Murin, boire des modèles dans le développement des pharmacothérapies pour alcoolisme : boire dans le choix de sombre et deux bouteilles

Résumé

Utilisation de l’alcool trouble (AUD) est un problème majeur de santé nationale et du développement de traitements plus efficaces est nécessaire pour compenser les besoins de cette population de patients. À cette fin, le protocole suivant utilise deux modèles simples de boire rongeurs afin d’évaluer l’efficacité préclinique de composés de plomb anti-alcool.

Résumé

Utilisation de l’alcool trouble (AUD) est un problème majeur avec plus qu’un environ 76 millions de personnes dans le monde répondant aux critères diagnostiques. Les traitements actuels sont limités à trois médicaments approuvés par la FDA qui sont en grande partie inefficaces, même lorsqu’il est combiné avec psychosocial intervention, comme on le voit par le haut des rechutes taux. Par conséquent, la recherche de traitements plus nouveaux représente un objectif important de santé publique. À cette fin, le protocole suivant utilise deux modèles simples de boire rongeurs afin d’évaluer l’efficacité préclinique de composés de plomb anti-alcool : choix de deux bouteilles (à confirmer) et de boire dans l’obscurité (DID). Le premier permet de souris volontaire boire avec modération, alors que ce dernier induit chez les souris volontaires consomment une grande quantité d’alcool sur une courte période qui imite la consommation excessive d’alcool. La nature simple et haut débit de tous les deux de ces paradigmes permettent pour le dépistage rapide des agents pharmacologiques ou pour identifier les souches de souris qui présentent certain comportement de consommation volontaire.

Introduction

Au cours des dernières 25 plus ans, un effort important a été mis sur le développement de médicaments pour le traitement de l’utilisation de l’alcool trouble (AUD)¹. Même si de nombreux progrès ont été réalisés, AUD demeure un problème majeur de santé publique, touchant plus 18 millions d’Américains et coûte plus de $ 220 milliards annuellement^2,3. Actuellement, il y a seulement trois médicaments approuvés par la FDA, disulfirame, naltrexone et l’acamprosate, qui ont donné des résultats contradictoires dans les essais cliniques et un succès limité même lorsqu’il est combiné avec une intervention psychosociale dans les paramètres de la clinique ^{4 , 5 , 6 , 7}.

Des principales raisons pour les échecs de traitement AUD actuelle sont liée à la nature hétérogène de AUD⁸. Alors que les facteurs environnementaux et génétiques contribuent au développement de AUD, héritabilité représente environ 50 à 60 % du risque d’apparition de⁹. Comme pour le traitement de la dépression, il est largement admis que les patients souffrant de AUD aura besoin une grande variété de médicaments qui sont adaptés pour répondre aux besoins de chaque patient¹⁰.

De toute évidence, il y a un besoin urgent de traitements plus efficaces qui serait facilitée si le processus déjà difficile et fastidieux de découverte de médicaments ont été rationalisés³. À cette fin, le protocole suivant démontre l’applicabilité préclinique de deux modèles de rongeurs boire largement utilisé pour examiner les fondements neurobiologiques de AUD¹¹. Plus précisément, la méthode introduite dans les présentes peut évaluer l’efficacité des composés candidats à réduire l’alcool consommation en « modéré » et « binge drinking » scénarios utilisant le choix de deux bouteilles (à confirmer) et de boire dans les sombres paradigmes (DID), respectivement. Les deux paradigmes examinent auto-administration d’éthanol non-opérant, auquel cas souris avalent éthanol oralement et à volonté et donc illustrer visage haute et validité comme modèle d’alcoolisme humain¹¹conceptuelle.

En boire, également connu sous le nom de libre choix, boire, boire, de préférence à confirmer ou boire sociale, deux bouteilles de solution sont disponibles en permanence dans la cage. Une bouteille contient l’eau, et l’autre une solution diluée d’éthanol, auquel cas la concentration d’éthanol peut varier (par exemple., 5-30 % v/v)^11,12. Les souris ont accès en permanence à deux bouteilles et peuvent donc choisir la quantité à boire dans chaque bouteille.

Ce modèle évalue la consommation d’éthanol de chaque souris (g/kg), ainsi que le ratio de préférence de l’éthanol (volume d’éthanol consommé ÷ total volume liquide consommé). Il est couramment utilisé pour comparer les niveaux de consommation d’alcool à travers différentes souches de souris, ou après une manipulation génétique spécifique (par exemple., knock-out du gène ou précipitation) et les résultats dans les concentrations d’éthanol de sang (BECs) similaires à ce que l'on trouve chez les humains lorsque boire avec modération^13,14.

