Fluorescence de cellule unique résolution vivre Imaging of Drosophila horloges circadiennes dans cerveau larvaire Culture

Résumé

Le but du présent protocole est d’établir la culture ex vivo Drosophila cerveau larvaire optimisée pour surveiller des rythmes circadiens moléculaires avec imagerie Time-lapse à long terme de fluorescence. On discute également l’application de cette méthode pour les essais pharmacologiques.

Résumé

Le circuit de pacemaker circadien orchestre rythmiques sorties comportementales et physiologiques, en coordination avec les signaux environnementaux, tels que les cycles jour/nuit. L’horloge moléculaire au sein de chaque neurone stimulateur génère les rythmes circadiens dans l’expression des gènes, qui sous-tendent les fonctions neuronales rythmiques essentielles au fonctionnement du circuit. Étude des propriétés des oscillateurs moléculaires individuelles dans les différentes sous-classes de neurones pacemaker et leur interaction avec la signalisation neuronale permet de mieux comprendre le circuit de pacemaker circadien. Ici, nous présentons une approche de Time-lapse microscopie fluorescente mis au point pour surveiller l’horloge moléculaire dans les neurones d’horloge de cultivées cerveau larve de drosophile . Cette méthode permet l’enregistrement de plusieurs jour des rythmes de reporters circadiennes fluorescents génétiquement encodées à cellule unique résolution. Cette configuration peut être associée à des manipulations pharmacologiques pour analyser attentivement la réponse en temps réel de l’horloge moléculaire de composés. Au-delà des rythmes circadiens, cette méthode polyvalente en combinaison avec les techniques génétiques puissantes Drosophila offre la possibilité d’étudier différents processus neurones ou moléculaires dans le tissu cérébral direct.

Introduction

Horloges circadiennes aident les organismes à s’adapter aux changements environnementaux périodiques générées par la rotation de 24h de la terre. Les boucles de rétroaction transcriptionnel traductionnel contrefil communément sous-tendent la machinerie moléculaire des horloges circadiennes ensemble espèce¹. Le circuit de pacemaker circadien composé horloge contenant des neurones intègre time-of-day information véhiculée par les signaux environnementaux, tels que la lumière/obscurité (LD) et les cycles de température, d’orchestrer les rythmes d’une pléthore de quotidien physiologique et les processus comportementaux^2,3. La coordination des rythmes moléculaires avec neuronales entrées et sorties est cruciale pour le fonctionnement du circuit circadien, mais reste que partiellement compris.

Chez la drosophile, au cœur de l’horloge moléculaire, l’hétérodimère/CYCLE d’horloge (CLK/CYC) active la transcription de la période (par) et intemporels (tim). PER et TIM forment un complexe et entrer dans le noyau, où ils inhibent l’activité transcriptionnelle de CLK/CYC et, par conséquent, leur propre transcription. Règlement post-transcriptionnelle et post-traductionnelles entraînent des retards entre CLK/CYC-mediated transcription et de la répression par p. / TIM, assurer la génération de circa oscillations moléculaires 24 h^1,3,4 . Environ 150 neurones contenant ces horloges moléculaires forme un circuit de contrôle circadien comportement d’adulte vole⁵. Un beaucoup plus simple et entièrement fonctionnelles circadiens circuit composé de 3 groupes de neurones de l’horloge - 5 neurones latérale ventrale (LNvs ; 4 LNvs PDF-positif et un négatif PDF LNv, voir ci-dessous), 2 dorsales neurone 1 s (DN1s) et 2 dorsales neurone 2 s (DN2s) - est présent dans les larves cerveau^6,7.

