Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Résumé

Des tissus animaux et végétaux sont composée de populations distinctes de cellules. Ces cellules interagissent au fil du temps pour bâtir et maintenir les tissus et peuvent provoquer des maladies lorsque perturbés. Les scientifiques ont développé des techniques intelligents afin d’étudier les caractéristiques et la dynamique naturelle de ces cellules dans les tissus intacts en exprimant des protéines fluorescentes en sous-ensembles de cellules. Toutefois, à certains moments, expériences nécessitent plus sélectionnée visualisation des cellules dans les tissus, parfois à la manière monocellulaires ou population-de-cells. Pour atteindre cet objectif et visualiser les cellules individuelles au sein d’une population de cellules, les scientifiques ont utilisé unicellulaires photoconversion de protéines fluorescentes. Pour illustrer cette technique, nous montrons ici comment diriger la lumière UV à une cellule exprimant l’Eos d’intérêt dans un état intact, vit le poisson-zèbre. Nous avons ensuite image ces cellules de Eos⁺ photoconverted 24 h plus tard pour déterminer comment ils ont changé dans le tissu. Nous décrivons deux techniques : simple cellule photoconversion et photoconversions des populations de cellules. Ces techniques permettent de visualiser les interactions cellule-cellule, cellule-destin et différenciation et les migrations cellulaires, ce qui en fait une technique qui s’applique à nombreuses questions biologiques.

Introduction

Plusieurs cellules distinctes interagissent pour construire et entretenir des tissus animaux et végétaux complexes. Ces cellules sont souvent intercalés et difficiles à distinguer des voisins au niveau unicellulaire sans microscopie haute résolution qui nécessitent la fixation du tissu. Cependant, pour comprendre comment ces forment les tissus, sont maintenus et deviennent malades, il a été essentiel pour étudier comment simple cellules dans les tissus sont en interaction avec le temps. Idéalement, ces expériences exigent l’étiquetage des cellules individuelles au sein d’un tissu, d’une manière non invasive sans l’exigence de fixation. Les scientifiques ont maintenant développé de nombreuses techniques pour accomplir cette tâche^1,2,3,4.

La découverte et la mise en œuvre de la protéine fluorescente méduse verte (GFP) était une approche passionnante qui a permis pour l’étiquetage des cellules distinctes dans un tissu environnement¹. À l’aide de promoteurs spécifiques des cellules, il est possible de sélectionner génétiquement un sous-ensemble de cellules qui sont étiquetés¹. Alternativement, expression induite virale de GFP peut être utilisée pour expression sélectionné par l’utilisateur de GFP^3,4. Bien que très utile, expression génétique de médiation de GFP ne permet pas d’expression sélectionné par l’utilisateur dans un sous-ensemble de cellules dans les tissus ; et l’expression virale de GFP, bien qu’avantageuse, peut être envahissante. Avec l’avènement des dérivés de la GFP et habiles techniques comme Brainbow pour exprimer les protéines fluorescentes distinctes plus faiblement dans les tissus, il est devenu possible de visualiser les cellules individuelles et les interactions entre eux en tissu complexe^{2, 5}. Toutefois, ces approches étiqueter les cellules de façon aléatoire. Si l’expérience désirée exige la visualisation d’une seule cellule ou d’une population de cellules qui est définie par l’expérimentateur, elles sont donc limitées. Avec de telles expériences, il serait avantageux d’avoir une protéine fluorescente génétiquement explicite qui peut être manipulée pour distinguer, d’une façon unique cellule, d’autres cellules fluorescentes et non fluorescent.

Pour atteindre cet objectif et visualiser la biologie cellulaire de cellules individuelles au sein d’un tissu vivant complexe, la communauté scientifique utilise seule cellule photoconversion distinctes de protéines fluorescentes^6,7,8. Vous utilisez génétiquement contrôlé d’expression d’une protéine et (c.-à-d., eos, kaede, etc.) qui passe du vert au rouge État fluorescente lorsqu’ils sont exposés aux UV (488 nm) léger, on distingue une seule cellule de ses fluorescent étiquetés voisins^6,7,8. Cette approche utilise un appareil attaché à notre microscope confocal qui peut diriger la lumière d’une pile de laser à une région limitée par la diffraction d’intérêt. Avec cette technique, nous pouvons soit l’étiquette cellules individuelles ou des populations plus importantes dans une manière définie par l’utilisateur^9,10,11. La technique est peu invasive par rapport à des injections de cellule unique de GFP virale. Comme une preuve de concept, nous montrons que nous pouvons photoconvert des cellules individuelles au sein d’un ganglion dans le système nerveux périphérique et de la photoconvert des populations plus importantes comme les cellules situées sur la face ventrale de la moelle épinière^{9,10, 11,12}. Ensuite, nous pouvons visualiser ces populations de cellules photoconverted 24h plus tard pour avoir un aperçu de leur mouvement et de la différenciation au cours du développement.