Dans la procédure DID, 3 h après le début du cycle de sombre, la bouteille de cage maison d’eau est échangée avec une bouteille de solution d’éthanol de 20 % (v/v) pour un accès limité à boire session. Les sessions potables observés comme cycle de 4 jours consécutif, durée 2 h les jours 1-3 et 4 h le jour 4. Jours 1-3 servent comme période d’alcool-accoutumance avant du tester au jour 4. Par conséquent, souris fiable consomme suffisamment d’éthanol pour atteindre BECs > 100 mg/dL et présentent par conséquent, les effets sur le comportement d’ivresse trouvées chez l’homme qu’est les beuveries^13,14,15. Accès à l’eau est disponible à tout moment autre que la session de boire.

Il y a plusieurs variations d’un accès limité à boire. Par exemple, dans le modèle d’accès intermittent, souris recevoir deux bouteilles (de l’eau contenant un et l’autre contenant 20 % (v/v) d’éthanol) uniquement sur les lundi, mercredi et vendredi avec un délai d’attente de 24 h et 48 h en semaine et le week-end, respectivement¹⁶. Après plusieurs semaines d’accès intermittent, les souris vont progressivement et volontairement dégénèrent boire niveaux, finit par atteindre BECS semblable à ce qui est observé dans le modèle DID. DID, cependant, semble être le modèle couramment utilisé pour évaluer le comportement de consommation excessive comme. Autres modèles de consommation intermittente existent, mais ils s’appuient sur la restriction de l’accès à la nourriture ou vapeur chambre induit des augmentations auto-administration volontaire, ce qui les rend moins représentatif des volontaires humains alcool consommation¹⁶.

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvés par les comités de l’utilisation du Campus des Sciences de la santé de l’University of Southern California et d’institutionnels animalier.

1. assemblage et montage expérimental

1. Acquérir toutes les fournitures suivantes et les produits chimiques avant le début de l’étude : souris, dessus de cage cages/métal, literie, nourriture, eau, éthanol, pipettes, hauts sipper, shrink wrap, couteau, attaches, bande, bec Bunsen, échelle, projecteur.
2. Obtenir des souris C57BL/6J, soit d’une source commerciale ou une colonie interne, en gardant à l’esprit que la souris peuvent être groupe logé jusqu’au moment de l’alcootest.
   Remarque : Le nombre total de souris obtenue dépend de la complexité du plan expérimental. Plan pour accommoder environ 12-15 souris par groupe, avec des études pilotes pas plus petits que 5-7 souris par groupe. Dans les résultats représentatifs ci-dessous, nous avons utilisé une simple mise en place de deux groupes afin d’évaluer la relation de cause à effet en utilisant une seule dose (5 mg/kg) de la drogue (MOX).
3. Suivez les étapes ci-dessous pour assembler les bouteilles¹⁸.
   1. Faire chauffer un couteau à l’aide d’un bec Bunsen.
   2. À l’aide de ce couteau, couper grossièrement un pouce les extrémités supérieure et inférieure d’une pipette sérologique en plastique 18 mL.
      1. Notez que petites pipettes volume (p. ex., 10 mL) peuvent également être utilisées pour augmenter la précision de la mesure.
   3. Réchauffer la pipette sous un pistolet à air chaud.
   4. Insérez le tube de siroter du roulement à billes dans la fin de « bas » de la pipette (en d’autres termes, l’ouverture plus proche de la ligne 18 mL dash).
   5. Sceller le tube sipper en place avec enveloppe de rétrécissement à l’aide d’un pistolet de pellicule rétractable disponible dans le commerce.
   6. Capuchon de l’autre l’ouverture avec un bouchon en silicone.

