Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Résumé

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Résumé

Caractérisation de l’ordonné en clusters, régulièrement espacées, courtes, palindrome répéter (CRISPR) système de Streptococcus pyogenes a permis le développement d’une plate-forme personnalisable pour générer rapidement des modifications du gène dans une grande variété de organismes, y compris le poisson-zèbre. Axée sur les CRISPR génome édition utilise un seul guide RNA (sgRNA) afin de cibler une endonucléase associée à CRISPR (Cas) à une cible d’ADN (génomique) génomique d’intérêt, où l’endonucléase de Cas génère un saut double-brin (DSB). Réparation des CDB de plomb mécanismes sujette aux insertions ou suppressions (indels). Cela peut provoquer des mutations de déphasage qui présentent souvent un codon d’arrêt prématuré au sein de la séquence codante, créant ainsi un allèle de protéine null. Ingénierie de base CRISPR génome nécessite seulement quelques composants moléculaires et est facilement introduit dans des embryons de poisson-zèbre par microinjection. Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour générer des réactifs CRISPR pour le poisson-zèbre microinjection et d’identifier les poissons présentant des cellules germinales transmission des gènes modifiés CRISPR. Ces méthodes incluent la transcription in vitro de sgRNAs, microinjection de réactifs CRISPR, identification des indels induit sur le site de cible en utilisant une méthode basée sur le PCR appelée une analyse de mobilité hétéroduplex (HMA) et la caractérisation de l’indels en utilisant un débit faible et un séquençage puissant de prochaine génération (NGS)-basé d’approche qui permet d’analyser plusieurs produits PCR provenant de poissons hétérozygotes. Ce protocole est simplifié afin de minimiser le nombre de poissons nécessaires tant les types d’équipement nécessaire pour effectuer les analyses. En outre, ce protocole est conçu pour être prête pour utilisation en laboratoire personnel de tous niveaux d’expérience, y compris les étudiants de premier cycle, permettant à ce puissant outil devant être économiquement utilisés par les groupes de recherche intéressés dans l’exercice de base CRISPR modifications génomiques chez le poisson zèbre.

Introduction

La conservation des machines moléculaires dans les eukaryotes sous-tend le pouvoir d’utiliser des organismes modèles pour la recherche. Bon nombre de ces systèmes modèles facilitent l’utilisation d’une approche génétique inverse comme débouchures de gène ciblé pour caractériser la contribution du produit d’un gène à un processus biologique ou d’une maladie d’intérêt. Techniques de perturbation de gène dans les organismes comme le poisson-zèbre ont historiquement invoqué ciblée introduction de mutations de déphasage qui résultent de réparation imprécise de la CDB^1,2. Lorsqu’un ORD est introduit dans le génome, la lésion de l’ADN est réparée par l’une des deux voies qui sont universellement présents dans presque tous les types de cellules et organismes : fin non homologue rejoindre (NHEJ) et axés sur l’homologie réparation (HDR)^3,4 . Le caractère imprécis de la machinerie NHEJ produit fréquemment indels diverses longueurs^5,6,7,8,9. Introduction de mutations de déphasage dans la séquence codante d’un gène peut produire un codon stop prématuré, qui rend souvent le gène ne fonctionne pas.

Stratégies de génie précoce du génome chez le poisson zèbre pour promouvoir les indels incluent méganucléases, nucléases de doigts de zinc et nucléases d’effecteur comme activateur de transcription, qui utilisé interactions ADN-protéines pour cibler une nucléase à un particulier en génomique cible, où il introduit un ORD^{10,11,12,13,14,15}. Cependant, ces technologies sont souvent difficiles à appliquer en raison de l’ingénierie laborieuse et complexe, nécessaire pour générer une nucléase qui cible la séquence d’ADN d’intérêt. Contrairement aux stratégies antérieures, modification génique à base CRISPR ne repose pas sur des interactions protéine-ADN pour le ciblage. Au lieu de cela, l’endonucléase associée à CRISPR (Cas) est dirigée par un guide de RNA qui utilise des nucléotides à base de couplage des interactions de cibler un site génomique d’intérêt^{16,17,18,19 ,20,21}. En raison de la simplicité de la conception d’un ARN guide avec la base désirée interactions pour cibler l’appariement est relativement facile de cibler l’endonucléase de Cas au locus désiré. Le type II CRISPR système en particulier largement développé pour les applications d’édition en raison de plusieurs caractéristiques avantageuses, y compris l’utilisation d’une nucléase de Cas multidomaine unique (Cas9) nécessitant une interaction avec l’ADN pour stimuler l’activité endonucléasique génome et l’utilisation d’un seul guide ARN (sgRNA) à cibler à l’apparenté de séquence ADN¹⁸. Les exigences de la séquence nécessaires pour le ciblage de la sgRNA apparenté sont bien compris¹⁹, et le sgRNA désiré est facilement générée par in vitro de transcription. La simplicité et la robustesse de l’approche CRISPR/Cas9 facilite grandement la modification génétique ciblée dans le poisson-zèbre et une grande variété d’autres organismes.

La capacité accrue à entreprendre génome ciblé d’édition chez le poisson zèbre grâce à l’élaboration des réactifs à base de CRISPR a significativement augmenté la possibilité d’étudier les processus emblématiques d’organismes vertébrés tels que le développement du nerveux central système. Le poisson-zèbre génome contient orthologues de 70 % des gènes codant pour des protéines trouvées dans le génome humain ainsi que 84 % des gènes liés aux maladies chez les humains,²². Développement du poisson zèbre présente plusieurs qualités principales d’améliorer son utilisation dans les études de génétique inverses : les embryons sont déposés dans les grandes griffes, développer à l’extérieur de la mère, rendant la manipulation se prête à la génétique par microinjection et poisson-zèbre adulte maturité sexuelle à 3 mois, permettant une rapide propagation de lignes souhaitées,²³.