Le circuit circadien larvaire simple offre un excellent modèle pour étudier les interactions entre la communication inter neuronale et l’horloge moléculaire. À l’aide de notre reporter fluorescent nouvellement mis au point par-TDT, qui imite les niveaux de protéine et sa localisation subcellulaire, nous avons cherché à caractériser la dynamique de la mécanique moléculaire en sous-groupes de neurone horloge différentes dans le circuit circadien larvaire ⁸. en outre, connaissant le rôle essentiel du facteur de dispersion de pigment neuropeptide (PDF) produit par 4 LNvs dans la régulation des rythmes circadiens au niveau neuronal^9,10,11, nous avons voulu examiner le direct effet de PDF sur les horloges moléculaires. À cette fin, nous avons développé une méthode pour contrôler l’expression des gènes circadiens rythmes dans cerveau larvaire explant sur plusieurs jours en Time-lapse microscopie confocale. Le protocole a été également adapté pour les essais pharmacologiques tester l’effet de PDF ou d’autres composés sur le niveau de p.-TDT. Ainsi, l’adaptation se compose de vulgariser la culture d’explants de cerveau à la demande de drogue, d’augmenter la résolution temporelle et d’imagerie pour une durée plus courte.

Ex vivo culture de Drosophila cerveau des différentes étapes du développement ont été établies auparavant^{12,13,14,15,16,17 ,},¹⁸. Considérant que ces protocoles ont été utilisés pour l’imagerie des différents phénomènes biologiques, certains d'entre eux ne sont pas compatibles avec la formation image à résolution unicellulaire ou ne supportent pas la culture pendant plus de quelques heures. Des méthodes alternatives pour effectuer une imagerie live à long terme des neurones circadiennes chez la drosophile incluent l’imagerie bioluminescence des rythmes moléculaires^19,20,21 et imagerie de fluorescence de indicateur de calcium avec nappe de lumière microscopie^22,23. Bien que l’imagerie de bioluminescence peut atteindre une résolution temporelle plus élevée et la microscopie de nappe de lumière peut être adaptable pour l’imagerie in vivo , ils sont limités à la résolution spatiale et exigent des systèmes spécialisés de microscope.

La méthode décrite ici est adaptée pour visualiser les signaux fluorescents dans la culture de cerveau entier à cellule unique résolution sur plusieurs jours. Cette méthode facile et polyvalente pourrait être adaptée à cervelle de mouche adulte image cultivée et d’expériences pharmacologiques d’étudier de nombreux problèmes différents en neurobiologie de la drosophile .

Protocole

1. préparation des Solutions mères sous une hotte de Culture

1. Préparer 400 mL 1 x milieu actif Schneider (SAM) optimisé pour ex vivo culture des larves cerveaux (modifié d’après référence^24,25) (tableau 1). Aliquote de 5 mL et flash congélation dans l’azote liquide (LN₂), conserver à - 80 ° C.
2. Préparer 1 x disséquant une Solution Saline (DSS) en diluant 10 x solution mère (adapté de référence²⁶) (tableau 2).
3. Fibrinogène aliquote à 10 mg et conserver à 4 ° C pour un usage unique.
   ATTENTION : Peser fibrinogène sous flux laminaire, porter des gants, car il est nocif.
4. Préparer la solution mère de thrombine dans SAM (1500 NIH unité/mg) et de l’aliquote à 10 µL, flash geler dans LN₂ et conserver à-80 ° C.
   ATTENTION : Porter des gants lorsque vous manipulez la thrombine, car il est nocif.
5. Solution mère aliquote de 100 x la pénicilline-streptomycine. Conserver à-20 ° C.
6. Couper des cercles de membrane de polytétrafluoroéthylène (PTFE) (voir la Table des matières) à la taille qui correspond à l’intérieur d’un plat de fond de verre. Rincez-les dans 70 % EtOH et puis autoclavables dH₂O. stériliser et sec sous hotte à flux laminaire avec UV. Garder dans une boîte de Petri stérile. Usage unique.
   NOTE : PTFE est une membrane souple poreuse qui permet les échanges gazeux et empêche l’évaporation pendant l’enregistrement à long terme moyen.