2. animal accoutumance

1. Commençant au moins 1 semaine avant la date de début de l’expérience, transférer les souris dans la salle où les procédures expérimentales doivent être effectués afin qu’ils peuvent s’acclimater aux conditions d’élevage (y compris la température ambiante (21 ± 1 ° C) et 12 h lumière/obscurité cycle inversé, avec des lumières hors à 12:00). N’oubliez pas de suivre les lignes directrices et de notifier les voies appropriées avant de déplacer des animaux d’un endroit à l’autre.
   1. Si les souris sont transférées d’un cycle lumière/obscurité standard permettent de 2 semaines de temps supplémentaire de l’accoutumance.
2. Remplir les récipients nouvellement formées à ras bord avec de l’eau. Assurez-vous que le bouchon est fermé solidement et dépourvue de toute bulle d’air ou fuit par le bec. Si la solution est une fuite, re-fermer le capuchon. Éliminez les bulles d’air en appuyant simplement sur la bouteille afin que l’air puisse s’échapper du tube.
3. À l’arrivée, single house chaque souris dans des cages standard en polycarbonate/polysulfone avec literie et un haut de cage grille métallique ; Retirez le couvercle de la cage car il sera n’est plus utilisé.
   1. Donnent accès aux aliments et water bottle(s) ad libitum.
   2. Fixez chaque bouteille vers le haut de la cage en enroulant une attache en plastique autour de chaque bouteille pour maintenir en place. Coupez tout excédent de plastique de l’attache pour s’assurer qu’il ne dépasse pas dans la cage.
      Remarque : Pour la consommation d’alcool dans la procédure (DID) foncée, seulement une seule bouteille d’eau est nécessaire. Accoutumance au paradigme deux bouteille choix (à confirmer), exige toutefois que la mise en place de cage comprend deux bouteilles d’eau. Si la trémie de grille métallique fournie est conçue pour contenir uniquement une seule bouteille de solution, courbez doucement dehors ses bars pour créer un espace pour une plaque supplémentaire accueillir la deuxième bouteille pour confirmer.
4. Mis en place au moins 3 cages de contrôle gratuit de souris. Ceci permettra le suivi de toute perte de fluide causée par l’évaporation ou le déversement des bouteilles, qui est simplement un phénomène naturel qui se produit lorsque les cages sont placées sous et hors tension de la grille de la cage (voir étape 2.6.3 3.6.1 et 4.6.1 pour équations).
5. Partir du jour 4 de l’acclimatation de 1 semaine de logement unique, mesurer et mémoriser le poids de corps et de l’alimentation quotidiens de chaque souris, en utilisant une échelle, (en grammes) ainsi que la prise d’eau, en utilisant les eaux-fortes aux côtés de la bouteille inversée pour enregistrer le point culminant de la ménisque (en mL).
   1. Bien qu’il soit pratique scientifique courante à lire le point le plus bas du ménisque concave, car les bouteilles restent en position inversée pendant la mesure, enregistrer le point culminant du ménisque.
6. Évaluer les paramètres de 2,5 en utilisant les équations ci-dessous :
   1. Mesurer le changement de poids corporel (g) : poids du jour courant (g) - poids de la journée précédente (g).
   2. Mesurer l’absorption de nourriture (g) : poids de nourriture sur le jour précédent (g) - poids de la nourriture pour le jour actuel (g).
   3. Mesurer la consommation d’eau (mL) : perte d’eau moyenne [quantité d’eau sur la journée en cours (mL) - volume d’eau sur la journée précédente (mL)] - de toutes les cages de contrôle (mL).
7. Répétez l’étape 2.5 consécutivement, les jours 5-7, afin de permettre la détermination d’une base de référence pour les trois jours précédant l’introduction de l’éthanol. Si un enregistrement consécutif ne peuvent être recueilli, prolonger la période d’acclimatation pour permettre l’évaluation des mesures de référence.
8. Une fois que la prise d’eau s’est stabilisé à la variabilité de ± 10 % de la moyenne des trois derniers jours, commencer à accès d’éthanol avec TBC (accès illimité) ou DID (accès limité).
   Remarque : À l’occasion rare, un ou deux jours supplémentaires peuvent être nécessaires pour sujets à atteindre cette stabilité ; ne vous alarmez pas si un délai supplémentaire est nécessaire pour les valeurs à afficher la variabilité de ±10 % de la moyenne des 3 derniers jours.

3. 24 heures deux bouteille de choix (à confirmer)

Note : Une représentation schématique est établi dans la Figure 1.