Il existe plusieurs protocoles qui décrivent diverses approches pour générer et identifier les indels CRISPR dérivé dans le poisson-zèbre^{24,25,26,27,28,29 ,30,31}. Cependant, beaucoup de ces procédures sont temps intensif, doivent avoir accès à des équipements coûteux et peuvent être difficile pour les laboratoires ayant une expertise limitée. Les étapes décrites dans la présente fournissent une simple, robuste et économique CRISPR Cas9-stratégie/ingénieur zebrafish knockout lignes. Ce protocole décrit l’utilisation d’un kit très efficace pour synthétiser sgRNAs utilisant des oligonucléotides d’ADN (oligos), semblable aux autres approches qui ont été précédemment décrit³². Le protocole décrit comprend deux étapes en particulier qui simplifient grandement l’analyse de lignées CRISPR muté : utilisation étape par étape du HMA basées sur la PCR³³ pour déterminer facilement la présence de modifications du génome et analyse de la séquence de poisson-zèbre hétérozygote pour rapidement et facilement déterminer la nature des indels multiples de façon économique. En outre, des instructions sont incluses pour sélection robuste, production fiable et l’injection du guide RNAs. La procédure décrite ici illustre un protocole robuste et relativement peu coûteux qui permet au personnel de laboratoire avec un éventail de compétences contribuer à l’identification des débouchures de gènes chez le poisson zèbre.

Protocole

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité de l’urbanisme (nombre PACUC 31/08/11) et de Purdue animalier.

1. conception des Oligos spécifiques d’un modèle pour la Production du Guide RNA

1. Sélectionnez la région cible d’intérêt à être à jour dans la région codante du gène. Cela devrait être proche de l’extrémité 5' du gène de produire une protéine tronquée, mais pas si proche tel qu’un codon ultérieures dans le cadre début permet la production d’une protéine avec une modeste troncature N-terminale.
   NOTE : Exclut cette possibilité consiste à analyser la région codante en aval du gène pour une trame en start codon. En outre, à l’aide d’un guide RNA qui cible au milieu d’un grand exon, peut aider à identifier des amorces PCR pour la notation ultérieure de l’indel qui en résulte.
2. Identifier des sites potentiels de guide dans la région génomique d’intérêt à l’aide d’un guide de sélection de RNA program (voir Table des matières)^34,35,36. Définissez les données de navigateur sur Danio rerio et la séquence protospacer de motif adjacent (PAM) à 5'-NGG-3 '.
   NOTE : Idéal gRNA séquences contiennent une 5′-G en première position de la gRNA pour T7 efficace in vitro la transcription. Si aucun guide acceptable n’est trouvé avec un G à la position de 5′, la base de 5′ de guide un autre peut être modifiée à un G ou un G peut être ajouté sur l’extrémité 5′ du guide RNA, mais ce qui pourrait réduire l’efficacité de coupe³⁷. Afin de maximiser l’efficacité de coupe, une séquence optimale guide a contenu en GC 40-80 % (plus haut vaut mieux) et contient un G à la 20^ème position, adjacent à la PAM, mais n’est pas nécessaire de³⁸. Un exemple d’une séquence de ciblage idéal : 5′ - G (N)₁₈ G-3′ - NGG (NGG est la PAM). En plus d’examiner les résultats du programme de sélection guide RNA pour identifier optimale guide ARN comme décrit ci-dessus, il faut éviter guide ARN avec des effets hors cible forts prévus qui complique grandement l’analyse en aval. En particulier, guide ARN avec des effets hors cible prévus qu’automne dans les régions codantes devrait être exclus, et les sites hors cible totales prévues devraient être réduite au minimum.
3. De la sortie de l’outil de conception de guide RNA, exclure la séquence de PAM (5′-NGG-3′) ; Il n’est pas utilisé pour le ciblage mais comprend la séquence de reconnaissance pour le clivage Cas9.
4. Aux autres 20 nucléotides (nts), ajouter la séquence du promoteur T7 et la séquence de chevauchement (région complémentaire à un échafaudage oligo utilisé pour synthétiser la pleine longueur sgRNAs fourni dans le kit de transcription recommandée en vitro ) dans l’ordre indiqué ci-dessous afin d’obtenir un oligo nt 54 : séquence promoteur T7 : 5′-TTCTAATACGACTCACTATA-3 ' ; Guide RNA séquence 5′ - G (N)₁₈ G-3′ ; Chevaucher la séquence : 5′-GTTTTAGAGCTAGA-3′
5. Identifier des amorces PCR qui entourent le site coupe prédit (Cas9 fend 3 nt en amont de la séquence de PAM) à une distance de 50 à 150 paires de bases (bp) chaque du couper à l’aide du logiciel web-basé (voir Table des matières).
   Remarque : Ces servira dans une étape ultérieure pour la mesure de l’efficacité de coupe. Si aucun apprêts appropriés ne sont identifiés à l’aide de ces contraintes, un autre site d’ARN guide devrez peut-être considérée.
6. Commander 54 oligonucléotides nt pour produire le guide des amorces ARN et PCR pour l’analyse des sites cibles (voir Table des matières).
   Remarque : Comme un contrôle positif facultatif, il peut être utile produire un sgRNA ciblant un gène nécessaire à la production de pigment pour vérifier l’exécution du présent protocole à l’aide d’un phénotype visuel facilement sécable (voir la Figure 1 pour les résultats représentatifs). Une cible commune est le gène tyrosinase, utilisant les oligo (guide séquence d’ARN est souligné)³⁹: 5′-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3′

