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Résumé

Nous décrivons ici un protocole de puce-séquençage haut débit optimisé et pipeline analyses calcul pour la détermination de modèles État pangénomique chromatine de lignées de cellules et tissus tumoraux congelés.

Résumé

Histone modifications constituent une composante majeure de l’épigénome et jouent un rôle réglementaire important dans la détermination de l’État transcriptionnel de loci associés. En outre, la présence de modifications spécifiques a été utilisée pour déterminer la position et l’identité non codantes des éléments fonctionnels comme améliorateurs. Ces dernières années, immunoprécipitation de la chromatine suivie de séquençage de la génération suivant (ChIP-seq) est devenu un outil puissant pour déterminer les profils de génome des modifications des histones individuelles. Cependant, il est devenu plus en plus évident que les modèles combinatoires de modifications de la chromatine, appelées États de chromatine, déterminent l’identité et la nature du locus génomique associé. Par conséquent, les workflows consistant en des méthodologies (HT) haut débit robustes pour le profilage d’un certain nombre de marques de modification des histones, mais aussi des pipelines d’analyses informatiques capables de manipulation des myriades de ChIP-Seq profilage datasets, sont nécessaires pour détermination complète des États épigénomique en grand nombre d’échantillons. Le HT-ChIP-Seq workflow présenté ici se compose de deux modules : 1) un protocole expérimental pour le profilage de plusieurs modifications d’histone de petites quantités d’échantillons de tumeurs et de lignées cellulaires dans un format 96 puits ; et 2) un pipeline d’analyse de données informatiques qui combine des outils existants pour calculer les modèles d’état de la chromatine combinatoires et les occupation marque individuelle. Ensemble, ces deux modules de facilitent le traitement facile des centaines d’échantillons de ChIP-Seq de manière rapide et efficace. Le flux de travail présentée ici est utilisée pour dériver des modèles d’état de la chromatine de 6 profils de marque histone dans les tumeurs de mélanome et de lignées cellulaires. Dans l’ensemble, nous présentons un workflow de ChIP-seq complète qui peut être appliqué à des dizaines d’échantillons de tumeurs humaines et des lignées de cellules cancéreuses pour déterminer épigénomique aberrations dans diverses tumeurs malignes.

Introduction

La majorité des génomes de mammifères (98-99 %) est constituée de séquences non codantes, et ces régions nocoding contiennent des éléments régulateurs connus pour participer au contrôle de l’expression des gènes et la chromatine organisation1,2. Dans une cellule normale, l’assembly spécifique de l’ADN génomique dans la structure de la chromatine compactée est critique pour l’organisation spatiale, le règlement et le calendrier précis de divers processus liés à l’ADN3,4,5. Dans une cellule cancéreuse Toutefois, des modifications de la chromatine par des mécanismes épigénétiques aberrants peuvent conduire à une mauvaise organisation de la structure de la chromatine, notamment l’accès aux éléments de régulation, systèmes de bouclage chromosomiques et gene expression patterns6, 7,8,9,10.

Malgré des progrès récents, nous avons limité la compréhension des altérations épigénétiques qui sont associés à la progression tumorale ou de la réponse thérapeutique. L’épigénome consiste en un tableau des modifications, y compris les marques histone et la méthylation de l’ADN, qui composent un état dynamique (dénommé État de la chromatine) qui empiète sur les réseaux de l’expression génique et autres processus essentiels pour le maintien identité cellulaire. Récemment, altérations de rehausseurs ont été présentées dans plusieurs tumeurs malignes en étudiant H3K27Ac profils11. Bien que ces études permettent de mieux comprendre la corrélation entre les marques épigénétiques isolés, plus de 100 modifications épigénétiques ont été identifiés12,,13 , sans une compréhension claire de leurs rôles biologiques et interdépendance. En outre, il y a un nombre encore plus grand des modèles combinatoires possibles de ces histones et les modifications de l’ADN, et c’est ces modèles combinatoires - modifications non individuels - qui dictent les États épigénétiques14. Par conséquent, il y a un besoin énorme d’identifier les altérations dans ces États de la chromatine au cours de la progression du cancer ou des réponses à la thérapie. Connaissance approfondie de l’épigénome altérations dans les cancers a été en retard en partie en raison de la technique (par exemple la génération de données à grande échelle de petite quantité de cellules cliniques de matériel/single) et analytique (par exemple des algorithmes pour définir défis de combinatoire d’États). Par conséquent, il est besoin critique de Méthodes robustes de haut-débit pour profiler le grand nombre de marques modification histone de matériel clinique et easy-to-implement approches informatiques pour prédire la combinatoire qui facilitera détermination des États épigénétiques associé à différentes étapes de la tumorigenèse et de résistance thérapeutique. Données supplémentaires, de récentes épigénome profilage études15,16,17,18,19,20,21, 22,23 dans les tissus normaux et les lignées cellulaires peuvent être intégrées aux profils de la chromatine des tumeurs pour plus amples aperçus épigénome contribution à la biologie de la tumeur.

