Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

Résumé

La peau agit comme une première ligne de défense contre l’environnement externe. Nous présentons une méthode pour isoler des kératinocytes humains primaires de peau adulte. Ces kératinocytes isolés sont utiles dans nombreuses configurations expérimentales et sont un modèle très approprié pour l’étude des mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Résumé

La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, tout en conservant une barrière mécanique au monde extérieur. En outre, les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans l’initiation, d’entretien et règlement de la réponse immunitaire épidermique en faisant partie du système immunitaire inné répondant aux stimulations antigéniques d’une manière rapide, non spécifique. Nous décrivons ici un protocole pour l’isolement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et de démontrer que ces cellules répondent à la différenciation terminale induits par le calcium, telle que mesurée par une augmentation de l’expression de l’involucrin de marqueur de différenciation. En outre, nous montrons que les kératinocytes isolés sont sensibles aux induite par l’IL-1β activation des voies de signalisation intracellulaires, telle que mesurée par l’activation de la voie de p38 MAPK. Ensemble, nous décrivons une méthode d’isolement et de mise en culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte. Parce que les kératinocytes sont le type cellulaire prédominant dans l’épiderme, cette méthode est utile pour étudier les mécanismes moléculaires de la biologie cutanée in vitro.

Introduction

La peau est le plus grand organe du corps humain et agit comme une barrière protectrice contre l’environnement externe. La peau est composée de deux couches principales : le derme et l’épiderme, où l’épiderme constitue la couche la plus superficielle de la peau. Le type de cellule plus abondant dans l’épiderme est les kératinocytes comprenant plus de 95 % de la masse^1,de cellule². Les kératinocytes sont maintenues à différents stades de différenciation dans l’épiderme et sont organisés en couches basales, épineux, granulaires et cornéocytaire qui correspondent à des étapes spécifiques de différenciation³. La fonction principale des kératinocytes est d’assurer l’intégrité structurale de l’épiderme, produisant ainsi une barrière intacte au monde extérieur.

Les kératinocytes représentent également la première ligne de défense contre les agents pathogènes de la peau et jouent donc un rôle important dans la réponse immunitaire innée^4,5. Exposition des kératinocytes aux stimuli externes conduit à l’activation des voies de signalisation intracellulaires et par la suite, la production d’un certain nombre de différents médiateurs inflammatoires, y compris les cytokines, chimiokines et peptides antimicrobiens. Ces protéines dérivées des kératinocytes participent dans la réponse inflammatoire en recrutant et en activant des cellules immunitaires comme les cellules dendritiques, les neutrophiles et spécifiques T cellules^6,7. Ainsi, parce que les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, la justification de la technique présentée ici était de générer un modèle in vitro pour étudier la biologie de la peau. Cultures de kératinocytes primaire provenant du prépuce néonatal sont souvent utilisés pour étudier la biologie de la peau^8,9. Cependant, avec la technique décrite ici, les kératinocytes des deux sexes sont obtenus résultant en une plus grande diversité biologique des cellules.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et la génération des kératinocytes humains primaires de peau adulte, y compris l’entretien et la congélation des kératinocytes. L’objectif général de cette méthode est de générer des kératinocytes humains primaires pouvant servir comme modèle pour étudier la biologie cutanée in vitro.

Protocole

Le prélèvement d’échantillons de peau sur des volontaires adultes sains qui subissent une chirurgie plastique doit être approuvée par le Comité éthique dans les établissements d’accueil. Ce protocole a été approuvé par la régionale Comité éthique de région Midtjylland, à Danemark (M-20110027). La méthode décrite ici provient d’études similaires par Maciaq et al. ¹⁰ et Liu et Karasek¹¹.