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Protocole

Toutes les études animales ont été approuvés par l’Université de Notre Dame institutionnels et animalier Comité d’urbanisme.

1. préparation de l’éprouvette de poisson-zèbre

1. Placez un mâle adulte et un adulte femelle Tg (protéine convertible) dans une chambre accouplement par procédures standard¹³. Dans ce manuscrit, utilisez Tg(sox10:eos) poisson⁹ en raison de l’accès mais autres lignées transgéniques avec les protéines et peut être utilisée indifféremment. Mis en place plus d’une chambre dans le cas où ne pas placer de poissons. Laissez le poisson à rester dans la salle pendant la nuit.
2. Le lendemain matin, ramasser les œufs dans des boîtes de Petri de 100 mm. Laisser les oeufs à maturité à la fertilisation après 24h (hpf) avant de dépistage.
3. Si les animaux ci-dessus est hétérozygotes pour le transgène, plats hpf écran 24 pour les embryons Tg(sox10:eos) + avec un 488 nm source lumineuse et GFP filtrent ensembles sur un microscope à dissection. Isoler les embryons Tg(sox10:eos) + et laisser pour mûrir à 48 hpf.
4. Dechorionate embryons manuellement avec une aiguille ou une pince à épiler.
5. Préparer et chauffer 5 mL de solution de gel d’agarose point bas point de fusion 0,8 %.
   1. Une fois que l’agarose est froid au toucher, placer 3-4 Tg anesthésiés (sox10:eos) + 48 Pétri de fond de poisson hpf au centre d’une lamelle de verre de 10 mm.
   2. Ajouter assez d’agarose pour couvrir la surface de la lamelle, environ 1 mL. Utilisez une aiguille sonde pour disposer les poissons sur leurs côtés. Permettre d’agarose solidifier pour assurer le montage des animaux. Il peut être nécessaire de continuellement ré-arranger le poisson-zèbre, jusqu'à ce que l’agar solidifie¹⁴. Solidification prend environ 2 min.
6. Une fois l’agarose a solidifié pendant 2 min, ajouter lentement milieu d’embryon contenant 0,02 % acide aminobenzoïque ester (tricaïne) à plat jusqu'à ce que la surface inférieure de l’agar et le plat est immergée. Cela devrait être environ 3mL.

2. microscope montage et imagerie de pré-conversion

1. Ouvrez le logiciel confocal et sélectionner les fenêtres de capture et de mise au point [Figure 1]. Sous la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifiques lab sous la capture réglage menu déroulant onglet [Figure 1]. Ici, le paramètre de laboratoire spécifique est appelé «poisson Imaging. »
2. Placer l’échantillon sur la portée confocale et donner le focus à l’aide de cours et les boutons de réglage fin.
3. Ouvrez la fenêtre de discussion et localiser la région souhaitée d’intérêt (c.-à-d. les ganglions rachidiens).
4. Sélectionnez le laser c488 sous le menu filtre défini. Régler l’exposition à 300 ms, laser de puissance à 5 et intensifier à 75 [Figure 2].
5. Cocher la case 3D sous la section type de capture . Dans la section Capture 3D , sélectionnez utiliser la position actuelle et vérifier la plage autour de courant. Dans la même section, définissez la plage à 35 le nombre d’avions à 36 et la taille de palier 1. La gamme peut être augmentée ou diminuée pour tenir compte de la profondeur de la zone d’imagerie. Pour la moelle épinière, une valeur de plage entre 35-40 piles est généralement suffisant [Figure 5].
6. Sélectionnez l’emplacement actuel [Figure 5].
7. Cliquez sur Démarrer en bas de la fenêtre de capture, d’acquisition d’image.