Profilage de la chromatine est devenu un puissant outil pour identifier les profils de liaison globale des divers chromatine modifications15,24. Ces dernières années, ChIP-seq est devenu le « gold standard » pour l’étude des interactions ADN-protéines sur une échelle mondiale25,26,27. Pour toute expérience de ChIP-seq, il y a des étapes critiques nécessaires à son succès, y compris la dissociation et le traitement de tissus, de constatation dans des conditions optimales sonication, déterminer la concentration en anticorps optimal pour les précipitations, préparation de la bibliothèque, traitement des données après séquençage et analyse en aval. Chacune de ces étapes contiennent des points de contrôle clés contrôle de la qualité et ensemble, sont indispensable pour bien identifier les cibles potentielles pour la validation fonctionnelle. Grâce à l’innovation dans ces étapes, plusieurs études antérieures ont élaboré des méthodes pour effectuer une puce ou un ChIP-Seq de petite quantité de tissus28,29,30,31,32 . De plus, certaines études ont suggéré des protocoles pour les expériences de puce haut débit suivies par PCR basée quantification33,34. Enfin, certaines plates-formes d’analyse disponibles publiquement pour ChIP-Seq données sont maintenant disponibles comme Easeq35 et36de la galaxie. Cependant, une plate-forme intégrée pour effectuer des ChIP-Seq dans un mode haut-débit en combinaison avec un pipeline calcul pour effectuer la marque unique ainsi que des analyses d’état de la chromatine a fait défaut.

Ce protocole décrit un workflow de ChIP-seq complète et global pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les tissus de la tumeur et de lignées cellulaires, avec facile à suivre les lignes directrices qui englobe toutes les étapes nécessaires pour une expérience réussie. En adoptant une méthode de haut débit, déjà décrite par Blecher-Gonen et al. 37, ce protocole peut être effectué sur des dizaines d’échantillons en parallèle et a été appliqué avec succès sur des lignées de cellules cancéreuses et tumeurs humaines telles que le mélanome, côlon, prostate et glioblastome multiforme. Nous démontrons la méthodologie pour six modifications d’histone de base qui représentent des composantes clés du paysage réglementaire épigénétique dans les lignées de cellules de mélanome humain et des échantillons de tumeur. Ces modifications incluent H3K27ac (exhausteurs), H3K4me1 (exhausteurs actives et posés), H3K4me3 (promoteurs), H3K79me2 (transcrit les régions), H3K27me3 (polycomb répression) et H3K9me3 (hétérochromatique répression). Ces marques utilisable seul ou en combinaison pour identifier des États de chromatine fonctionnellement distinctes représentant les domaines répressifs et actives.

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Protocole

Tous les échantillons cliniques ont été obtenues en suivant les directives de l’Institutional Review Board.

1. préparation de la mémoire tampon

  1. Faire 200 mL de tampon TE (10 mM Tris-HCl, 10 mM tétraacétique (EDTA) l’acide pH 8.0).
  2. Faire 200 mL de tampon STE (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl).
  3. Faire 200 mL de 2,0 M glycine (g 37,52 de glycine dans 200 mL d’eau) et chauffer à 65 ° C.
  4. Faire 200 mL de solution à 5 % sodium Désoxycholate (DOC) (10 g de DOC dans 200 mL d’eau).
  5. Faire 500 mL de tampon de récolte de puce (12 mM Tris-Cl, 0,1 x saline tamponnée au phosphate (PBS), 6 mM EDTA, 0,5 % dodécylsulfate de sodium (SDS)).
  6. Faire 500 mL de tampon de dilution de puce (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, 0,1 % DOC, 1 % Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. Faire 500 mL de tampon de lavage RIPA (STE, 1 % Triton x-100, SDS 0,1 %, 0,1 % DOC).
  8. Faire 500 mL de tampon de lavage RIPA/500 (RIPA tampon + 360 mM NaCl).
  9. Faire 500 mL de tampon de lavage LiCL (TE, LiCl, 0,5 % de 250 mM NP-40, 0,5 % DOC).
  10. Faire 500 mL de tampon d’élution directe : pH 10 mM Tris-Cl 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, SDS de 0,5 %.
  11. Faire 50 mL de tampon de liaison/blocage des anticorps (PBS + 0,1 % de TWEEN-20 + 0,2 %, exempte d’IgG BSA).

