Une Time-lapse, sans étiquette et Quantitative Phase imagerie de cellules cancéreuses humaines dormantes et Active

Résumé

Phénotypes de cellules dormantes et active du cancer ont été caractérisées à l’aide de l’imagerie quantitative phase. Essais sur la prolifération, la migration et la morphologie des cellules ont été intégrées et analysées dans une méthode simple.

Résumé

L’acquisition du phénotype angiogénique est une composante essentielle de l’évasion de la dormance de la tumeur. Bien que plusieurs essais classiques in vitro (p. ex., prolifération, migration, etc.) et in vivo des modèles ont été développés pour évaluer et caractériser des phénotypes cellulaires angiogénique et non-angiogénique, ces méthodes sont temps forte intensité de main d’oeuvre et nécessitent souvent des réactifs coûteux et les instruments, mais aussi une expertise appréciable. Dans une étude récente, nous avons utilisé une nouvelle phase quantitative (QPI) technique d’imagerie pour mener des caractérisations de Time-lapse et sans marquage de cellules de SDU ostéosarcome humain angiogénique et non-angiogénique. Un panneau des paramètres cellulaires, y compris la morphologie cellulaire, la prolifération et la motilité, ont été mesurés quantitativement et analysées à l’aide de QPI. Ce roman et l’approche quantitative offre la possibilité d’en permanence et de façon non invasive étudier les processus cellulaires pertinents, des comportements et des caractéristiques des cellules cancéreuses et autres types de cellules dans une façon simple et intégrée. Ce rapport décrit notre protocole expérimental, y compris la préparation de cellules, QPI acquisition et analyse des données.

Introduction

Un des premiers postes de contrôle dans le développement et la progression d’une tumeur solide est l’acquisition du phénotype angiogénique, une caractéristique du cancer. Cette progression implique une variété de processus biochimiques et moléculaires^1,2,3. Un défi technique pour l’étude de cette étape clé dans la progression tumorale est le manque d’outils pour continuellement et quantitativement caractériser et différencier les phénotypes angiogénique et non-angiogénique des cellules de cancer vivent de manière impartiale. Les dosages traditionnels utilisés pour étudier les comportements cellulaires des cellules angiogéniques et non-angiogénique généralement nécessitent des instruments et des réactifs coûteux, par exemple, la prolifération et la migration des cellules dosages^{4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14} ou complémentaires en vivo évaluations^{4,5,6,8,15,16}, comme nécessitant une forte intensité et une expertise appréciable consommation de temps et du travail.

Récemment, la phase quantitative imaging (QPI) est apparu comme une nouvelle technique qui permet l’évaluation accélérée et sans étiquetage d’une variété de cellule morphologie et le comportement paramètres^{17,18,19, 20 , 21 , 22}. Contrairement à la microscopie optique conventionnelle, QPI quantifie les variations de déphasage pixel par pixel après la lumière passe à travers un objet optique, puis reconstruit un testament olographe avec épaisseur optique converti et volume, permettant ainsi le direct analyse des cellules vivantes et les caractéristiques suivantes : (1) quantitative imagerie, imagerie (2) non invasive et Time-lapse, imagerie (3) l’étiquette-libre et l’imagerie multiparamétrique (4) simultanée. Ces caractéristiques font de QPI un outil puissant pour évaluer et comprendre les processus pathologiques au niveau cellulaire.

Dans une étude récente, nous avons utilisé le QPI pour quantitativement caractériser et différencier les angiogénique SDU-A et non-angiogénique SDU-N phénotypes des cellules d’ostéosarcome humain d’une manière systématique et quantitative, combinant l’analyse de la morphologie cellulaire, prolifération et²³de la motilité. À l’aide de logiciels d’analyse image, un panneau de cellule morphologique et comportement paramètres ont été quantitativement comparées entre les cellules humaines ostéosarcome angiogénique et non-angiogénique et cinq différences caractéristiques ont été identifiées entre ces deux phénotypes. Cette approche novatrice fournit une plate-forme intégrée et quantitative pour évaluer une variété de caractéristiques cellulaires biologiquement pertinentes.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de biosécurité institutionnel du Boston Children Hospital.