3. cellule unique Photoconversion

1. Ouvrez le logiciel confocal et sélectionner les fenêtres de capture et de mise au point [Figure 1]. Sous la fenêtre de capture, sélectionnez le paramètre d’imagerie de conversion spécifiques lab sous la capture réglage menu déroulant onglet [Figure 1]. Ici, le paramètre de laboratoire spécifique est appelé « Poisson ablation complète puce. »
2. Sélectionnez le laser c488 et c541 sous le menu filtre défini. Si ce n’est pas le cas, en utilisant le même logiciel de microscope, trouver le menu pour sélectionner les différents lasers et de sélectionner les 488 nm et de 541 nm lasers. Définir les expositions à 300 ms, laser de puissance à 5 et intensifier à 75 [Figure 2]. Ces paramètres laser seront choisis sur la production assez signal fluorescent sans causer de photoblanchiment ou toxicité. Si toxicité ou photoblanchiment est visualisé, réduire la puissance laser ou l’exposition.
3. Ouvrez la fenêtre de discussion et cliquez sur l’onglet photomanipulation dans la fenêtre de discussion. Ajuster les paramètres du laser en conséquence. Changer la puissance du laser pile à 2 et puis cliquez sur OK. Changer la taille du bloc Raster à 1, puis cliquez sur définir. Changer la taille de double-clic à 4. Remplacez la ligne laser v405 [Figure 3].
4. Ouvrez les paramètres avancés de capture dans la fenêtre de capture. Sélectionnez l’onglet photomanipulation et définissez les répétitions de double-clic sur 2. Cliquez sur OK [Figure 4].
5. Sélectionnez l’onglet XY dans la fenêtre de discussion. Vérifiez les paramètres du laser de l’étape 2 dans l’onglet photomanipulation [Figure 3, Figure 4]. Définir les paramètres de laser à photoconvert la cellule des intérêts sans photoconversion des cellules environnantes.
   1. Se photoconversion de cellules adjacentes, réduire la puissance du laser. Si photoconversion des cellules ne se produit pas, les puissances de laser peuvent être augmentées. La valeur optimale, puissance du laser photoconvert seule de la région d’intérêt et ne pas les régions avoisinantes.
6. Cochez la case timelapse sous type de capture. Puis, cliquez sur Démarrer [Figure 6].
7. Une fois que la fenêtre de timelapse direct s’ouvre, sélectionnez l’outil cercle sur la barre d’outils supérieure [Figure 7]
8. Tracez un cercle dans la région centrale de la cellule. Cliquez avec le bouton droit sur le cercle dessiné, sélectionnez la région FRAPet attendre 3 secondes. La zone sélectionnée doit devenir gradateur [Figure 8]. Cliquez sur arrêter la capture.
9. Si plus d’un animal de l’imagerie, revenir à l’onglet XY dans le menu de mise au point et sélectionnez position 2. Ensuite, répétez les étapes 4.1 à 4.6.
10. Pour convertir une population de cellules, suivre les paramètres de protocole et laser pour obtenir la procédure 4.1 à 4.4 sauf au lieu de dessiner un cercle pour FRAP la région d’intérêt, utilisez l’outil en ligne. Tracez une ligne sur la région d’intérêt et FRAP la région en utilisant les mêmes paramètres énumérés ci-dessus.

4. post-photoconversion Imaging

1. Une fois que tous les points sont photoconverted. Sélectionnez la pile d’image standard de laboratoire spécifiques définissant décrit dans la precoversion d’imagerie étape 3. Cela se trouve sous la capture définissant le menu déroulant onglet dans la fenêtre de capture [Figure 5].
2. Sélectionnez le laser c488 et régler l’exposition à 300ms, puissance 5 laser et intensifier à 75 [Figure 2].
3. Sélectionnez le laser c541 trouvé sous le même menu que le laser c488. Régler l’exposition à 500 ms, puissance de 10 de laser et d’intensifier à 75 [Figure 9].
4. Cocher la case 3D sous la section type de capture . Dans la section Capture 3D , sélectionnez utiliser la position actuelle et vérifier la plage autour de courant. Dans la même section, définissez la plage à 35 le nombre d’avions à 36 et la taille de palier 1. Le numéro de série peut augmenter ou diminuer pour s’adapter à la profondeur désirée d’imagerie [Figure 5].
5. S’il y a plusieurs points dans l’onglet de discussion XY, sélectionnez l’option liste multipoint dans la fenêtre de capture. Si ce n’est pas le cas, sélectionnez l’emplacement actuel.
6. Cliquez sur Démarrer en bas de la fenêtre de capture, d’acquisition d’image.

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Résultats

Photoconversion de protéines fluorescentes peut être utilisée pour étiqueter des cellules distinctes au sein d’un tissu⁶. Pour illustrer cela, Tg(sox10:eos) poisson⁹ ont été utilisés pour exprimer la protéine et Eos sous les séquences régulatrices de sox10. Les animaux Tg(sox10:eos) à 48 hpf ont monté tout d’abord et ensuite imagés pour détecter n’importe quel photoconversion non spécifique qui...

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Discussion

Dans les tissus complexes, différents types de cellules organisent dans des domaines spécifiques. Récemment, des techniques ont été utilisées pour marquer les cellules individuelles au sein de ces tissus de grandes structures^1,2,3. Nous démontrons ici deux techniques qui peuvent de même être utilisées pour visualiser les interactions cellulaires unique et interactions entre population de cellules dans les tissus comple...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals			Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish	VWR	25384-302
Embryo medium			Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose	dot scientific inc	9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish	Ted Pella Inc.	14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)	Fluka analytical	A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters	Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets	3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion	405 nm laser
Slidebook software	3i
Methylene blue	Kordon