2. Time-lapse microscopie Setup

Remarque : La configuration suivante est pour un microscope confocal de tandem scanner inversé (voir Table des matières) équipée d’un scanner résonant (8 000 Hz). Le système comprend un détecteur photo-multiplicateur très sensible, qui, avec le scanner à résonant, empêche la phototoxicité et photoblanchiment. Température et l’humidité sont contrôlées dans une chambre environnementale de microscope (voir Table des matières) qui couvre la majeure partie du microscope.

1. Placer une chambre étape haut humidité.
2. Tourner sur les contrôleurs de température et d’humidité s’équilibrer la chambre microscope à 25 ° C et 80 % d’humidité.
3. Pour réaliser des expériences dans l’obscurité totale (DD), couvrir la chambre environnementale microscope avec un tissu opaque (à moins que la chambre de microscope est faite d’un matériau opaque).
4. Si vous utilisez un objectif à immersion dans l’eau, un distributeur de Micro d’Immersion eau sur le dessus de l’objectif du poste et programmer un protocole avec le logiciel de contrôleur d’objectif Autoimmersion pour puiser l’eau à un rythme constant pendant la formation image Time-lapse.
   Remarque : Objectifs immersion dans l’eau ainsi qu’un distributeur d’eau ou sec lentille de l’objectif sont recommandés pour l’imagerie live à long terme, comme autre type de support d’immersion se dessécher.
5. Placez un boîte de Pétri titulaire sur la scène, à l’intérieur de la chambre de l’humidité.
6. Lancez le logiciel de microscope, puis choisissez le mode de scanner résonnant dans la première boîte de dialogue. Sélectionnez OK pour initialiser la scène lorsque vous y êtes invité. Allez à l’onglet Configuration et à la configuration matérielle pour allumer les lignes laser pertinentes.
7. Aller à l’onglet Acquire, à panneau de XY pour sélectionner le mode bidirectionnel et définir image paramètres d’acquisition.
   Remarque : L’installation d’imagerie décrite présentée ici (Figure 2, Figure 3 et film 1) est optimisée afin d’observer l’expression circadienne de reporters fluorescents spécifiques. Les paramètres suivants ont été choisis pour mieux s’adapter à notre cahier des charges : 40 X 8 X ligne moyenne, avec résolution d’image de 512 × 512, objectif à immersion d’eau. Pour l’imagerie multicolore, acquisition d’images séquentielles est requis lorsque la longueur d’onde d’émission d’un fluorophore et la longueur d’onde d’excitation de chevauchement un autre (ici, longueurs d’onde d’émission de la protéine fluorescente jaune (YFP) et de la tomate excitation chevauchement). Choisissez le mode séquentiel « in between pile » comme c’est le plus rapide et le mouvement des neurones de l’horloge est négligeable lors de l’acquisition d’un Z-stack. Paramètres de microscopie devraient être adaptées en fonction de l’objectif de chaque expérience.

3. installation de Culture d’explants cerveau larvaire

Remarque : Toute la procédure de dissection à l’incorporation des explants de cerveau prend environ 30 min.

1. Préparation des réactifs sous une hotte de culture.
   1. Décongeler une partie aliquote de la thrombine et conserver à température ambiante jusqu'à l’incorporation étape (étape 3.3). Usage unique.
   2. Dégeler rapidement une partie aliquote de SAM à 37 ° C et continuer sur la glace pour un usage unique.
   3. Ajouter SAM à une portion de 10 mg de fibrinogène à 10 mg/mL, effleurez doucement et incuber à 37 ° C pendant au moins 30 minutes et au cours de l’étape d’encastrement (étape 3.3). Usage unique.
      Remarque : Incuber pas la solution de fibrinogène de plus de 2 h car il commence à se polymériser.
   4. Décongeler une partie aliquote de 100 actions x pénicilline-streptomycine. Préparation de 2,5 mL de SAM contenant 1 x pénicilline-streptomycine (SAM/antibiotiques). Conserver à température ambiante.
      Remarque : Stock de magasin le reste x 100 pénicilline-streptomycine à 4 ° C jusqu'à 1 mois.
   5. Préparer une partie aliquote de 500 µL de la SAM restante. Rester sur la glace.
   6. Pour l’imagerie à long terme, graissez vide stérilisés à l’autoclave à la partie plastique de la partie inférieure du verre plat bas (Figure 1 a) et stériliser sous hotte à flux laminaire avec UV.
2. Dissection du cordon nerveux du système nerveux central et ventrale.
   1. Nettoyer la pince et 2 x trois-puits verre plats de dissection avec 70 % EtOH. Verser 400 µL du Mas de 4 puits et 400 µL de SAM dans un puits. Rester sur la glace.
   2. Évider les mouche milieu contenant des larves et choisissez non-errance 3ème stade larvaire (L3) avec une pince. Les rincer successivement dans 2 puits remplis de DSS. Gardez-les dans le 3e puits remplis de DSS sur glace qui anesthetizes les larves.
      NOTE : L3 dure environ 2 jours à 25 ° C. Pour observer le cerveau en temps physiologiquement pertinents, que nous avons choisi d’utiliser des larves L3 non-errance. Autres sous-groupes des neurones de l’horloge, comme l-LNvs et DN3s, commencent à se former à l’errance stade L3, mais ils ne sont pas nécessairement cyclisme pourtant (données non présentées). Par conséquent, bien qu’il soit possible d’image cyclisme horloge neurones à ce stade (données non présentées), il est important de soigneusement distinguer les neurones déjà fonctionnel horloge larvaire des pays en développement pour l’analyse des données. Non-errance L3 apparaissent environ 4 à 4,5 jours après la ponte à 25 ° C. Pour utiliser ce protocole pour l’étude des rythmes circadiens, synchroniser (monter) les larves en développement en 12 h/12 h LD cycles à 25 ° C pendant 3 jours avant la collecte des larves L3.
   3. Disséquer les cerveaux larvaire avec une pince fine dans le 4e puits remplis de DSS, qui n’a pas été utilisé pour le rinçage des larves, à l’aide de la méthode inside-out²⁷.
      1. En bref, couper la larve en deux, doucement pincer les crochets de la bouche avec une paire de pinces et enrouler à l’envers de la paroi du corps à l’aide de l’autre paire de pinces, exposant ainsi le cerveau. Libérer le cerveau en découpant de la trachée et les nerfs qui attachent au reste du corps.
      2. Aspirer le cerveau dans environ 3 µL du Mas avec une pipette de 20 µL (préalablement rincée avec DSS) et verser dans le puits remplis de SAM. Répétez la procédure pour cerveaux jusqu'à 7.
         Remarque : La Dissection doit être effectuée sur une surface froide pour garder les larves anesthésiés et le cerveau réfrigérés. Par exemple, placer le plat de dissection sur un bloc réfrigérant raccordé à une pompe pour faire circuler l’eau réfrigérée à glace. La dissection procédure prend environ 30 s par le cerveau. Il est important de garder l’oeil/antennaire disques imaginaux attachés pour le cerveau et le cordon nerveux ventral intact. Arrachant ces pièces risque d’endommager le cerveau et réduisent la qualité de la culture. Aussi, évitez d’exposer le cerveau à l’air. Avant d’aspirer le premier cerveau, pipette de haut en bas de la DSS contenant des parties des larves disséquées, telle qu’elle empêche le cerveau de coller à la paroi de la pointe.
3. L’incorporation des explants de cerveau dans une matrice 3D et montage (~ 20 min).
   1. Plonger un cerveau disséqué dans la solution de travail du fibrinogène (concentration finale de fibrinogène ~3.3 mg/mL, 10,5 µL par cerveau) comme suit :
   2. Aspirer 3,5 µL de SAM/antibiotiques (avec le même embout utilisé au point 3.2.3). Aspirer un cerveau disséqué de la dissection dans l’embout de la pipette même sans le support SAM/antibiotiques dans la pointe de la distribution.
   3. Diluer le cerveau avec le support sur le couvercle d’une boîte de Petri stérile. Ajouter un autre 3,5 µL de SAM/antibiotiques et 3,5 µL de solution de 10 mg/mL de fibrinogène/SAM tiède sur la goutte contenant le cerveau. Mélanger doucement la solution autour du cerveau en pipettant également, avec une pointe de pipette de 20 µL.
      Remarque : À l’aide d’une pipette au lieu des pinces dans cette étape évite mettant l’accent sur le cerveau.
   4. Prenez 2 µL de la solution de travail de fibrinogène dans le menu déroulant et appliquez-le sur la lamelle du verre plat bas comme un petit cercle. Ajouter 0,8 µL de thrombine et mélanger très rapidement avec un embout de la pipette. Le fibrinogène est transformé en fibrine et commence à se polymériser.
   5. Prendre le cerveau qui se trouve dans le fibrinogène solution (étape 3.3.1) entre une paire de pinces de travail, puis positionnez-le sur la matrice, une fois qu’une matrice de fibrine de blanche est visible. Orientez le côté antérieur du cerveau vers le bas (pour l’imagerie des neurones de l’horloge). Poussez-le vers le bas aussi près que possible de la lamelle couvre-objet. Caillot de fibrine est constitué de couches de fibrine. Choisir une seule couche et le plier sur le dessus du cerveau avec des mouvements douces et petits sans détacher la matrice.
      1. Répéter 2 à 3 fois de différentes parties du caillot pour stabiliser le cerveau.
         Remarque : Lors de la manipulation du cerveau avec une pince, veillez à ne pas à sécher ou imposer un stress physique.
   6. Ajouter 20 µL de SAM/antibiotiques sur le dessus du cerveau intégré pour arrêter l’action de la thrombine.
   7. Répétez la procédure pour monter le cerveau restant. Il est possible d’incorporer jusqu'à 5 à 6 cerveaux sur un plat de fond de verre.
   8. Pour l’imagerie live à long terme, ajoute 600 µL de SAM/antibiotiques dans le puits intérieur (la partie en verre). Placer une membrane PTFE prédécoupée sur le dessus de la moyenne et collez-la à la graisse sous vide appliquée sur la partie en plastique du fond (3.1.5) (Figure 1 a).
   9. Pour les tests pharmacologiques, remplir le plat avec 2 mL de SAM/antibiotiques (Figure 1 b).
      Remarque : Il est très important éviter l’évaporation du milieu, comme l’osmolarité du milieu est essentielle à la viabilité des neurones. Par conséquent, pour des expériences d’imagerie à long terme, il est nécessaire sceller la boîte de Petri avec membrane PTFE. Considérant que, pour des expériences de courte durée, membrane d’étanchéité n’est pas nécessaire tant que le plat est rempli de 2 mL de milieu et contrôlé dans une chambre humidifiée.