1. préparation de la cellule

1. Dégel SDU-A et cellules -N
   1. Milieu de culture, c'est-à-dired’échauffement Dulbecco Eagle milieu additionné de 10 % de sérum de veau foetal (vol/vol) (FBS) et 1 % (vol/vol) pénicilline/streptomycine modifié.
   2. Prélever les coupes cryogéniques de cellules dans le réservoir de l’azote liquide, plonger le fond du flacon dans l’eau chaude dans un bain-marie à 37 ° C et agitez doucement les coupes cryogéniques pour accélérer la décongélation. Gardez le couvercle des flacons cryogéniques de prendre contact avec l’eau pour éviter toute contamination. Dès que les cellules sont décongelés, stériliser le flacon cryogénique par pulvérisation de solution d’éthanol à 70 % et en essuyant le flacon.
   3. Dans une hotte à flux laminaire, aspirer immédiatement la suspension de cellules à partir du flacon cryogénique et Suspendez doucement en milieu de culture de 10 mL chauffé (décrit en 1.1.1). Centrifuger des suspensions de cellules à environ 200 g pendant 5-7 min.
   4. Resuspendre le culot cellulaire avec milieu de culture de 10 mL réchauffé et transvaser dans une fiole de T75. Pipetez doucement plusieurs fois de suspendre les cellules uniformément à l’aide d’une pipette 10 mL.
   5. Placer la fiole dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % (vol/vol) CO₂ et atmosphère humidifiée. Permettre aux cellules d’attacher pendant au moins 12 h.
   6. Incuber les cellules pendant environ 3 à 7 jours jusqu’au confluent de 80 à 100 %. Changer le milieu de culture tous les 2-3 jours.
2. Fractionnement des SDU-A et cellules -N
   1. Retirez le support de culture du flacon.
   2. Laver les cellules avec 5 mL de PBS stérile (1 x) sans calcium et magnésium, pour enlever les cellules non adhérentes ou fraction.
   3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % dans la fiole et agiter brièvement le ballon pour s’assurer que la trypsine-EDTA est dispersé uniformément.
   4. Incuber le flacon pour 2-3 min dans un incubateur à 37 ° C ou 3-5 min à température ambiante. Vérifier les cellules au microscope à un grossissement de x 400 environ pour s’assurer que les cellules sont arrondis et détachés.
   5. Une fois que les cellules sont individuelles, ajouter 10 mL de milieu de culture et Pipetez doucement le milieu de haut en bas plusieurs fois pour briser les agrégats de cellules en suspension monocellulaire à l’aide d’une pipette 10 mL.
   6. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. La suspension cellulaire des semences dans des fioles T75 nouvelles à une densité de 2 × 10⁶ cellules soit un ratio de 1:4.
   7. Permettre aux cellules de croître jusqu'à 80-100 % confluence avant de semer pour l’expérience QPI.
3. SDU-A l’ensemencement et cellules -N pour QPI
   1. Graine de rue-A et -N cellules dans 6 plats à la densité de 50 000-300 000 cellules/puits avec 5 mL de milieu de culture après avoir compté avec un compteur de cellules.
      Remarque : La densité de semis dépend le taux de prolifération cellulaire et la période de temps d’imagerie afin d’avoir < confluence de 100 % au cours de l’acquisition d’imagerie.
   2. Incuber les cellules pendant au moins 12 h permettre la fixation.
   3. Changer le milieu avec les supports neufs avant d’effectuer le QPI.

2. QPI Acquisition

1. Lamelle couvre-objet mis en place
   1. Nettoyer la lamelle couvre-objet en rinçant plusieurs fois à l’eau désionisée et stériliser avec la solution d’éthanol 75 % par immersion pendant 15 min. mettre la lamelle couvre-objet dans une hotte stérile à flux laminaire pour sécher.
   2. Placez délicatement la lamelle couvre-objet sur une plaque de 6 puits pour éviter les bulles d’évidents. Veiller à ce que la partie inférieure de la lamelle couvre-objet est immergée dans les milieux de culture (minimum 5 mL/puits).
   3. Placer la plaque dans l’incubateur (37 ° C, 5 % CO₂et atmosphère humidifiée) s’équilibrer pendant au moins 15 min. Si le brouillard se forme sur la lamelle couvre-objet, utilisez un coton-tige stériles pour essuyer.
2. L’imagerie de cellules au microscope
   1. Ouvrez le logiciel pour initialiser le système, y compris auto-étalonnage des temps d’exposition, contraste de motif et le bruit de l’hologramme. Assurez-vous que les valeurs sont acceptables (illustrée dans la plage verte ou jaune).
   2. Placez la plaque de 6 puits sur la scène du microscope QPI.
   3. Cliquez sur « Live Capture » et sélectionnez « Manuel » dans « Focus logiciel. » Grossièrement mettre les images de phase de cellules en réglant la distance de travail en « Configuration de Microscope » pour obtenir des contours pour les cellules dans les images de phase. Remplacez « Automatique » dans « Focus logiciel. »
   4. Cliquez sur « Nouvelle expérience » pour créer une nouvelle expérience. Commencez par le choix des postes d’acquisition image à l’aide de la souris ou les touches de direction sur le pavé numérique. Cliquez sur « Mémoriser » après chaque sélection. Normalement 3-5 emplacements pour chaque échantillon sont sélectionnés.
   5. Configurer les intervalles d’imagerie et de la période de temps dans la section « Timelapse ».
      Remarque : Pour suivre clairement les cellules cancéreuses, les intervalles doivent être plus courtes que 5 min. 48 heures est défini comme la période de temps pour la combinaison analyse QPI.
   6. Lancer le test en cliquant sur « Capture », qui portera automatiquement et acquérir les images dans les points de temps de réglage.