2. préparation des CRISPR-réactifs pour l’embryon Microinjection

1. Commander des protéines de Cas9 disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
   NOTE : Injection de Cas9 ARNm permet également pour générer des indels dans le poisson-zèbre,^40,41, cependant la microinjection d’embryon de poisson zèbre avec Cas9 protéine s’est avérée être le plus efficace de^32,42.
   1. Suspendre la protéine Cas9 dans le tampon fourni permettant de générer une solution de 1 mg/mL. Conserver la solution dans prête à injection aliquotes dans des tubes PCR à-80 ° C pour réduire le nombre de cycles de gel-dégel. Pour générer un 5 µL de solution injection, 2 µL de 1 mg/mL Cas9 solution est utilisée, donc le Cas9 peuvent être aliquotés en 2 µL d’extraits à l’aide de bande-tubes PCR.
2. Synthétiser le sgRNA à l’aide de la sgRNA in vitro transcription kit (voir Table des matières). Effectuer la transcription in vitro conformément aux instructions du fabricant.
   Remarque : Maintenir exempte de RNase technique au cours de la synthèse, nettoyage et injection tous et étapes de préparation à la solution. Par exemple, utiliser des gants jetables et changez-les souvent, utilisez des tubes et des conseils qui sont certifiées exempte de RNase et nettoyer les surfaces et les pipettes avec des solutions disponibles dans le commerce pour décontaminer le matériel de laboratoire (voir Table des matières).
3. Purifier le sgRNA synthétisé à l’aide d’une précipitation d’acétate d’ammonium/à l’aide de la technique de RNase-libre.
   Remarque : Vous pouvez également sgRNAs peut être purifié en utilisant une variété d’ARN de basée sur les colonnes disponible dans le commerce kits de nettoyage pour un coût relativement modeste.
   1. Ajouter 25 µL d’acétate d’ammonium 5 M et vortex pour bien mélanger.
      Remarque : La solution d’acétate d’Ammonium est disponible dans le commerce (voir Table des matières), ou une solution de 5 M peut être faite dans la maison en ajoutant 385,4 mg d’acétate d’ammonium grade moléculaire à 1 mL d’eau exempte de RNase et conservée à-20 ° C.
   2. Ajouter 150 µL d’éthanol exempte de nucléase à 200 à l’épreuve dans chaque échantillon. Placez la réaction dans un congélateur à-80 ° C pendant au moins 20 min.
      Remarque : Les échantillons peuvent être stockés pendant la nuit à-80 ° C, mais n’augmentera pas de manière significative le rendement total de RNA.
   3. Centrifuger les échantillons à la vitesse maximale (> 16 000 x g) dans une micro-centrifugeuse de 4 ° C pendant 20 min.
   4. Retirez délicatement le surnageant par pipetage lentement le liquide, assurant que le culot de RNA n’est pas perturbé.
   5. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % (créé en diluant exempte de nucléase d’éthanol dans l’eau sans RNase) et mélanger doucement le tube en inversant plusieurs fois pour laver le sel résiduel du tube.
   6. Répétez l’étape de centrifugation pendant 7 min.
   7. Retirez le surnageant par pipetage première la plupart de la solution à l’aide d’une pipette P1000, puis utilisez une pipette P200 pour retirer autant de solution possible sans perturber le culot. Sécher le culot de RNA dans un espace propre, tel qu’une hotte à flux laminaire ou une paillasse, en prenant soin d’éviter toute contamination de la RNase, 15 min ou jusqu'à ce qu’aucun liquide ne plus les gouttes sont visibles dans le tube.
   8. Resuspendre le culot dans 30 µL d’eau exempte de RNase, quantifier le produit (par exemple à l’aide d’un spectrophotomètre) et la partie aliquote de la solution pour le stockage à long terme dans un congélateur à-80 ° C.
      Remarque : Des concentrations typiques varient de 800 à 2 500 ng/µL.
4. (FACULTATIF) Vérifiez que RNA pleine longueur a été généré à l’aide d’urée/PAGE. Sinon, utiliser un gel d’agarose pour vérifier que l’ARN est intacte.
   Remarque : Toutefois, si vous utilisez un gel d’agarose à une plus grande quantité de gRNA doit être exécutée pour visualiser l’ARN et la longueur ne peut pas être déterminée avec précision. Lors de l’analyse de l’efficacité de la cible de coupe après l’injection des réactifs dans le poisson, s’il y a peu ou pas de coupe présente le sgRNA doit être vérifiée pour la dégradation.
   1. Avec 40 % de polyacrylamide (19:1) et l’urée 8 M à l’aide technique de RNAse-libre pour les solutions et les équipements⁴³, monter un gel de polyacrylamide de 8 % en TBE.
      NOTE : Les matériaux disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour nettoyer l’équipement (voir Table des matières).
   2. Après le gel solidifié complètement (environ 30 min), équilibrer le gel en le plaçant en TBE tampon et en effectuant l’électrophorèse pour 30 min à 5 V/cm.
   3. Mélange de 300 à 500 ng de sgRNA avec un volume égal de 2 x chargement de RNA gel colorant (voir Table des matières). En utilisant un P1000, effacer les puits de tous les débris de pipetage tampon en cours d’exécution dans chaque bien plusieurs fois. Chargez la solution (s) et exécutez le gel à 10 V/cm pour 2,5 h.
      Remarque : Une ruelle de marqueur ici est utile pour visualiser la longueur de l’ARN, mais n’est pas nécessaire ; en général, il est évident que s’il est plein longueur RNA a été synthétisé (Figure 2).
   4. Visualiser les bandes à l’aide d’un acide nucléique tachent (voir Table des matières).
      Remarque : sgRNA bandes doivent apparaître comme une seule bande, alors que les bavures indique la dégradation de l’ARN (Figure 2).

3. la microinjection de CRISPR-composants dans des embryons de poisson-zèbre

1. Mis en place la nuit avant l’injection en plaçant le nombre désiré de mâles et femelles de reproduction des réservoirs (typiquement 2 femelles et des mâles de 1 ou 2) dans un réservoir d’élevage avec un diviseur à placer⁴⁴.
2. Préparer une plaque de microinjection avec 1,5 % d’agarose dans 1 x E3 médias (voir la Table des matières) avec 0,01 % de bleu de méthylène (fongicide) en versant 35 mL de l’agarose fondu dans une boîte de Pétri de 10 cm et de poser délicatement un moule en plastique pour créer des creux en forme de coin dans la solution, tapotant le moule pour éliminer les bulles d’air.
3. Permettre l’agarose à régler et stocker le plat avec une petite quantité de médias et enveloppés dans du film de paraffine pour empêcher le plat ne se dessèchent pas à 4 ° C.
   NOTE : Plaques d’Injection sont réutilisables pendant plusieurs semaines, jusqu'à ce que les puits deviennent déformées ou sèche, ou la plaque commence à croître de moule.
4. Le matin de l’injection, décongelez sgRNA purifié et Cas9 protéine sur la glace. N’oubliez pas de traiter tous les matériaux avec des gants pour éviter la contamination de la RNase et d’utiliser des tubes et des conseils de RNase-libre.
5. Générer un 5 µL de solution injection en combinant la protéine Cas9 et la sgRNA dans un rapport de 2:1 de Cas9:sgRNA pour obtenir la concentration finale de 400 pg/nL Cas9 protéine et 200 pg/nL sgRNA. Incuber la solution Cas9/sgRNA à température ambiante pendant 5 min permettre au Cas9 et sgRNA former un complexe ribonucléoprotéique. Ajouter 0,5 µL de solution de rouge de phénol 2,5 % wt/vol (voir Table des matières), et de l’eau exempte de RNase pour un volume final de 5 µL.
   Remarque : La force ionique de la solution a été démontrée d’influer sur la solubilité de la complexe, que donc l’ajout de KCl peut augmenter l’efficacité de la coupe de sgRNAs qui présentent une faible indel formation²⁸Cas9/sgRNA.
6. Faire une aiguille d’injection en tirant sur un verre de 1.0 mm capillaire à l’aide d’un extracteur d’une micropipette. Couper la pointe de l’aiguille fraîchement faites à l’aide d’une lame de rasoir Neuve ou une pince pour obtenir une ouverture angulaire qui percer facilement le chorion et le sac vitellin.
7. Placer l’aiguille dans un micromanipulateur attaché à un microinjector avec la source d’air en marche. Sous un microscope optique en utilisant le grossissement approprié pour l’étalonnage déterminée pour l’appareil particulier, ajustez la pression d’injection jusqu'à ce que l’aiguille éjecte constamment une solution nL 1 dans une boîte de Pétri rempli d’huile minérale.
   Remarque : La qualité de l’aiguille est essentielle. Pratique produisant une aiguille et l’injection dans le sac vitellin des embryons jusqu'à ce qu’il s’agit de compétence est maîtrisée avant de tenter d’autres expériences⁴⁵.
8. Retirer le diviseur et laisser les poissons se reproduisent pendant environ 15 min.
   NOTE : Temps d’élevage vont produire des embryons en nombre supérieur, cependant l’injection devrait être terminée alors que les embryons sont au stade 1 cellule pour maximiser la chance cette coupe Cas9 aura lieu au début et donc diminution de mosaïcisme génétique. Les embryons peuvent être injectés à un stade ultérieur (2 – 4 étapes de cellule), mais cela peut peut-être diminuer le taux de transmission de lignée germinale de l’allèle mis à jour le.
9. Recueillir les oeufs à l’aide d’une passoire et rincez-les dans une boîte de Pétri en utilisant 1 x E3 médias avec le bleu de méthylène 0,0001 % de 10 cm. Examiner la santé des oeufs en microscopie, enlever tout les œufs non fécondés et les débris.
10. Mis de côté 10 – 15 embryons comme un contrôle non dans un séparé, étiquetées Pétri.
11. À l’aide d’une pipette de transfert, s’alignent doucement les œufs sur la plaque d’injection chauffé à température ambiante.
12. Sous un microscope à dissection grossissement X 2,5, injecter 1 nL de la solution dans le sac vitellin de chaque embryon d’injecter un total de 400 pg de Cas9 protéine et 200 pg de sgRNA.
    Remarque : Pour augmenter la coupe si souhaité ou nécessaire, augmenter la concentration finale de Cas9 protéines à 800 pg/nL et de sgRNA à 400 pg/nL dans la solution injectable ; Cependant, cela peut aussi augmenter la coupe hors cible ou diminuer la santé de l’embryon. L’efficacité de coupe peut également être augmentée en injectant directement dans la cellule à⁴⁶. Toutefois, l’injection dans le sac vitellin est techniquement moins exigeant et donne coupe suffisante pour produire des poissons avec une transmission de haute lignée germinale (> 70 % de la progéniture contenant un allèle modifié).
13. Retourner les embryons injectées à une boîte de Pétri correctement étiquetées, couvrez-les avec 1 x E3 médias avec le bleu de méthylène et mettez-les dans un incubateur d’embryon réglé à 28 ° C.
14. Après 24 h après la fécondation (hpf), d’inspecter la santé des embryons injectées, suppression des individus morts ou anormalement en développement et changer les médias (voir la Figure 3). Vérifier le taux de survie contre la commande de l’action.
    Remarque : Lorsque ciblant un gène non essentiel, à moins de 10 % de létalité devrait par rapport aux témoins non. Si des taux élevés de létalité sont observés dans les populations de guide-injecté par rapport au contrôle non, cela peut indiquer que le gène ciblé est essentiel pour le développement, ou effets hors cible mènent au développement ayant échoué. Réduire la quantité de réactifs CRISPR injectés peut être nécessaire ou génération d’une nouvelle sgRNA avec des effets réduits hors-cible peut être exigée.
15. Remettez les embryons dans l’incubateur et continuer de croître les embryons à 72 hpf, changeant les médias tous les jours pour maintenir la santé de l’embryon.

4. analyse de l’efficacité de la Formation Indel utilise une zone de

1. Recueillir deux séries de cinq embryons des plaques injectés atteint 72 hpf dans des microtubes à centrifuger et recueillir un ensemble de cinq embryons d’un contrôle de l’action.
2. Anesthésier les embryons en ajoutant 0,004 % MS-222 (tricaïne) et attendre 2 min.
3. Pour extraire l’ADNg, doucement Pipetter médias chaque REGLAGE de l’embryon et ajouter 45 µL de 50 mM de NaOH. Incuber les embryons à 95 ° C pendant 10 min.
4. Retirer les embryons de la source de chaleur et de froid à température ambiante. Ajouter 5 µL de 1 M Tris-HCl pH = 8 et vortex les échantillons vigoureusement (5 à 10 s). Centrifuger la solution à vitesse maximale (> 16 000 x g) dans une température ambiante de micro-centrifugeuse pendant 3 min. transférer le liquide surnageant dans un tube propre, étiqueté et stocker l’ADNg à-20 ° C ADN jusqu'à 6 mois.
   NOTE : Des fragments d’ADN environ 900 bp et plus petit sera généré grâce à l’utilisation du présent protocole.
5. Mettre en place une réaction de PCR 50 µL avec 2 µL de l’ADNg préparé chaque échantillon (y compris un contrôle non) selon les instructions incluses avec la polymérase, utilisant les amorces précédemment flanquant le site coupe prévu.
6. Purifier le PCR produits par une PCR nettoyage nécessaire (voir la Table des matières), éluer les échantillons dans 30 µL de tampon de l’eau ou d’élution et quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
7. Reanneal tous les 30 µL de chaque produit PCR purifié en plaçant les tubes dans une grille flottante dans un bain d’eau bouillante (environ 150 mL dans un bécher de 500 mL). Après 3 min, éteignez la source de chaleur et laisser les solutions refroidir à température ambiante, environ 1 h.
   Remarque : Cette étape dénature tout d’abord l’ADN et permet ensuite les brins de reanneal au hasard pour générer des bandes hétéroduplex possible ou dépareillé ADN double brin qui contient des polymorphismes créé par CRISPR-mutagenèse et ont par conséquent une altération mobilité électrophorétique par rapport à homoduplexes. Le dernier cycle de PCR ou le programme de la rampe-vers le bas dans le thermocycleur peut également être utilisé pour reanneal produits^47,48, mais utilisation de la baignoire bouillante peut-être donner une résolution améliorée des hétéroduplex produits.
8. Ajouter 5 µL de 6 x chargement teindre (voir Table des matières) aux solutions PCR reannealed.
9. Monter un gel de polyacrylamide/TBE de 15 % à l’aide de 30 % de polyacrylamide (29 : 1). Après que le gel s’est couché, placez-le dans un appareil d’électrophorèse avec TBE tampon. En utilisant un P1000, désactivez les puits de tous les débris tels que les sels résiduels ou gel des fragments qui peuvent obstruer les puits par doucement pipetage tampon de haut en bas dans les puits plusieurs fois.
10. Charge 500 ng des produits PCR reannealed et charge un contrôle (échantillon de poisson non) à côté de chaque série d’échantillons de sgRNA. Exécutez le gel à 150 V 2,5 h ou jusqu'à ce que l’avant de la teinture se trouve au bas du gel.
11. Visualiser les bandes à l’aide d’un colorant acide nucléique (p. ex., le bromure d’éthidium ou SYBR green (voir Table des matières)).
12. Examiner le modèle de bande pour chaque contrôle et injection CRISPR piscine d’embryons.
    Remarque : L’apparition de multiples bandes qui s’exécutent plus lentement dans l’injection par rapport aux voies non indique la formation de produits nouveaux hétéroduplex (Figure 4). La présence de roman hétéroduplex ADN indique qu’indels ont été générées par l’injection de CRISPR. Réduction de l’intensité de bande homoduplex dans les solutions injectées d’environ 50 % ou plus est généralement suffisante pour entraîner la transmission suffisante de cellules germinales. En outre, les bandes supplémentaires sont parfois identifiés chez les poissons non et ne sauraient hétéroduplex bandes lorsque observées chez les poissons injectées.
13. Choisissez les injections avec des efficacités de coupe plus élevées par rapport aux témoins non pour chaque cible ; les embryons de ces injections peuvent servir à grandir de poissons chercher indels causant des codons stop prématurés.
    Remarque : Pour une coupe très efficace (réduction de la bande homoduplex par environ > 50 % d’intensité), dépistage des poissons adultes de 20 à 30 devrait être suffisante pour obtenir la transmission de la lignée germinale.
    Pour sgRNAs qui génèrent moins de coupe, des poissons plus adultes peuvent être nécessaire d’augmenter la probabilité d’identification des poissons qui présentent une transmission de la lignée germinale des allèles modifiés contenant un codon stop prématuré. Si on observe pas la formation d’indel il peut être nécessaire de revoir le sgRNA dans une région différente du gène. Si aucune formation de bande hétéroduplex est observée, le sgRNA peut avoir dégradé et la qualité de sgRNA doit être vérifiée à l’aide d’un gel d’urée/PAGE.

5. identification et Propagation des lignes Knock out

1. Pour identifier un éventuel poisson de parent fondateur, effectuer des clips de la queue des poissons adultes F0 (cultivés à environ 2,5 à 3 mois) pour identifier la présence des indels. Anesthésier les poissons de tricaïne 0,62 mM (voir Table des matières), puis utilisez une lame de rasoir propre et pointue pour enlever environ 1/2-3/4 de la nageoire caudale.
2. Placer la queue de 45 µL 50 mm NaOH et retourner le poisson à un réservoir de récupération. Effectuer l’extraction ADNg comme décrits (étapes 4.2 – 4,4). Une fois le poisson reprend le comportement de nage normale, remettez les poissons sur coulant eau système jusqu'à ce que la nature de l’indel est identifiée.
   Remarque : Il est essentiel de s’assurer que chaque poisson est identifiables et peut correspondre aux résultats des clips queue convenablement.
3. Comme décrit (étapes 4,5 à 4,9), effectuer un HMA sur la queue clip ADNg afin de déterminer si le poisson a été modifié par l’injection de CRISPR (Figure 5). Pour identifier un poisson fondateur, se reproduisent les adultes qui présentent des bandes hétéroduplex d’ADNg queue de poisson sauvage. Recueillir les embryons et cultivez-les à 72 hpf.
4. À 72 hpf, collecter 10 embryons et placer chaque embryon dans un tube individuel. Réaliser une extraction ADNg décrite ci-dessus (étapes 4.2 – 4,4) à l’aide de 11,25 µL 50 mm NaOH et 1,25 ml de 1 M Tris pH = 8.
5. Répétez la PCR et l’électrophorèse pour identifier les bandes hétéroduplex tel que décrit ci-dessus (étapes 4.7 – 4.13) afin de déterminer si indel allèles ont été transmis à cette génération (Figure 6).
6. Basé sur le pourcentage de transmission observé chez des embryons unique utilise cette zone, croître en moyenne de 20 à 30 embryons obtenus par la Croix pour chaque CRISPR-lignes d’intérêt à l’âge adulte.
   Remarque : Ce nombre peut augmenter ou diminuer selon la fréquence de transmission de la lignée germinale.
7. Effectuer des clips de la queue du poisson adult F1 pour identifier la présence d’indels comme décrits (mesures 5.1-5.2). Comme décrit (étapes 4,5 – 4.11), effectuer un HMA sur la queue clip ADNg afin de déterminer si le poisson porte un indel (Figure 7).
8. Pour les poissons qui contiennent un groupe hétéroduplex, préparer l’ADN pour l’analyse de la séquence.
   1. Effectuer la PCR à l’aide de nouvelles amorces pour amplifier un produit PCR bp 300 – 600 centrée autour du site de coupe.
   2. Utiliser un kit de purification de PCR pour nettoyer de l’ADN et éluer dans 30 µL. examiner l’ADN sur gel d’agarose pour assurer une seule bande est présente.
      Remarque : Certains hétéroduplex baguage peut-être être présent sur le gel d’agarose et apparaît comme un petit frottis ou double bande juste au-dessus du produit PCR à la taille attendue.
9. Si un à trois indels sont analysés, séquencer les produits PCR à l’aide de Sanger sequencing et déterminer la séquence de l’indel à l’aide d’un outil de bio-informatique⁴⁹. Dans le cas contraire, la détermination de la séquence de plusieurs produits de la PCR en utilisant l’analyse de la NGS (voir Table des matières) est plus économique.
10. Déterminer si un codon stop prématuré a été obtenu par l’analyse de la séquence à l’aide d’un outil de bio-informatique (voir Table des matières).
11. Placer le poisson contenant allèle mutant désiré dans un nouveau réservoir avec des étiquettes appropriées.
12. Concevoir des amorces PCR spécifiques indel des allèles pour les besoins futurs de génotypage. Ces amorces devraient couvrir la séquence mutée et pas amplifier la séquence de type sauvage.
13. En croix zebrafish hétérozygote pour générer une population en ségrégation qui contiendra les lignes de knock out de 25 %.

Résultats

Les approches expérimentales décrites dans le présent protocole permettant une production efficace et rentable des lignes de knock out de poisson-zèbre utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Les chiffres suivants ont été inclus dans cet article pour faciliter l’interprétation et le dépannage des résultats obtenus à l’aide de ce protocole. Suite production réussie et microinjection de CRISPR-réactifs, les embryons de poisson-zèbre peuvent être analysés pour les phénotypes manifestes et indel formation à l’aide de HMA. Un contrôle utile de visualiser la réussite de l’expérience-CRISPR est l’utilisation de la sgRNA décrit à l’étape 1.5 pour cibler le gène productrices de pigment tyrosinase. Indel Cas9 induite par la formation à la tyrosinase entraîne une perte de pigmentation et est facilement marquée par 48 hpf (Figure 1). Un autre contrôle utile pour s’assurer que la préparation des réactifs-CRISPR pour injection a été couronnée de succès, est de vérifier que le DVD complet (120 nt) sgRNA a été synthétisé à l’aide d’un gel de polyacrylamide dénaturation (Figure 2, voie 1 et 2). Si l’ARN a été dégradée, il peut apparaître comme un frottis, par exemple 3 voies (Figure 2) montre des ARN dégradé qui ne convient pas pour injection.

Pour analyser la fréquence de formation indel des gènes ciblés par CRISPR-Cas9 qui n’aboutissent pas à des phénotypes manifestes tels que de la tyrosinase, analyse HMA est une méthode simple et fiable. sgRNA/Cas9 injecté embryons analysées à l’aide des résultats HMA dans la formation des bandes hétéroduplex et réduction de l’intensité de la bande de homoduplex (Figure 4). La présence de bandes hétéroduplex est davantage utilisée dans le présent protocole pour identifier les éventuels poissons fondateur des embryons microinjectés et que les adultes (Figure 4 et Figure 5), pour analyser l’efficacité de transmission des cellules germinales d’un fondateur ( Figure 6) et de vérifier la présence d’un indel dans un poisson de F1 hétérozygote (Figure 7). Les poissons hétérozygotes qui contiennent un indel sont candidats pour NGS pour identifier la nature de l’indel et de déterminer si un codon stop prématuré est présent dans la région codante du gène cible.

Figure 1 : Les embryons de poisson-zèbre présentent un défaut de pigment lorsqu’elle est injectée avec une sgRNA ciblant la tyrosinase au stade unicellulaire. (A) sauvage, non embryon à 48 hpf et (B) injecté embryon à 48 hpf. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : In vitro de transcription de sgRNA à l’aide de kit de synthèse. Oligos ont été synthétisés à l’aide de in vitro transcription conformément aux instructions de kit de synthèse sgRNA. 500 ng d’ARN a été exécuté sur un gel d’urée/PAGE comme décrit. sgRNA chargé dans les couloirs 1 et 2 montre une bande correspondant à la pleine longueur, intact 120 nt RNA. Le sgRNA en voie 3 montre un exemple de RNA dégradé qui ne convient pas pour injection.

Figure 3 : Comparaison de la santé des embryons de hpf injecté 24. Un embryon de vie (A) mis au point à 24 hpf, se distingue facilement d’un embryon qui a interrompu le développement (B). Les embryons qui ressemblent à (B) ou qui ont radicalement modifié les caractéristiques de (A), comme la courbure de la colonne vertébrale ou modifié tête et développement de le œil doit être retirée du plat. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse de mobilité hétéroduplex de sgRNA-Cas9 micro embryons de poissons zèbres. Piscines de 5 embryons par échantillon prélevés à 72 hpf et ADNg a été extrait. Hétéroduplex analyse a été réalisée comme décrit, échantillons sont chargés également de 500 ng d’ADN. Voies : M = 100 bp marqueur ; 1 = non contrôle ; 2 = injection sample 1 ; 3 = échantillon d’injection 2. Prévu de taille de bande = 98 bp.

Figure 5 : Analyse de mobilité hétéroduplex d’ADNg extraite de la queue d’un poisson-zèbre adulte injecté CRISPR. Les embryons qui ont été injectés avec une sgRNA et Cas9 protéine ont été cultivés à l’âge adulte (3 mois). Poisson B et C pièce hétéroduplex bandes et ont été élevés par la suite afin d’identifier les indels germline transmis ; poisson A n’était pas utilisé dans une analyse ultérieure parce qu’il ne présente pas une bande hétéroduplex positive. Voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2 = poisson A ; 3 = poisson B ; 4 = poisson C. attendu bande taille = 98 BP. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse de mobilité hétéroduplex d’embryons unique généré par la reproduction d’un poisson-zèbre F0 CRISPR-injecté à un poisson sauvage pour identifier les cellules germinales transmis indels. Poisson zèbre ont été accouplés et les embryons de F1 cultivés pour les embryons unique de 72 h. ont été prélevés et hétéroduplex analyse effectuée comme indiqué. Voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2-10 = un seul embryon de F1 par couloir. Ce gel montre que 7 des 10 embryons montrent une bande hétéroduplex positif, indiquant un taux de transmission de lignée germinale de 70 % de l’indel. Prévu de taille de bande = 98 BP. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Analyse de mobilité hétéroduplex d’adultes clips de queue de poisson-zèbre F1. Les poissons adultes de F1 ont été marqués par HMA pour identifier les indels. Les poissons qui présentaient une bande hétéroduplex positifs étaient PCR amplifiés et soumis à l’analyse de la séquence large pour déterminer la nature de la mutation. (A) voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2 = poisson une (délétion 4 bp, 1 incompatibilité de bp). (B) ces F1 poissons ont été identifiées dans le même fondateur et encore montrent différente hétéroduplex patterning, indiquant la lignée germinale transmission de multiples allèles modifiés d’un fondateur unique. Voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2 = poisson B (4 bp insertion, incompatibilité de bp 7), 3 = poisson C (4 bp suppression, 4 incompatibilité de bp). Chacun des ces indels créé un codon stop prématuré dans la séquence codante du gène cible, tel que déterminé par NGS. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit la production de débouchures de gène dans le système de vertébrés modèle poisson zèbre utilisant la technologie CRISPR-Cas9. Un certain nombre de protocoles ont été décrits précédemment pour entreprendre le génie de génome induite par CRISPR zebrafish^{15,25,26,50,51,52}. Ce protocole s’appuie sur des efforts antérieurs en combinant un certain nombre de techniques expérimentales simples mais reproductible cohérentes, en particulier HMA et NGS de multiples poissons hétérozygotes, pour créer un simple, économique et protocole expérimentalement robuste pour la mutagénèse induite par le CRISPR chez le poisson zèbre qui est appropriée pour les laboratoires disposant d’employés avec une gamme de formation et expérience, ainsi que des laboratoires d’enseignement.

Recommandations pour la conception et la synthèse du guide que RNAs sont inclus dans le présent protocole. Une considération importante dans le guide de conception de RNA est la minimisation des effets hors cible. Plusieurs algorithmes de prévision ont été développées pour permettre CRISPR-utilisateurs d’accéder aux outils de calcul avec des interfaces graphiques conviviales qui permettent de prédire tant l’activité du guide sur la cible et la possibilité d’effets hors cible^{34, 35,},³⁶. Un avantage spécifique du système poisson zèbre est taux réduits des effets hors cible car le Cas9 est injecté dans les embryons et par conséquent l’expression est transitoire, qui a été démontré chez la souris, se traduire par une diminution des effets hors cible⁵³. Néanmoins, les effets hors cible ont été démontrées chez le poisson zèbre⁵⁴. Contrôle des effets hors cible consiste à phénotype fondateur poisson zèbre qui ont été générées par les deux ARN guide indépendant qui ciblent le même gène, comme ces guides seraient très susceptibles d’affecter les sites hors cible différents. Une autre méthode pour réduire au minimum les effets hors cible qui n’est pas décrit dans le présent protocole est l’utilisation d’un Cas9 muté qui génère des cassures monocaténaires sur la cible de l’ADN, qui doivent être réparés avec une grande efficacité. Les pseudos d’ADN situé à proximité d’un de l’autre qui sont complémentaires à l’opposé de l’appariement brins conduit à la formation d’indel efficace au locus désiré et minimise les effets hors cible^55,56.