4. Acquisition d’images Time-lapse

1. Placer le plat de fond de verre sur le titulaire de la boîte de Pétri à l’intérieur de la chambre étape-haut humidité.
2. Aller au panneau de z-pile dans l’onglet Acquire et définir les étapes du profilé en z du logiciel microscope (µm 2 × 40 ~ dans les expériences illustré à la Figure 2 et Figure 3et film 1). Définir le début d’un z-stack au plan plus éloigné de la lamelle couvre-objet et la fin à la surface de l’explant de cerveau, à proximité de la lamelle. Bien que les mouvements du cerveau sont négligeables, ajouter des profils en z supplémentaires au début et la fin de la z-pile.
3. Allez à marquer & trouver d’acquisition d’images de multi-position de panneau et mise en place. Avec un objectif X 40, 1 hémisphère du cerveau peut être capturé dans un champ de vision
4. Accédez au panneau du mode d’Acquisition et sélectionnez xyzt (z-pile en Time-lapse). Aller au panneau de temps Acquisition et définissez les paramètres de fréquence et l’intervalle de temps préféré.
   NOTE : Acquisition d’images de Time-lapse avec la fréquence souhaitée. Notez que l’imagerie live à long terme (24-72 h) avec intervalle de laps de temps inférieur à 2 h tend à résultats en moins de neurones cyclisme, probablement parce qu’elles réduisent la viabilité des neurones. Le volume de données se développe comme le taux d’augmentation d’acquisition d’image, qui rend le stockage et l’analyse des données plus difficile.