3. analyse des données

1. Analyse de la morphologie cellulaire
   1. Cliquez sur « Identifier les cellules ». Ajustez le réglage numérique pour « Seuil de fond » afin que les cellules sont séparées bien du bruit de fond. Ajuster le nombre de paramètre pour « Taille de l’objet » pour s’assurer que chaque cellule possède un noyau. Maintenir les paramètres compatibles pour les échantillons qui doivent être comparées, car ceux-ci peuvent affecter les mesures finales de surface et volume. Modifier manuellement les segments de la cellule à l’aide de « Modifications manuelles, » si nécessaire.
   2. Utilisez la fonction « Analyser les données » dans le logiciel afin d’analyser les cellules. Lancez une nouvelle analyse de données en cliquant sur « New analysis. » Faites glisser les images sélectionnées dans les paramètres « Images sources » onglet et cellule morphologie dont la zone de cellule (µm²), l’épaisseur optique (µm) et volume (µm³) pour chaque cellule. Choisissez un scatter plot ou histogramme mode et exportation données comme des tableaux ou figures.
2. Analyse de prolifération cellulaire
   1. Sélectionnez au moins 5 images pour les différents moments d’intérêt (par exemple, initial, 12 h, 24h, 36 h et 48 h). Nombre de cellules record qui est fournis par le logiciel.
   2. Pour estimer le temps de doublement, tracer le nombre de cellules après la normalisation avec les nombres premiers et s’adapter aux courbes de croissance exponentielle.
3. Analyse du mouvement cellulaire
   1. Utilisez la fonction « Suivi des cellules » dans le logiciel. Cliquez sur « Nouvelle analyse » pour commencer une nouvelle analyse de données. Série de glisser des images pour une période de temps sélectionnée (par exemple, 4 h après 24 h d’incubation) dans l’onglet « Images sources » choisir au hasard 10-30 cellules en cliquant sur cellules sous le mode de sélection « Ajouter des cellules ». Exclure les cellules sur les bords et ceux qui se déplacent hors du champ de vision.
   2. Vérifiez attentivement le suivi dans la série d’images. Dans le cas où le système perd la trace d’une cellule ou des pistes de la mauvaise cellule, ajuster manuellement la cellule de suivi en cliquant sur « Identifier » pour identifier les cellules ou en cliquant sur « Modifier emplacement » sous le mode « Select » pour modifier l’emplacement de la cellule.
   3. Choisissez rose intrigue des trajectoires de cellule en « Mouvement de terrain » ou terrain pour les autres paramètres liés au mouvement dans « Caractéristiques de la parcelle, » tels que la vitesse de motilité (µm/h), la motilité (µm), migration (µm) et franchise de migration. Exporter des données sous les tables ou les figures.

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Résultats

La figure 1 illustre une caractérisation de la morphologie cellulaire typique. Les images sont présentées comme des hologrammes (Figure 1 a-B) et des images 2D (Figure 1-D). Épaisseurs de cellules optiques (calculées à partir de l’indice de réfraction et de la longueur du trajet optique) sont quantifiés par profil de ligne ou d’une mesure de cellules enti...

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Discussion

Dans cette étude, nous décrivons une in vitro, non invasif et sans étiquette de méthode à l’aide de QPI pour caractériser quantitativement les phénotypes angiogénique et non-angiogénique des cellules humaines ostéosarcome. Plusieurs paramètres cellulaires ont été analysés en même temps par cette méthode intégrée, haut débit, y compris le taux de prolifération, en doublant le temps, la franchise de migration, vitesse de motilité, migration et motilité, volume cellulaire, épaisseur de la c...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
T75 flask	Corning, NY, USA	353136
6-well plates	Corning, NY, USA	3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	11965092
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals, GA, USA	S11550
Penicillin Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	15140122
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	10010023
Beckman Z1 Coulter counter	Beckman Coulter, IN, USA	Z1
HoloMonitor M4	Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden	M4	Microscope
Hololid	Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden	PHI 8020
HStudioM4	Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden	HStudioM4	Software