1. Préparer une solution d’éthanol de 10 % (v/v) à un volume de 500 mL en ajoutant 52,65 mL d’éthanol à grain preuve 190 (~ 95 % d’éthanol) à 447,35 mL de H₂O ; n’oubliez pas de bien agiter. Étant donné que l’éthanol s’évapore rapidement, remplacer la solution dans chaque intervalle de 3-4.
   Remarque : D’autres concentrations d’éthanol peuvent être utilisées aussi bien, mais les auteurs recommandent une concentration de 10 % pour ce modèle.
2. Le premier jour de la TBC, (jour 8 au plus tôt) vider 1 sur les 2 bouteilles d’eau, dans chaque cage et remplir à ras bord avec la solution fraîchement préparée de l’éthanol. Étant donné que l’éthanol et l’eau sont difficiles à distinguer visuellement, clairement étiqueter les bouteilles avec leur contenu correspondant. Il suffit d’appliquer un morceau de ruban à la bouteille et l’étiquetage il avec un marqueur, ou en écrivant directement sur la bouteille.
3. Ajouter plus de solution pour la bouteille d’eau, au besoin.
4. Placer les bouteilles sur la cage, en s’assurant que tous les bouchons sont solidement fermés et dépourvu de toute bulle d’air ou fuit par le bec. Si la solution est une fuite, re-fermer le capuchon. Éliminez les bulles d’air en appuyant simplement sur la bouteille afin que l’air puisse s’échapper de la bouteille.
5. Remplaçant la position des bouteilles tous les autres jours comme à correcte de préférence de place conditionnée associé des influences dans l’eau potable de l’activité (voir la Discussion pour en savoir plus).
6. Outre les mesures quotidiennes de 2.5 et 2.6, qui ont eu lieu, commencer à lire et d’enregistrer des niveaux de consommation d’éthanol ainsi. Analyser le ratio d’apport et de préférence de 10 % d’éthanol en utilisant les équations suivantes :
   1. Mesurer les 10 % éthanol apport (mL) : [volume d’éthanol sur le jour actuel (mL) - volume d’éthanol veille (mL))]-perte de l’éthanol provenant de toutes les cages de contrôle (mL) en moyenne.
   2. Mesurer les 10 % éthanol consommation (g/kg) : [10 % d’éthanol d’admission (mL) x 0,07893 g/mL] / poids corporel (kg).
   3. Mesurer le % de préférence : [apport de 10 % d’éthanol (mL) / eau (mL)] x 100.
7. Dès que l’apport d’éthanol est devenu stable, administrer une injection intrapéritonéale (salins) (i.p.) de monocommande (0,01 mL/g de poids corporel) à chacune des souris au cours de la routine quotidienne de la mesure. De cette façon, les sujets sont habitués à l’injection elle-même.
   1. La stabilité est définie comme la variabilité de ± 10 % de la moyenne des 3 derniers jours (le même qu’à l’article 2.8).
      Remarque : Il peut prendre jusqu'à 1 semaine pour le taux d’éthanol stabiliser. Cela est particulièrement vrai si les souris sont ré-utilisés d’une expérience précédente et ont eu une exposition antérieure à l’éthanol. Le contrôle est simplement le dissolvant utilisé pour dissoudre la drogue.
8. Une fois qu’une ligne de base de l’éthanol avec une faible variabilité est rétablie, diviser les souris en dosage groupes en utilisant les valeurs de l’apport de l’éthanol afin que tous les groupes ont à peu près similaire moyen des valeurs de l’apport d’éthanol.
   1. Désigner un groupe comme le contrôle (continuant à recevoir une solution saline) et l’autre comme l’expérimental (injection intrapéritonéale de la drogue ont étudié à 0,01 mL/g de poids corporel). Commencer la drogue quotidienne de dosage, soit pour une durée aiguë ou plusieurs jour. Par la suite, le contrôle peut être réintroduit pour tester les effets de la drogue après (en option).
      Remarque : Parce que boire est surveillé sur une longue période de 24 h, le temps de l’administration de la dose n’est pas dépendant du cycle foncé.

4. consommation d’alcool dans l’obscurité (fait)

NOTE : Une représentation schématique est établi dans la Figure 3.