2. tissus/cellules ligne traitement et réticulation

  1. Si le tissu est flash gelée, il dethaw sur la glace avant la dissociation.
  2. Dissocier les 50 mg de tissu (environ 8 mg par anticorps modification histone) manuellement dans 2 mL de Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) à l’aide d’une lame de rasoir stérile. Découper le tissu en morceaux de 3 à 4 mm pendant environ 5 min dans une boîte de Petri stérile tissu.
  3. Transférer le tissu et la HBSS solution dans un tube de dissociator et ajouter un autre 8 mL de HBSS. Plus dissocier le tissu à l’aide d’un dissociator jusqu'à homogénéisé.
  4. Pour les tumeurs de mélanome, placer les tubes dans un dissociator et exécuter ce qui suit des cycles chacun une fois dans cet ordre : h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 et m_heart_02.01.
  5. Gratter 21 × 106 cellules dans 10 mL de milieu (~ 3 × 106 par modification des histones et entrée ; il peut être abaissé à 100 000 cellules par marque pour les populations rares) cultivés dans un tissu standard plat et à leur rassemblement dans un tube conique de 15 mL.
    Note : Le support utilisé pour la lignée de cellules de mélanome représentant WM115 est DMEM additionné de 10 % de sérum de veau fœtal et de 5 % la pénicilline/streptomycine.
  6. Crosslink les tissus/cellules en utilisant une concentration de 1 % de formaldéhyde final en ajoutant 200 µL de 16 % de formaldéhyde par 3 mL HBBS pour tissu (ou 3 mL de milieu pour les cellules). Agiter le mélange à 10 tr/min en utilisant un mélangeur pendant exactement 10 minutes à 37 ° C.
    ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et doit être manipulé dans une hotte de laboratoire appropriées.
  7. Ajouter 200 µL de glycine de 2,0 M / 3 mL d’échantillon et continuer à trembler à 10 tr/min pendant 5 min à 37 ° C.
    NOTE : Glycine agit comme un piège. Font la solution de glycine frais chaque mois comme le pf pH que la solution tend au fil du temps.
  8. Faites tourner les échantillons à 934 x g pendant 5 min à 4 ° C à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Retirez le surnageant, ajouter 5 mL de PBS froid glace, centrifuger les échantillons à nouveau à 934 x g et éliminer le surnageant.
  9. Flash gel le culot et conserver à-80 ° C pour un traitement ultérieur.

3. tissu lyse, Sonication et préparation d’anticorps

  1. Dissoudre 1 comprimé d’inhibiteur de protéase pour 10 mL de tampon de récolte de puce.
  2. Ajouter 300 µL de tampon de récolte de puce avec les inhibiteurs de la protéase par 50 mg de tissu et laisser 30 min de lyse sur la glace.
    NOTE : Ajouter 300 µL de tampon de récolte de puce avec les inhibiteurs de la protéase par 1 X 107 de lignées de cellules de mélanome WM115.
  3. Alors que les cellules sont ensuite, allumez le le bain d’eau disruptor et système de refroidissement associé et laisser la température atteindre 4 ° C. Placer les tubes de sonicateur dans le bain d’eau disruptor et ultrasons les tissus mélanome pendant des cycles de 60 à 30 s sur et 30 s pour obtenir des fragments de la chromatine de ~ 200-600 paires de bases (PB).
    NOTE : Temps de Sonication peut différer entre le type de tissu et doit être ajustée en conséquence. C’est une étape cruciale et doit être optimisée dans une expérience pilote avant de passer à l’immunoprécipitation.
  4. Au cours de la sonication, laver 20 µL de billes magnétiques de protéine G par anticorps par exemple trois fois avec 1000 µL de tampon de liaison/blocage (PBS + 0,1 % de TWEEN-20 + 0,2 % de BSA).
  5. Pour environ 8 mg de tissu de mélanome, incuber 3 µg de chaque anticorps histone dans 100 µL de liaison / bloquant un tampon pendant 2 h à 4 ° C avec rotation à l’aide d’un revolver de tube. 12 échantillons pour un anticorps du singulier contenant 240 µL de perles, 36 µg d’anticorps et 1200 µL de tampon de liaison/blocage.
    Remarque : Pour 3 × 106 cellules, utilisez 5 µg de chaque anticorps et 30 µL de billes magnétiques G de protéine par anticorps. Anticorps et perles de protéines-G devraient être réglées si différente quantité de tissu est utilisée. Ce protocole illustre l’immunoprécipitation des conditions pour les modifications d’histone six décrit (Table des matières), cependant, les concentrations d’anticorps doivent être optimisées pour les autres modifications et les facteurs de transcription.
  6. Pour déterminer la taille du fragment, retirer 20 µL de solution de chromatine sonciated et ajouter un tampon d’élution, mélange principal (température ambiante) contenant 44 µL d’élution directe tampon, de 1 µL de RNase (20mg/mL) et 5 µL de protéinase K (20mg/mL) par échantillon. Incuber les échantillons dans un thermocycleur PCR pendant au moins 2 h à 50 ° C. Purifier l’échantillon à l’aide d’un kit de purification de PCR suivant les instructions du fabricant.
  7. S’assurer que la chromatine est suffisamment cisaillée en déterminant la taille de fragment à l’aide d’un instrument d’électrophorèse ADN haute sensibilité avant de passer à l’étape 3.6. Allumez l’appareil d’électrophorèse.
  8. Charger 2 µL de réactif de tampon haute sensibilité dans chaque puits d’une bande de tube optique 8 puits. Charger 2 µL de l’échelle de sensibilité élevée dans le premier bien et 2 µL d’échantillons purifiés dans les puits restants.
  9. Placer des bouchons de tube optique sur tube stips et vortex les échantillons à 2000 tr/mn pendant 1 min. ouvrir le couvercle et insérer une nouvelle bande d’écran de haute sensibilité et la boîte de chargement conseils. Retirer les couvercles de barrette et charger les échantillons en électrophorèse instrument.
  10. Ouvrez le logiciel d’analyse, mettre en évidence les treize premiers espaces sur le ruban de l’écran et appuyez sur l’onglet démarrer dans le coin inférieur droit. Des fragments de chromatine allant de ~ 200-1000 bp ne conviennent pas pour la puce.
  11. Transférer la solution aux ultrasons dans des tubes stériles et faire tourner les tubes à x 21 130 g à l’aide d’une centrifugeuse de table pendant 15 min à 4 ° C. Transférer le liquide surnageant dans de nouveaux tubes.
  12. Déterminer le volume total du liquide surnageant et supprimer 10 % de la solution totale pour le contrôle des entrées et conserver à 4 ° C.

4. immunoprécipitation de la chromatine

  1. Dissoudre 2 comprimés d’inhibiteur de protéase par 20 mL de tampon de dilution de puce.
  2. Après sonication diluer l’échantillon restant 5 fois à l’aide de tampon de dilution de puce pour apporter les niveaux SDS à 0,1 %. Diluer 270 µL de liquide surnageant restant avec 1080 µL de tampon de dilution de puce pour obtenir un volume total de 1350 µL.
  3. Fin de l’incubation des billes magnétiques de l’anticorps et la protéine G, placer le tube sur un aimant et éliminer le surnageant.
  4. Avec le tube, toujours assis sur l’aimant, laver les billes une fois en ajoutant 750 µL de tampon de dilution de puce avec des inhibiteurs de protéase.
    Remarque : Il est important de ne pas déranger les perles ou faire pivoter les tubes au cours de cette étape.
  5. Retirer la puce tampon de dilution laver et remettre en suspension les perles dans 240 µL la même puce de tampon de dilution. Aliquote 20 µL de billes dans 12 tubes distincts, dont chacun est utilisé pour un échantillon de tissu distinct.
  6. Aliquote le matériau traité aux ultrasons uniformément aux billes de protéine G avec des anticorps spécifiques et linge en utilisant un revolver tube pendant la nuit à 4 ° C.