En plus d’avoir des taux différents d’effets hors cible, sgRNAs différentes peuvent avoir des taux différents de mutagenèse de la cible souhaitée^57,58,59. Ce protocole utilise HMA pour analyser l’efficacité de la mutagénèse d’une sgRNA donnée à l’aide de hétéroduplex bande formation^33,40. Hétéroduplex bandes sont créés par hybridation générées par PCR des brins d’ADN qui contiennent des incompatibilités et peut être facilement résolu par électrophorèse sur gel. Contrairement aux autres méthodes couramment utilisées pour mesurer la formation indel, tels que l’endonucléase T7 dosage ou haute résolution fondre analyse^25,26, HMA ne nécessite pas une enzyme cher pour couper l’ADN ne correspondent pas et ne nécessite pas de une analyse complexe de PCR fondre courbes. Ce qui est important, pour vérifier les taux élevés de formation indel dans la population injectée à l’aide de HMA permet également l’enquêteur afin de minimiser le nombre de poissons nécessaires à la production ultérieure de lignes knock out, ce qui réduit le coût d’identification d’une mutation avec le caractéristiques souhaitées.

La facilité relative de production axée sur les CRISPR indels permet la création de multiples allèles de plusieurs gènes à la fois. Logiciel Web est disponible pour l’analyse de simples mutations hétérozygotes poissons à l’aide de Sanger séquençage des produits PCR⁴⁹. Dans le cas où trois ou plusieurs allèles muté CRISPR sont analysées, NGS pour caractériser la nature de l’indel est probablement plus rentable pour caractériser la nature de l’indel comme cette approche permet une piscine de 50 différents allèles se caractériser à o RCE (voir Table des matières)^60,,du⁶¹⁶². Ces économies d’échelle serait particulièrement utile dans un environnement de laboratoire premier cycle.

En résumé, ce protocole fournit des instructions étape par étape de façon reproductible génération haute qualité CRISPR-réactifs (en particulier, sgRNA) telle que moins de poissons adultes doivent être créés et analysées afin d’identifier correctement les allèles mutants d’intérêt, qui réduit également le temps et le coût de production des lignes souhaitées. Ce qui est important, ce protocole a été conçu telle qu’elle peut être appliquée par les laboratoires disposant de ressources limitées pour produire le poisson-zèbre mutant de façon abordable. En outre, nous avons constaté que cette approche convient aux étudiants de premier cycle et étend ainsi les possibilités d’éducation et de formation des étudiants de premier cycle intéressés par une expérience pratique dans l’édition de base CRISPR génome.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CRISPOR			sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/
Breaking-Cas			sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChop			sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3			PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Rnase free technique			http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-free water	Any brand		Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.
Rnase-free ethanol	Any brand		Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.
Cas9 Protein	PNA Bio	CP01	Cas9 protein with nuclear localization signal.
Target specific oligos	Integrated DNA Technologies (IDT)		Synthesize guide RNAs.
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.
EnGen sgRNA Synthesis Kit	New England BioLabs	E3322	In vitro transccribe guide RNAs.
10X TBE	Thermo Fisher	B52	RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.
6X Load Dye	New England BioLabs	B7025S	Loading DNA for electropheresis.
5M Ammonium acetate	Thermo Fisher	AM9071	Clean up reagent for purification of guide RNAs.
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any brand		Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.
Nuclease-free Water	Any brand		For synthesis and purification of guide RNAs.
RNase away	Thermo Fisher	10328011	Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.
DNA Ladder, 100 bp	New England BioLabs	N0467S	Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
DNA Ladder, 1 kb	New England BioLabs	N0552S	Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.
RNA Ladder	New England BioLabs	N0364S	Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized
TEMED	Thermo Fisher	17919	Casting polyacrylamide gel.
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678	Casting polyacrylamide gel.
40% Polyacrylamide (19:1)	BioRad	161-0154	Casting denaturing polyacrylamide gel.
Urea	Sigma-Aldrich	U5378-100G	Casting denaturing polyacrylamide gel.
RNA Gel Loading Dye (2x)	Thermo Fisher	R0641	Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Visualization of nucleic acids.
SYBER Green	Thermo Fisher	S7563	Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.
Microcentrifuge	Eppendorf	5424	RNA clean up, PCR purification.
MyTaq Polymerase	Bioline	BIO-21105	For amplification of DNA using PCR.
Thermocycler	Any brand		PCR amplification.
Spectrophotometer	Any brand		NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.
E3 embryo media	Made in house		Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140	Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.
Petri dish	Thermo Fisher	FB0875711Z	Store embryos, cast injection plate.
Agarose	Denville	CA3510-8	Casting injection plate, agarose gels.
Microinection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	To create wells to hold embryos during injection.
Phenol Red	Sigma-Aldrich	P0290	Dye for visualization of injection.
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	To calibrate needle injection volume.
Transfer pipettes	Any brand		Moving embryos.
Razor blade	Thermo Fisher	11295-10	Cutting injection needle, tail clipping adult fish.
Incubator	Any brand		Maintaining embryos at 28.5 oC.
Verticle pipette puller	David Kopf Instruments	700C	Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
Capillary tubes	Sutter Instruments	BF100-58-10	Geneate needles for injection.
Microloader tips	Eppendorf	930001007	Load solution into injection needles.
Microinjector	World Precision Instruments	PV 820	Injecting embryos.
Disecting microscope	Leica		Injecting embryos.
30% Polyacylamide (29:1)	BioRad	161-0156	Heteroduplex gel casting.
MS-222 (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A-5040	Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
Microwave	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Scale	Any brand		Casting injection plate, agarose gels.
Gloves	Any brand		For all aspects of the protocol.
N2	Any brand		To expell liquid from the capillary for embryo injection.
1,000 µL  tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
200 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
10 µL tips	Any brand		For all aspects of the protocol.
PCR strip tubes	Any brand		For all aspects of the protocol.
Micropipettes	Any brand		For all aspects of the protocol.
NGS Sequencing platform: Wideseq			If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).
Software for sequence analysis			For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software for sequence analysis			SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.