Z vont généralement de 25 à 30 étapes en fonction de l’orientation et le placement des chromosomes. Une petite étape peut améliorer sa capacité à déterminer si les deux taches de poissons sont séparés dans la dimension axiale, mais il y a un compromis avec le temps nécessaire pour capturer de plus petites étapes et perte d’intensité du signal en raison de blanchiment. Un objectif de 40 X 6 X zoom numérique et d’un champ de 1 024 x 512 image génère des images avec une taille de pixel de 0,05 µm.

7. image analyse et scoring pour défauts de cohésion

1. Donne la série Z pour optimiser le rapport signal sur bruit pour chaque ovocyte¹⁹.
   Remarque : Un ensemble de logiciels tels que celui spécifié dans la Table des matières permet de donne à l’aide de restauration intégrative, ainsi que des cultures et contraste-améliorer les images. Ce qui est important, un logiciel qui permet de voir les images et le score pour les défauts de cohésion en trois dimensions est impératif.
2. Pour chaque ovocyte, totaliser le nombre de bras et centromériques foyers qui sont colocalisées avec le signal DAPI. Perte de cohésion se traduit par trois ou quatre des signaux distincts et séparés pour une sonde spécifique. Il n’est pas rare d’observer deux foyers qui sont reliés par un fil fin. Par les critères les plus rigoureux, ces foyers n’est pas « séparés ».

Résultats

La figure 5 présente des images obtenues avec une sonde de bras qui s’hybride à région cytologique 6E-7 b sur le chromosome X . Il en résulte un signal qui se localise conjointement avec celle du DAPI, sonde se distingue facilement de l’arrière-plan et a été utilisé avec succès pour quantifier les défauts de cohésion bras de différents génotypes¹⁹. Quantification des défauts de cohésion se limite à prométa...

Discussion

L’utilisation de poissons sondes pour évaluer l’état de la cohésion des bras en prométaphase I et métaphase j’ai Drosophila ovocytes est un progrès considérable dans le domaine de la méiose de drosophile . Historiquement, les chercheurs de la drosophile ont été limités aux tests génétiques pour déduire une perte prématurée de la cohésion de bras dans les ovocytes matures^11,18,19....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits
Midi Prep kit	Qiagen	12143	Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit	Sigma	WGA2	Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit	Invitrogen	A21676	Label BAC clone DNA
PCR purification kit	Qiagen	28104	Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100	Prepare 10% stock Freeze aliquots
Calcium chloride	Fisher Scientific	C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate	Sigma	D-8906
Drierite	Drierite Company	23001
Dithiothreitol (DTT)	Invitrogen	15508-013	Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl)	Boehringer Mannheim	1277049	Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)	Fisher Scientific	S311-500	Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof)	Decon Laboratories	2716
Tris (Ultra Pure)	Invitrogen	15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)	Sigma	E-3889
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	Toxic: wear appropriate protection
Formamide	Invitrogen	AM9342	Toxic: wear appropriate protection
Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Glycogen	Roche	901393
HEPES	Boehringer Mannheim	737-151
Heptane	Fisher Scientific	H350-4	Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid	Millipore	HX0603-4	Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine	Sigma	438227	Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride	Sigma	104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O	Fisher Scientific	S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O	Fisher Scientific	S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml)	Sigma	P8920-100
Potassium acetate	Fisher Scientific	BP364-500
Sodium acetate	Fisher Scientific	S209-500	Prepare 3M stock
Sodium cacodylate	Polysciences, Inc.	1131	Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3	Sodium chloride
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
10% Tween 20	Thermo Scientific	28320	Surfact-Amps
10% Triton X-100	Thermo Scientific	28314	Surfact-Amps
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer			10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate)			3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution			Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer			3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution			Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx			1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx			1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase)			1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT			2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide			Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide			Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide			Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzymes
AluI	New England Biolabs	R0137S
HaeIII	New England Biolabs	R0108S
MseI	New England Biolabs	R0525S
MspI	New England Biolabs	R0106S
RsaI	New England Biolabs	R0167S
BfuCI	New England Biolabs	R0636S
100X BSA	New England Biolabs		Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2	New England Biolabs		Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl	Roche/Sigma	3333566001
TdT buffer	Roche/Sigma		Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride	Roche/Sigma		Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL)	Thermo-Scientific	EN0531
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytology Tools etc.
Forceps	Dumont		#5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20C	Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish			Custom made
Deep well dish (3 wells)	Pyrex	7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides	Fisher Scientific	22-038-104	Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm	VWR Scientific	48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick	Thermo-Scientific	3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5	Thermo-Scientific	3405
Tungsten needle			homemade
Prolong GOLD mounting media	Molecular Probes	P36930
Compressed-air in can	Various
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PCR machine	Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer	Thermo-Scientific		microvolume spectrophotometer
Vortexer	Various
Table top microfuge at room temperature	Various
Table top microfuge at 4 °C	Various
Heat block	Various
Hybridization oven or incubator with rotator	Various
Nutator	Various
A1RSi laser scanning confoal	Nikon		40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes	Various
15 mL conical tubes	Various
1.5 mL microfuge tubes	Various
500 µl microfuge tubes	Various
200 µl PCR tubes	Various
Plastic container with tight fitting lid	Various		To hold Drierite
Kimwipes	Various		disposable wipes
Parafilm	Various		paraffin film
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software	PerkinElmer		Version 6.3