5. lavage et inverse de réticulation des Complexes de protéines et l’ADN immunoprécipitée

  1. Le lendemain matin après réticulation inverse, transvaser la solution de protéine-anticorps dans une plaque à 96 puits et placer sur le support magnétique. Permettre les perles d’adhérer au moins 30 s et enlever le surnageant.
  2. Laver les billes 5 fois avec 150 µL de tampon de lavage RIPA glacé à l’aide d’une pipette multi-canaux. Au cours des étapes de lavage, ne pas pipeter les perles, mais déplacer l’aimant sans cesse de droite à gauche pour 30 s / cycle de lavage.
  3. Laver les échantillons deux fois avec 150 µL de tampon de lavage glacé RIPA-500.
  4. Laver les échantillons deux fois avec 150 µL de tampon de lavage glacé LiCl.
  5. Laver les échantillons une fois avec 150 µL de tampon de lavage TE glacé et enlever tampon TE immédiatement. Cette étape peut être omise pour les applications d’entrée faibles.
  6. Ajouter contrôle des entrées de l’étape 3,7 dans frais puits de la plaque à 96 puits contenant les échantillons d’ADN de la puce.
  7. Après les étapes de lavage, ajouter un élution tampon mélange principal (température ambiante) contenant 44 µL de tampon d’élution directe, 1 µL de RNase (20mg/mL) et 5 µL de protéinase K (20mg/mL) par échantillon ChIP et entrée de réticulation inverse.
  8. Incuber les échantillons à l’aide d’un thermocycleur PCR pendant 4 h à 37 ° C, 4 h à 50 ° C et 8-16 h à 65 ° C.

6. la purification et la Quantification de l’ADN précipité

  1. Le lendemain matin, place les échantillons retour sur l’aimant et le surnageant de transfert à une nouvelle plaque PCR 96 puits qui contient l’immunoprécipitée ADN.
  2. Ajouter 2,3 x perles paramagnétiques à solution (115 µL pour 50 µL de solution) et soigneusement la pipette et descendre 25 fois en utilisant une pipette multicanaux. La solution va devenir homogène si bien mélangé.
  3. Incuber la solution à température ambiante au large de l’aimant pour min. 4 Place les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant encore 4 min. jeter le surnageant.
  4. Tout en laissant les échantillons sur l’aimant, ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % (vol/vol) et incuber à température ambiante pendant 30 s sans déranger les perles.
  5. Enlever l’éthanol et répéter le lavage. Permettre les billes paramagnétiques à l’air sec sur l’aimant pendant 5 min.
    Remarque : Retirez tout l’éthanol après le deuxième lavage comme l’éthanol restant n’interférera avec purification.
  6. Enlever les échantillons de l’aimant et ajouter 30 µL de 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Mélanger en pipettant également 25 fois et incuber les échantillons à la température ambiante au large de l’aimant pendant 4 min.
  7. Replacez les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant un autre 4 min. transférer 20 µL de chaque échantillon d’une nouvelle plaque 96 puits, pour la préparation de la bibliothèque. Stocker le reste 10 µL de puce ADN en cas de problèmes potentiels avec la génération des bibliothèques.
  8. À ce stade, quantifier la puce ADN avant la préparation de la bibliothèque. La concentration d’ADN est mesurée avec les réactifs de l’ADN de haute sensibilité. Déterminer la granulométrie de l’ADN précipité à l’aide d’une procédure d’instrument haute sensibilité ADN électrophorégramme à étape 7.1.

7. Bibliothèque génération à l’aide de la trousse de préparation du bibliothèque d’ADN II Ultra NEBNext

  1. Générer des bibliothèques pour l’ordonnancement de la NGS en utilisant l’ADN bibliothèque préparation suivant le protocole recommandé par le fabricant. Toutes les réactions sont effectuées dans les plaques à 96 puits et des incubations sont effectuées dans un thermocycleur PCR avec la couvercle température réglée > 100 ° C et le volume réglé à 50 µL.
  2. Pour les index, Oligos Multiplex pour la plate-forme NGS sont utilisés. Effectuer un total de 10 x cycles d’amplification par PCR en utilisant les paramètres suivants : une dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s, dénaturation à 98 ° C pendant 10 s, recuit/extension à 65 ° C pendant 30 s (10 x cycles), la dernière extension de 65 ° C pendant 5 min et maintenez à 4° C.
    NOTE : Le tableau 1 contient les amorces utilisées pour l’amplification par PCR.
  3. Après amplification par PCR, supprimer les échantillons et porter le volume total à 100 µL avec de l’eau exempte de nucléase. Effectuez sélection taille paramagnétique recto-verso (0.55x/0.8x) en premier ajout 55 µL de perles et de la composition de pipetage 25 fois. Incuber les échantillons à la température ambiante au large de l’aimant pendant 4 min.
  4. Replacez les échantillons sur un aimant et incuber à température ambiante pendant 4 min. Cette étape permet de conserver les grands fragments sur les perles qui ne conviennent pas pour le séquençage.
  5. Transférer le liquide surnageant dans une nouvelle plaque PCR 96 puits. Ne pas jeter le surnageant car il contient l’ADN partiellement purifié.
  6. Ajouter un autre 25 µL de billes paramagnétiques et mélanger en pipettant également 25 fois et incuber à température ambiante au large de l’aimant pendant 4 min.
  7. Replacez les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant 4 min et éliminer le surnageant. Cette étape permet de conserver des fragments de ~ 200 à 600 bp qui sera utilisé pour finalisé des bibliothèques.
  8. Tout en laissant les échantillons sur l’aimant, ajouter 150 µL d’éthanol à 70 % (v/v) et laisser incuber pendant 30 s sans déranger les perles (ne bouge pas alors que sur l’aimant). Enlever l’éthanol et répéter le lavage une seconde fois.
  9. Laisser que les billes paramagnétiques à air sec sur l’aimant pendant 5 min. Retirez éthanol tous après le deuxième lavage comme éthanol restant n’interférera avec purification.
  10. Enlever les échantillons de l’aimant et ajouter 25 µL de 10 mM Tris-Cl pH 8.0. Mélanger en pipettant également 25 fois et incuber à température ambiante au large de l’aimant pour min. 4 Place les échantillons sur l’aimant et incuber à température ambiante pendant 4 min.
  11. Bibliothèques à l’aide d’un instrument d’électrophorèse ADN haute sensibilité avant multiplexage pour assurer les tailles ne conviennent pas pour le séquençage de l’optométriste. Rempli de bibliothèques varient entre 200-600 bp et sont dépourvues de tous les dimères d’amorce.
    Remarque : Si nécessaire, un autre 0,7 x purification perle paramagnétique est exécutée pour supprimer les dimères d’amorce indésirables qui se trouvent à environ 130 bp.
  12. Piscine l’ADN quantifié issu des amorces d’index unique selon la concentration. Pour un bassin contenant six échantillons avec des concentrations comprises entre 1 ng/µL et 6ng/µL, la distribution est 15 µL de l’échantillon le plus bas et 2,5 µL de l’échantillon plus élevé. Ceci est fait pour assurer la lecture chefs d’accusation seront distribués uniformément sur chaque voie de la cellule de flux.