1. isolement des kératinocytes de la peau humaine

1. Commencez par faire les solutions suivantes : 50 mL de solution de glucose de la trypsine et 0,1 % 0,25 % au SPD. Filtre Mix et stérilisent (0,2 µm) la solution. Préparer 10 mL de milieu RPMI 1640 + 2 %, solution FBS, 50 mL de SPD et kératinocytes de milieu sans sérum (KSFM). Ajouter des suppléments de KSFM et 250 µL de gentamycine à 500 mL de KSFM. Réchauffez les solutions à 37 ° C avant utilisation.
2. Recueillir la peau des volontaires adultes sains qui subissent une chirurgie plastique. Les échantillons de peau utilisés sont environ 10 cm x 15 cm, mais peuvent varier en taille. Garder la fraîcheur de la peau au titre des transports en transportant des échantillons de peau dans une boîte de Styrofoam contenant un élément de refroidissement. Si nécessaire, l’échantillon de peau peut être stocké à 4 ° C durant la nuit.
3. Enlever le gras du dessous de la section de la peau à l’aide de pinces, scalpels et ciseaux stérilisés.
4. Boucle de la section de la peau (environ 10 cm x 15 cm) sur une couverture stérile sur le dessus une plaque à l’aide d’aiguilles. Tout d’abord, nettoyer la peau avec une compresse stérile sèche. Puis nettoyer la peau en utilisant un tampon de gaze stérilisé avec l’éthanol à 70 %.
5. À l’aide d’un rabot de pied, couper du calque du dessus (épiderme) de la section de la peau et le mettre dans une boîte de Pétri de 9 cm. Puis, immédiatement ajouter 25 mL de la solution de trypsine/SPD/glucose (préparée à l’étape 1.1) de la boîte de Pétri. Incuber 30 min à 37 ° C.
6. À l’aide d’une pipette enlever la solution de trypsine/SPD/glucose de la boîte de Pétri et ajouter 10 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS pour inactiver la trypsine.
7. À l’aide de deux pinces, maintenant libérer les cellules épidermiques dans le milieu par doucement raclage et agitation de l’épiderme et le compartiment par voie cutanée des sections peau.
8. La suspension de cellules épidermiques filtrer sur un filtre métallique (taille de trou de 1 mm) et de recueillir dans un tube de 50 mL. Ajouter les sections restantes de la peau dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu RPMI-1640 sans FBS et vortex pour filtre s. 10 la suspension à travers le métal du filtre dans un tube de 50 mL contenant la suspension de cellules épidermiques. Ajouter SPD à un volume total de 50 mL.
9. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 10 min à 450 g à la température ambiante.
10. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot de cellules épidermiques dans environ 10 mL de 37 ° C KSFM selon la taille du culot cellulaire. Compter les cellules en utilisant le bleu de Trypan méthode sous microscope. Le nombre de cellules obtenues à partir d’une section de peau de 10 cm x 15 cm est d’environ 50-100 x 10⁶ cellules. À chaque flacon de culture de² 75 cm, 8 x 10⁶ cellules avec 12 mL de 37 ° C KSFM de transfert. Secouer doucement les flacons de culture pour assurer une distribution uniforme des cellules.
11. Incuber les kératinocytes dans un incubateur à 37 ° C avec 100 % d’humidité et 5 % de CO₂. Changer le support après 2 jours et trois fois par semaine. Cellules de passage lorsque la culture est anastomosé 70 à 80 %, ce qui prend environ 2 semaines, selon le taux de prolifération des kératinocytes.

2. passage des kératinocytes

1. Faire chauffer la quantité appropriée de la solution de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 ° C dans un incubateur. Utilisez 4,5 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour un flacon de culture de² 75 cm.
2. Éliminer le milieu des cellules et ajouter le flacon de culture 4,5 mL/75 cm² préchauffée solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour les cellules. Placer le flacon de culture dans un incubateur à (37 ° C) et après environ 5 min, vérifier au microscope si les cellules ont commencé à desserrer.
3. Quand environ 50 % des cellules sont desserrées, doucement frapper le ballon de la culture contre la main pour desserrer les cellules restantes. Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajouter 6 mL de RPMI 1640 + 2 % SVF (37 ° C) dans le flacon de culture de² 75 cm et transférer la suspension cellulaire aux tubes de 50 mL.
4. Rincer les flacons de culture avec 3 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS et ajouter aux tubes de 50 mL. Centrifuger les cellules pendant 10 min à 450 g à la température ambiante.
   1. Remettre en suspension les cellules granulés dans 10 mL de KSFM (37 ° C). Compter les cellules non vides et 3 x 10⁶ cellules de transfert à un flacon de culture de² 150 cm avec 20 mL de KSFM (37 ° C). Agiter doucement le flacon de culture pour assurer une distribution uniforme des cellules. Geler les cellules alors que la culture est anastomosé 80 à 90 %, ce qui prend environ 4 à 6 jours selon le taux de prolifération des kératinocytes (voir la Section 3, gel protocole ci-dessous). Développez les kératinocytes pour générer des stocks congelés appropriés.