5. traitement des Explants de cerveau avec Short-term Live Imaging

Remarque : La procédure suivante est essentiellement la même que celle pour l’imagerie à long terme, mais ne nécessite pas une membrane en PTFE. Pour éviter d’exposer le cerveau pour la lumière bleue lorsque le produit chimique est ajouté à la culture, le microscope devrait figurer dans la chambre noire avec lumière rouge.

1. Aller au panneau de temps Acquisition et définissez l’intervalle de temps souhaité et le nombre de scan pour obtenir les données de base avant la demande de drogue. Démarrer le Scan.
2. Après la ligne de base l’analyse est terminée, soulevez la tête de balayage du système microscope. Retirez le couvercle du contrôleur humidité étape-haut et très soigneusement retirer le couvercle du plat verre bas sans le déplacer.
3. Retirer le montant de milieu de culture approprié si nécessaire. Ajoutez la solution expérimentale dans le milieu et, avec soin et très doucement, mélanger avec une pipette Pasteur stérile sans toucher les explants de cerveau.
   Remarque : Pour une application bain de PDF, utiliser 2 solution-mère PDF µM (dans 10 % DMSO).
4. Remplacer les couvercles du verre fond plat et la chambre humide et la tête de balayage. Si vous utilisez, repositionner le tissu opaque noir autour de la chambre de microscope.
5. Vérifiez que les cerveaux sont à leur position d’origine en mode direct. Ajuster si nécessaire.
6. Aller au panneau de temps Acquisition et définissez l’intervalle de temps souhaité et le nombre de scan. Démarrer le Scan.
   NOTE : Ici nous avons testé le Time-lapse images acquises chaque heure pendant 10 h.

Résultats

Nous démontrons ici les résultats représentatifs de l’enregistrement à long terme d’un reporter fluorescent circadiens dans ex vivo la culture larvaire de cerveau et les résultats d’imagerie en live d’application bain PDF sur l’expression du Rapporteur.

Les larves L3 non-errance exprimant la journaliste horloge moléculaire p.-TDT et SAMU-mCD8::YFP conduite par un chauffeur de neurone horloge Clk 856-...

Discussion

Ici, nous avons décrit la méthode pour à long terme fluorecence Time-lapse d’élevage larvaire cerveaux. Le succès de ce type d’expériences dépend de plusieurs facteurs, tels que la santé de la culture, procédé d’immobilisation de l’explant de cerveau, l’intensité de la fluorescence et la ratio signal-bruit de la journaliste, temporelle et la résolution spatiale, et accessibilité de l’explant. Ces facteurs peuvent s’exclure mutuellement. Par exemple, augmentation de fréquence de Time-lapse affe...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T0167
Succinic acid	Sigma-Aldrich	S9512
Fumaric acid	Sigma-Aldrich	F8509
α-Ketoglutaric acid	Sigma-Aldrich	K1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Fibrinogen from bovine plasma	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T9549	CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Vaccum grease	Sigma-Aldrich	18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes	fisherscientific	08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm	Millipore	SCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) film	Dupont	200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLGV033RS
Three-well glass dissection dish	Any company
Fine forceps, size 5, Dumont	Fine Science Tools	11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors	Leica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamber	Life Imaging Services	The CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controller	Life Imaging Services	custom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software	Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift plugin	ImageJ software
10x iterative deconvolution	AutoQuant and Imaris software