8. système de données du ChIP-seq de post-traitement

  1. Un pipeline basé sur snakemake38,39 est utilisé pour les étapes de processus de toutes les caractéristiques suivantes en une seule commande. Ce qui est important, chacune de ces étapes sont discutés individuellement avec les commandes associées.
  2. Déterminer la qualité des lectures de séquençage fastq brut à l’aide de FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) : Ouvrez terminal unix et changez de répertoire (cd) dans le dossier contenant les fichiers raw fastq pour chacune des six modifications histone. Dans le type de terminal unix, fastqc *fastq.gz et appuyez sur [retour]. Cela se déroulera les mesures de contrôle de qualité sur tous les fichiers fastq dans le dossier.
  3. Aligner les lectures de qualité contre le génome de référence et supprimer les doublons avant compression de fichiers de bam. Cette opération est effectuée à l’aide de noeud papillon version 1.1.239, SAMBLASTER version 0.1.2140et SAMTOOLS version 1.3.141: dans l’unix type de terminal, noeud papillon -m 1 - n 1--meilleur--strates -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools Découvre -Sb - > histone1.bam, puis appuyez sur [retour].
    Remarque : path_to indique le dossier qui contient l’assembly de génome humain hg19. Cela changera selon l’organisme d’intérêt.
  4. Trier les fichiers de bam à l’aide de SAMTOOLS avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, samtools Trier 2G histone1.bam -m-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted et appuyez sur [retour].
  5. Indexer les fichiers de bam à l’aide de SAMTOOLS avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai de l’index et appuyez sur [entrée].
  6. Déterminer les lectures unique mappés et non alignés à l’aide de SAMTOOLS flagstat avec la commande suivante : type de terminal unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam et appuyez sur [retour].
  7. Normaliser les fichiers bam par les chefs d’accusation lus en procédant à un échantillonnage aléatoire avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, sambamba Découvre bam -f-sous-échantillonnage-graine = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | samtools Trier -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam et appuyez sur [retour].
  8. Indexer les fichiers de bam à l’aide de SAMTOOLS avec la commande suivante : dans le type de terminal unix, samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai de l’index et appuyez sur [entrée].
  9. Pour visualiser la ChIP-seq bibliothèques sur un navigateur de génome (i.e. UCSC ou IGV), générer des fichiers de bigwig utilisant deepTools version 2.4.040 en redimensionnant les fichiers bam de lectures par kilobases par million (RPKM). Cela peut être effectuée en utilisant les commandes suivantes :
    1. Pour les fichiers de bigwig standard : dans le type de terminal unix, bamCoverage -b histone1. downsample.Sorted.BAM--normalizeUsingRPKM binSize--30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw, puis appuyez sur RETURN].
    2. Pour l’entrée soustraite fichiers bigwig : dans le type de terminal unix, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--ratio soustraire binSize--30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW, puis appuyez sur [retour].
  10. Identifier l’enrichissement ChIP-seq signal sur fond de « Input » en utilisant l’analyse de modèle basé de ChIP-seq (Mac) version 1.4.225,26 et version 2.1.0. Utilisez macs1 pour facteurs de « point source » H3K4me3, H3K4me1 et H3K27ac et macs2 de facteurs « large source » H3K79me2, H3K27me3 et H3K9me3. Cette opération est effectuée en utilisant les commandes suivantes :
    1. Pour une Source ponctuelle : Dans le type terminal unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--keep-dup tous histone1.file - n et appuyez sur [retour].
    2. Pour large Source : Dans le type de terminal unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f 6-BAM -p 1e--large--large coupure 1e-6--keep-dup tous--nomodel histone1.file - n et appuyez sur [retour].
  11. Utilisation ChromHMM24 à identifier des profils de chromatine combinatoire État basé sur les modifications d’histone étudiées en utilisant les commandes suivantes :
    1. Dans le terminal unix, tapez cd/path_to/ChromHMM_folder et appuyez sur [entrée].
    2. Une fois dans le type de répertoire ChromHMM, java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output et appuyez sur [entrée].
    3. Type, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 et appuyez sur [entrée].

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Résultats

Ce protocole permet l’immunoprécipitation de tissus tumoraux congelés et des lignées de cellules qui peuvent être effectuées sur des dizaines d’échantillons en parallèle à l’aide d’une méthode de haut-débit (Figure 1 a). Des fragments de chromatine devraient se situer entre ~ 200-1000 bits/s pour l’immunoprécipitation optimale. Nous avons noté que le temps nécessaire pour atteindre la même longueur de cisaillement est ...

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Discussion

Ce protocole décrit un module complet et détaillé de ChIP-seq haut débit pour la cartographie du génome des États de la chromatine dans les lignées de cellules et tissus tumoraux humains. Dans n’importe quel protocole de ChIP-seq, une des étapes plus importantes est la spécificité de l’anticorps. Ici, cette méthode illustre l’immunoprécipitation des conditions pour les décrit six modifications d’histone, qui sont de qualité ChIP et ont été déjà validés dans notre et d’autres laboratoires

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Déclarations de divulgation

Auteurs ne déclarent aucun conflit.

Remerciements

Nous remercions Marcus Coyle, Curtis Gumbs, noyau SMF au MDACC pour le soutien de séquençage. Le travail décrit dans cet article a été soutenu par des subventions de la subvention du NIH (CA016672) à base de SMF et NCI récompenses (1K99CA160578 et R00CA160578) K. R.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

Références

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178(2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033(2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086(2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

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