3. gel des kératinocytes

1. Faire chauffer la quantité appropriée de la solution de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 ° C dans un incubateur. Utilisation 9 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour un flacon de culture de² 150 cm.
2. Éliminer le milieu des cellules et ajouter le flacon de culture 9 mL/150 cm² préchauffée solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour les cellules. Placer le flacon de culture dans un incubateur à (37 ° C) et après environ 5 min, vérifier au microscope si les cellules ont commencé à desserrer.
3. Quand environ 50 % des cellules sont desserrées, frapper doucement le flacon de culture contre la main afin de détacher les cellules restantes. Ensuite, pour inactiver la trypsine, ajouter 12 mL du milieu RPMI 1640 + 2 % SVF (37 ° C) dans le flacon de culture de² 150 cm et aspirer la suspension cellulaire aux tubes de 50 mL.
4. Rincer les flacons de culture avec 6 mL de milieu RPMI 1640 + 2 % FBS et ajouter aux tubes de 50 mL. Centrifuger les tubes pendant 10 min à 450 x g à 4 ° C. Préparer la cellule glacée congélation moyen (KSFM + 10 % DMSO).
5. Resuspendre le culot dans KSFM + 10 % DMSO, compter les cellules non vides et geler les cellules à une densité de 6 x 10⁶ cellules/mL à l’aide de standard-congélation lente cryoconservation méthodes¹².
6. Stocker les kératinocytes dans l’azote liquide (phase vapeur) jusqu'à utilisation.

4. le dégel et la culture de kératinocytes congelés

1. Rapidement décongeler les flacons congelés appropriés dans un bain-marie à 37 ° C. Utiliser l’éthanol à 70 % pour nettoyer l’extérieur de la cryovial. Transférer le nombre adéquat de cellules (environ 15 000 cellules/cm²) dans une fiole de culture et ajouter immédiatement milieu de croissance pré chauffé (KSFM) dans le flacon de culture.
   N’importe quelle taille de flacons de culture peut être utilisé selon le paramétrage de l’expérience.
2. Utiliser 5 mL de milieu de culture pour un flacon de culture de 25 cm² .

Le nombre de cellules a ajouté que le flacon de culture peut-être varier étant donné que la croissance des cellules varie de bailleurs de fonds aux donateurs. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 100 % d’humidité et 5 % de CO₂.

Changement du milieu après 2 jours et trois fois par semaine à l’aide de frais préchauffé KSFM.
Remarque : Nos données ont démontré que, en moyenne, 95 % des cellules isolées par le protocole décrit ici sont positifs pour les kératinocytes-marqueur cytokeratine-14¹³.

Résultats

Différenciation terminale induits par le calcium
Kératinocytes humains subissent une différenciation terminale par traitement avec du calcium^14,15,16. Des kératinocytes humains primaires ont été isolées et cultivées comme décrit dans le protocole ci-dessus. Quand environ 50-60 % anastomosé, les cellules sont stimulées avec calcium (1,2 mM) ou véhicule et photos des cellules ont été prises le jou...

Discussion

Ici, nous décrivons comment isoler facilement des kératinocytes humains primaires de peau adulte et à leur culture in vitro. Ce modèle peut avoir une large demande d’enquête de la biologie cellulaire épidermique et peut être utile pour les chercheurs intéressés à étudier les maladies cutanees.

Certains des avantages du protocole décrit ici est que, contrairement aux kératinocytes isolées du prépuce néonatal obtenu à partir des mâles nouveau-nés subissant la circon...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
KSFM	ThermoFisher Scientific	17005-034	Cell culture medium
KSFM supplements	ThermoFisher Scientific	37000-015	Supplements for KSFM
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190-144	DPBS without Calcium and Magnesium
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Dimethyl sulfoxid
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15710-049	Cell culture medium additive
Sterilization filter	Sartorius	16534	Syringe filter with a pore size of 0.2 µm
Trypsin	Sigma-Aldrich	T7409	Used to trypsinize cells
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	-
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	61870-010	-
FBS	ThermoFisher Scientific	16000044	Used to inactivate trypsin
Forceps	-	-	Forceps from any company can be used
Scissors	-	-	Scissors from any company can be used
Scalpel	Swann Morton	0501	Scalpels from any company can be used
70% ethanol	-	-	-
Gauze pads	NOBAMED	875420	Gauze pads from any provider can be used
Foot planer	Credo Solingen	1510	Foot planer from any provider can be used
Petri dishes	TPP	93100	Petri dishes from any provider can be used
Metal filter	-	-	In-house 1 mm hole size metal filter
75 cm2 culture flasks	NUNC	156499	-
150 cm2 culture flasks	TTP	90151	-
0.05% Trypsin-EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300-062	Used to trypsinize cells when passaging