Identification des OTX1 et OTX2 comme deux marqueurs moléculaires possibles pour les carcinomes Sinonasal et neuroblastomes olfactifs

Résumé

Homeobox gènes sont des gènes régulateurs, souvent associés à des tumeurs chez les organismes adultes. Nous avons étudié leur expression comparative par immunohistochimie et analyse PCR en temps réel, dans la muqueuse nasale normale et inflammatoires et sinonasal néoplasmes afin de les utiliser comme cibles possibles de diagnostiques et thérapeutiques.

Résumé

OTX boîte homéotique (HB) gènes sont exprimés au cours de la morphogenèse embryonnaire et au cours du développement de l’épithélium olfactif chez les organismes adultes. Les mutations qui se produisent dans ces gènes sont souvent associées à tumorigenèse chez l’homme. Aucune donnée n’est actuellement disponible au sujet de la corrélation possible entre gènes OTX et tumeurs des fosses nasales. Le but de ce travail est de comprendre si les OTX1 et OTX2 peuvent être considérés comme des marqueurs moléculaires dans le développement de tumeurs nasales. Nous avons sélectionné des adénocarcinomes voies nasales et des sinus pour étudier l’expression des gènes OTX1 et OTX2 immunohistochimiques et analyses PCR en temps réel. Les deux OTX1 et OTX2 étaient absents dans tous les échantillons de sinonasal Intestinal Type adénocarcinomes (ITACs). OTX1 mRNA fut identifié seulement en Non-Intestinal Type adénocarcinomes (NITACs), alors que OTX2 ARNm a été exprimé que dans les neuroblastomes olfactif (ONs). Nous avons démontré que l’expression différentielle des gènes pour les OTX1 OTX2 gènes et pourrait être un marqueur moléculaire utile pour distinguer les différents types de tumeurs du sinus.

Introduction

OTX Les gènes de HB sont le vertébrés homologue des gènes orthodenticle Drosophila (otd) et qu’ils codent pour des facteurs de transcription qui sont normalement exprimées au cours de la morphogenèse embryonnaire, mais elles peuvent également être exprimées dans l’organisme adulte avec différentes fonctions . Au cours du développement embryonnaire, ils contrôlent la spécification de l’identité cellulaire, différenciation cellulaire et le positionnement de l’axis¹ du corps. La famille OTX comporte des gènes OTX1 et OTX2 , qui affichent les différentes fonctions. OTX1 est impliqué dans le cerveau et le développement des organes sensoriels. Dans l’organisme adulte, elle s’exprime dans les organes sensoriels et est transcrit en faibles quantités dans le lobe antérieur de l’hypophyse²; Il joue également un rôle dans l’hématopoïèse, étant exprimé en hématopoïétiques pluripotentes et de cellules progénitrices³. OTX2 est impliqué dans le développement de la tête rostral et ses actes de protéine traduite comme une autocatalytiques car il génère un dégradé par l’intermédiaire de quels autres gènes sont activés ou réprimées de manière spatio-temporelle, contribuant ainsi à la cellule prolifération et la différenciation. Dans l’organisme adulte, OTX2 se trouve exclusivement dans le plexus et la glande pinéale choroïde⁴.

Mutations dans les gènes OTX sont souvent liées à l’apparence humaine défauts congénitaux, somatique ou métabolique. Gain ou perte de mutations dans les gènes OTX pourraient favoriser la tumorigenèse si elles ne sont pas en mesure de contrôler correctement la croissance et/ou la différenciation cellulaire⁵. Dans les leucémies et les lymphomes ainsi que dans nombreuses tumeurs solides (p. ex., médulloblastomes⁶, les lymphomes non hodgkiniens agressifs², de carcinomes mammaires⁷, cancers colorectaux⁸et rétinoblastome⁹), le déréglementés d’expression des gènes de HB OTX est bien documenté¹⁰. En outre, des mutations OTX2 ont été démontrées dans les cas d’anophtalmie et microphtalmia¹¹ compte tenu du rôle crucial de ce gène dans le contrôle du développement de le œil.

Dans le cadre des tumeurs solides, la découverte de marqueurs phénotypiques et moléculaires est un défi important pour le diagnostic, la classification et le traitement de plusieurs types de tumeur¹¹, y compris ceux qui sont originaires de la cavité nasale et des sinus de la face sinus. En fait, malgré que ces zones occupent seulement un modeste espace anatomique, épithélium muqueux, glandes, les tissus mous, OS, cartilage ou neural/neuroectodermique et hematolymphoid cellules peuvent être souvent le site pour l’origine du complexe et sur le plan histologique différent groupes de tumeurs. Différents types de tumeurs impliquant le tractus sinonasal présentent une variété de caractéristiques que surmonter ce qu’on voit habituellement dans les voies aérodigestives supérieures ou même tout au long de la plupart des régions du corps¹². Sinonasal malignes sont rares et présentent une incidence annuelle de 1/100 000 habitants dans le monde entier, et ainsi vous éviterez des études concernant les voies impliquées dans la tumorigenèse et l’essai des stratégies de traitement alternatif. Malgré cela, les progrès techniques, d’imagerie approches chirurgicales et radiothérapie ont amélioré la prise en charge clinique du cancer des sinus. En outre, le développement de lignées cellulaires comme des modèles animaux et profilage génétique du cancer constituent actuellement la base pour les futures thérapies anticancéreuses ciblées¹³. A ce jour, il n’y a aucune déclaration au sujet de l’expression OTX1 et/ou OTX2 dans les tumeurs de la cavité nasale et des sinus du rhinopharynx. Puisque nous avons déjà fait observer que OTX1 et OTX2 sont impliqués dans le cancer du sein cancer⁷, nous nous sommes demandés si ces gènes pourraient être présents non seulement dans la muqueuse nasale normale, mais aussi dans les tumeurs de la cavité nasale. Pour atteindre cet objectif, que nous avons obtenu du département de pathologie de la « Ospedale di Circolo » dans des échantillons de Varese de muqueuse normale et voies nasales et des sinus adénocarcinomes prélevés entre 1985 et 2012 et classés selon l’organisation mondiale de la santé (OMS) classification de la tête et cou tumeurs. Nous choisissons de les analyser grâce à des analyses en temps réel de PCR et l’immunohistochimie et nous avons évalué l’expression OTX1 et OTX2 afin de déterminer si elles peuvent être considérées des marqueurs moléculaires pour ces types de tumeurs.

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Protocole

Toutes les études ont été effectués conformément à la déclaration d’Helsinki (1975) avec consentement éclairé écrit et approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Insubria à Varèse.

1. collecte des échantillons

1. Collecter et répartir tous les échantillons humains Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFIP) en différents sous-groupes selon la classification de l’OMS de tête et cou tumeurs¹⁴.
   Remarque : Ici, nous avons utilisé les exemples suivants : muqueuse normale sinonasal comme contrôle (10 échantillons) ; Papillome inversé (IP, code ICD-O 8121/1) ; Sinonasal ITAC (CIM-O code 8144/3, 32 échantillons) ; NITAC (CIM-O code 8140/3, 12 échantillons) ; Carcinome adénoïde kystique (ACC, code ICD-O 8200/3) ; Adénome Pléomorphe (PA, code ICD-O 8941/3) ; SUR (CIM-O code 9522/3, 13 échantillons) ; Mal différenciées de carcinome Neuroendocrine (PDNEC, code ICD-O 8041/3, 19 échantillons) ; Tumeurs neuro-endocrines (NET, CIM-O code 8041/3).

2. immunochimie

1. Déparaffinage et réhydratation des sections
   1. Faites chauffer les diapositives échantillon dans un four à 60 ° C pendant 30 min et réhydrater 3 µm FFIP coupes épaisses à l’aide d’une série d’alcool à l’eau.
   2. Brièvement, laver les lames dans le xylène pendant 10 min et répétez cette étape ; laver les lames pendant 5 min en alcool à 100 % et répétez cette étape avec de l’alcool 95 %, 75 % et 85 % en série. Rincer les lames pendant 5 min dans l’eau distillée.
2. Bloquant l’activité endogène
   1. Bloquer l’activité endogène en plaçant les diapositives dans aqueux peroxyde d’hydrogène 3 % pendant 12 min.
3. Recherche d’antigène
   1. Effectuer recherche d’antigène en traitant avec 10 mM tampon Citrate (pH 6) pendant 10 min dans un traitement de micro-ondes.
4. Incubation avec l’anticorps primaire
   1. Laver les coupes dans le tampon TBS (pH 7,4), puis ajoutez la solution de saturation pendant 10 min.
   2. Laver les coupes dans le tampon TBS (pH 7,4), puis ajouter 0,2 % Triton X.
   3. Incuber une nuit à 4 ° C avec chèvre anti-humain OTX2 anticorps dilué au 1/100.
5. Incubation avec l’anticorps secondaire
   1. Incuber les sections pendant 1 h à température ambiante avec biotinylé lapin anti-chèvre anticorps secondaire dilué 1 : 200 suivie d’ABC-peroxydase complexe (voir Tableaux des matériaux).
6. Développer l’immunoreaction
   1. Développer l’immunoreaction à l’aide de 3, 3'-diaminobenzidine tétrahydrochlorure et contre-coloration les noyaux avec Harris hématoxyline.
7. Montage et imagerie
   1. Déshydrater les sections à l’aide d’alcool à l’échelle du croissant-rouge et expliciter à l’aide d’une substance de compensation d’origine terpéniques (voir Table des matières). Incorporer des sections dans le milieu de montage, placez les sections sur une lame de microscope et observer les sections à travers un microscope optique.

3. RNA Extraction et transcription inverse

1. Extraction de l’ARN
   1. Extrait les sections RNA en effectuant la première étape du protocole d’immunoprécipitation (voir la section 2.1) et garder la glisse dans l’eau distillée. Se superposer les coupes non colorées à l’hématoxyline-éosine correspondant coupes coloré afin d’identifier les fragments d’intérêt.
   2. Effectuer l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN commercial pour échantillons FFPE (voir la Table des matières) et les instructions du fabricant suivant.
2. Inverse-transcription de l’ARN
   1. Utilisez une trousse commerciale pour rétro-RNA à transcrire en ADNc (voir Table des matières) selon le protocole. Rétro-transcrire au moins 1 000 ng d’ARN total pour effectuer plusieurs analyses.

4. Real-Time PCR et l’analyse des données

1. PCR en temps réel
   1. Effectuer des analyses PCR en temps réel quantitatives (qRT-PCR) grâce à la technologie basée sur l’analyse (voir Table des matières) et un thermocycleur.
2. Préparation du mélange de la réaction de PCR
   1. Préparer le mélange de réaction PCR à l’aide de 12,5 µL du mélange maître basée sur sonde, 1,25 ml de chaque OTX1, OTX2 et ACTB sondes (voir Table des matières), 50 ng d’ADNc et exempte de nucléase jusqu'à 25 µL du volume total d’eau.
   2. Effectuer toutes les réactions en trois exemplaires en utilisant le gène ACTB comme le contrôle endogène de normaliser les niveaux d’expression de gène.
   3. Centrifuger la plaque à 1 109 x g pendant 3 min et stocker la plaque à l’abri de la lumière à 4 ° C jusqu'à ce que l’expérience.
3. Définissant le thermocycleur
   1. Ensemble le profil de thermocycleur avec un premier démarrage à chaud du cycle à 50 ° C pendant 2 min et 95 ° C pendant 10 min, suivi de 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s et un dernier cycle à 60 ° C pendant 1 min.
4. Analyses de niveau expression génique
   1. Normaliser les niveaux d’expression de gène via la méthode du seuil (ΔCt) cycle comparative utilisant le gène ACTB comme le contrôle endogène.
   2. Évaluer les niveaux d’expression de gène à l’aide de la méthode 2^-ΔCt et reporter les résultats.
5. Analyses statistiques
   1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de Student t-Test, compte tenu des résultats statistiquement significatifs avec p < 0,05.

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Résultats

Dans la muqueuse normale, nous avons observé une réactivité nucléaire forte et homogène des gènes OTX dans l’épithélium de type respiratoire cilié pseudostratifié et dans les cellules glandulaires sous-muqueux (Figure 1 a). Nous avons trouvé expression nucléaire pour OTX1 dans tous les échantillons de NITACs (Figure 1 b), alors que peu ou absence d’immunoréactivité a été soulignée dans ITACs (

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Discussion

Cette étude montre pour la première fois que, selon les niveaux d’ARNm, les gènes de HB OTX1 et OTX2 sont exprimés dans la muqueuse normale sinonasal et glandes sous-muqueuses, polypes inflammatoires, papillomes sinusienne sinonasal et dans les différents épithéliales et neuroectodermique tumeurs, y compris des carcinomes squameux, type non-intestinal sinonasal adénocarcinomes, tumeurs des glandes salivaires-type, tumeurs neuro-endocrines et ONs.

Modifications et dépannage :

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799