1. Chaque jour de l’accès régulier de l’éthanol (jours 1-4) inscrit ces mesures, le volume d’eau, la prise alimentaire et du poids corporel et effectuer le dosage des médicaments. Cela à l’époque présélectionnés pendant le cycle de lumière qui est choisi selon la pharmacocinétique du médicament jusqu'à ce que le composé / ou approchant la concentration maximale de cerveau pendant la période de consommation d’alcool.
   Remarque : N’oubliez pas jours 1 à 3 sont censés simplement s’acclimater les souris à l’eau potable abondantes concentrations d’éthanol dans un court laps de temps. Alors que les souris n’atteignent pas les niveaux BEC comparables à 0,08 humaine ; ces jours de « formation » veiller à ce que le jour 4, lors de la session de boire un peu plus longtemps, ils boiront en fait à ce niveau.
   1. Donner toutes les souris au contrôle (solution saline) sur jours 1-3 et le contrôle ou drogue au jour 4. Cette procédure DID produit en l’espace de 3 semaines d’inscrire un médicament avant (semaine 1), drogue (semaine 2) et session de boire après drogue (semaine 4).
   2. Remarque : Notez que pendant la semaine de dosage de médicament, niveaux de consommation de l’éthanol jour 3 sont utilisées pour affecter souris soit le groupe de contrôle ou de la drogue dans une voie où les niveaux de consommation d’éthanol des deux groupes ont la variabilité moindre. C’est contrairement à TBC, qui assigne des groupes fondés sur une moyenne de 3 jours.
2. Préparer une solution d’éthanol de 20 % (v/v) (20E) à un volume de 500 mL en ajoutant 105,25 mL d’éthanol à grain preuve 190 (~ 95 % d’éthanol) à 394,75 mL de H₂O ; n’oubliez pas de bien agiter.
3. Remplir les récipients d’éthanol avant le début de la session de boire pour que DID commence dès que les bouteilles d’eau peuvent simplement être remplacés avec les bouteilles d’alcool.
4. Au cours de la session complète de DID (étapes 4,5 et 4,8), utiliser un projecteur de lumière rouge pour ne pas déranger les animaux.
5. Au début de DID boire session, prévue pour commencer à 3 heures dans le cycle de sombre, enregistrer le volume d’eau pour chaque souris. Ensuite, remplacez chaque bouteille d’eau avec une bouteille de la solution de la 20E et noter le volume d’éthanol départ.
6. Lire et noter le volume final de l’éthanol 2 heures plus tard, à la fin de la session boire les jours 1 à 3 et 4 heures plus tard, le jour 4. Analyser la consommation d’éthanol de 20 % en utilisant les équations suivantes.
   1. Mesurer les 20 % consommation d’éthanol (mL) : [volume d’éthanol à fin de session (mL) - volume d’éthanol en début de session (mL) à boire à boire] - éthanol moyenne perte de toutes les cages de contrôle (mL).
   2. Mesurer les 20 % éthanol consommation (g/kg) : [20 % consommation d’éthanol (mL) x 0,15786 g/mL] / poids corporel (kg).
7. Jour 4 seulement, immédiatement après l’enregistrement des volumes d’éthanol et avant de réintroduire l’accès à l’eau, prélever le sang afin d’évaluer la concentration d’éthanol sanguin de chaque souris (facultatif).
   Remarque : Toute méthode de collecte de sang non terminal peut servir, par exemple la collecte de sang du sinus rétro-orbitaire ou collecte de sang de la veine saphène. Protocoles utiles voir références pour Parasuraman et al. ²¹ et Yardley et al. ²⁰.
   1. Effectuer une analyse à l’aide de différentes méthodes, y compris LCMS, ou des machines disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
8. Remplacer toutes les bouteilles de l’éthanol avec bouteilles d’eau et le volume d’eau record.

Résultats

Dans les enquêtes représentatives suivantes, boire sociale a été modélisé en utilisant le paradigme du choix de deux bouteilles (à confirmer). Brièvement, les souris ont accès à deux bouteilles de solution, qui contenait l’eau et l’autre une solution d’éthanol de 10 % (v/v). Sujets ont été par la suite divisés et uniformément assignés aux groupes de traitement médicamenteux, moxidectine (MOX) vs contrôle saline, afin que chaque groupe serait ont en moyenne des nive...

Discussion

Dans le monde entier estimations indiquent qu’autant que 76 millions de personnes remplissent les critères pour justifier un diagnostic pour l’utilisation d’alcool trouble (AUD). Malheureusement, les traitements pharmaceutiques actuellement disponibles sont en grande partie inefficaces et mise au point est nécessaire pour compenser les besoins de cette population clinique²⁰. À cette fin, le texte suivant protocole vise à faciliter cette entreprise en illustrant deux d'entre les plus él?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L  graduated cylinder	VWR	https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co	To prepare ethanol solution.
1 L glass bottle	Pyrex (Fisher Scientific)	https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752	To prepare ethanol solution.
100 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311	To prepare ethanol solution.
Analox			One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine
ball-bearing sipper tubes	Ancare Corp.	http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point	Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100
C57BL/6J Mice	Jackson lab	https://www.jax.org/strain/000664	May also come from internal breeding colony
disposable serological pipets	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged	10 mL, 18 mL, or 25 mL
ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC	Decon Labs (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec	---
heat gun	Master Appliances Corp.	http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
heat shrink tubing	---	---	Diameter: 3/8 inches
industrial knife/blade	---	---	---
metal cage plate	---	---	Should be available through the university/institutional vivarium
mouse RO water	---	---	Should be available through the university/institutional vivarium
portable electronic scale	Ohaus (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus	---
red light headlamp	nyteBright (Amazon)	https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1	---
silicone stoppers	Fisher	---	---
thermometer	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232	---
weigh boat	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes	The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative