Évaluation systématique du bien-être chez les souris pour les procédures utilisant l’anesthésie générale

Résumé

Nous avons développé un protocole pour évaluer le bien-être chez les souris au cours de procédures à l’aide de l’anesthésie générale. Une série de paramètres du comportement indiquant les niveaux de bien-être ainsi que les métabolites de glucocorticoïdes ont été analysés. Le protocole peut servir comme une aide générale pour estimer le degré de sévérité d’une manière scientifique, axée sur l’animal.

Résumé

En accord avec les 3R principe (remplacement, réduction, raffinement) développé par Russell et Burch, recherche scientifique doit utiliser des alternatives à l’expérimentation animale, lorsque cela est possible. Lorsqu’il n’y a pas d’alternative à l’expérimentation animale, le nombre total d’animaux de laboratoire utilisés doit être au minimum nécessaire pour obtenir des données précieuses. En outre, les mesures de raffinement appropriées devraient être appliquées pour minimiser la douleur, la souffrance et la détresse qui accompagne la procédure expérimentale. Les catégories utilisées pour classer le degré de douleur, la souffrance et la détresse sont non-recouvrement, légère, modérée ou grave (Directive européenne 2010/63). Pour déterminer quelles catégories s’appliquent au cas particuliers cas, il est essentiel d’utiliser des outils scientifiquement.

Le protocole de bien-etre-évaluation présenté ici est conçu pour les procédures au cours desquelles l’anesthésie générale est utilisée. Le protocole met l’accent sur les comportements de l’activité, la souris Grimace échelle et luxe maison cage comme fouisseurs et nid comportement en train de construire des indicateurs de bien-être. Il utilise également le paradigme exploratoire gratuit pour un comportement liées à l’anxiété trait. Métabolites fécaux corticostérone comme indicateurs de stress aigu sont mesurés sur la période post anesthésique de 24 h.

Le protocole fournit des informations scientifiquement solides sur le bien-être des souris après une anesthésie générale. En raison de sa simplicité, le protocole peut facilement être adapté et intégré dans une étude prévue. Bien qu’il ne fournit pas une échelle pour classer la détresse en catégories selon la Directive européenne 2010/63, elle peut aider les chercheurs à estimer le degré de sévérité d’une procédure à l’aide de données scientifiquement. Il fournit un moyen d’améliorer l’évaluation du bien-être d’une manière scientifique, axée sur l’animal.

Introduction

L’Union européenne Directive 2010/63¹ stipule que le principe des 3R (remplacement, réduction, raffinement) développé par Russell et Burch² doit être appliquée chaque fois que l’expérimentation animale est nécessaire. Le but ultime de la Directive de l’Union européenne doit éliminer progressivement tous les essais sur les animaux, mais la Directive reconnaît que, pour l’instant, quelques expériences sur des animaux sont encore nécessaires pour mener des recherches qui permettra de protéger la santé humaine et animale. Ainsi, si une expérimentation animale ne peut être remplacée par toute autre méthode, seul le nombre minimum d’animaux de laboratoire doit être utilisé pour obtenir des résultats fiables. En outre, le montant de la douleur, la souffrance et la détresse qui accompagnent les procédures expérimentales devrait être minimisé par des mesures appropriées de raffinement. L’Union européenne Directive 2010/63 stipule que la gravité d’une procédure devant être prospectivement qualifiée de non recouvrement, légère, modérée ou grave¹. Classification de la gravité est décidé sur une base de cas-par-cas, il est important d’avoir des outils pour estimer la gravité d’une procédure donnée scientifiquement.

Feuilles de pointage tel que proposé par Morton et Griffith³ sont un outil essentiel pour détecter les déviations de l’état normal, y compris les effets négatifs sur le bien-être⁴. Feuilles de pointage sont utilisés afin de déterminer rétrospectivement la douleur, la souffrance, et la détresse causée par une expérience et de se concentrer sur les changements visibles dans l’état physique de l’animal (p. ex., poids corporel, fourrure, démarche). Même si, à l’annexe VIII de la Directive européenne 2010/63 fournit des exemples de chaque catégorie de gravité, chercheurs des outils manque encore d’estimer le degré de sévérité d’une procédure donnée en utilisant scientifiquement basent données.

L’absence d’indicateurs montrant bien-être négatif n’est pas la seule façon de déterminer l’état de l’animal ; la présence d’indicateurs pointant au bien-être positif est aussi important de^5,6,7,8. Par exemple, animaux affiche des comportements de luxe comme fouisseurs et niche bâtiment comportement uniquement lorsque tous leurs besoins essentiels sont satisfaites. Si bien-être est réduite, les comportements de luxe sont les premiers à baisser de^5,7. Protocoles à utiliser pour évaluer le bien-être devraient inclure des indicateurs pointant vers physiques, physiologiques et biochimiques et des États psychologiques des animaux afin d’évaluer leur bien-être dans une forme détaillée et complète⁹.

Dans le cadre du raffinement, un protocole a été développé pour répondre à ces besoins et d’évaluer les effets d’un régime comportant une anesthésie générale sur le bien-être des souris¹⁰. Dans le même temps, l’objectif était de minimiser tout stress supplémentaire pour permettre l’intégration facile du protocole dans une expérience donnée. Le protocole estime fouisseurs, comportement, comportement cage maison comme activité, la prise alimentaire et imbrication et le comportement de liées à l’anxiété trait. En outre, il comprend l’échelle souris de la Grimace (MGS) et l’analyse non invasif des métabolites de la corticostérone dans les fèces. Le protocole est conçu pour faciliter l’évaluation du bien-être d’une manière scientifique et axée sur l’animal et à fournir des informations sur le bien-être qui prend en charge la classification du degré de gravité. En plus des feuilles de pointage, il peut fournir des informations utiles pour la classification de la gravité d’une procédure. Que le protocole est facile à réaliser et ne nécessite pas d’équipement vaste, il peut être intégré dans une expérience en cours, sans influencer les résultats d’une étude. Il est à noter que la recherche de l’Animal : Reporting de In Vivo des expériences (arrivée) ligne directrice¹¹ doit être observée dans toutes les études portant sur l’expérimentation animale, dans le but d’améliorer la conception, l’analyse et les rapports.

Protocole

L’étude a été réalisée conformément aux lignes directrices établies par la loi allemande de bien-être Animal et a été approuvée par l’autorité de l’état de Berlin (« Landesamt für Gesundheit und Soziales », numéro de permis : G0053/15).

Remarque : L’objectif principal du présent protocole a été d’étudier l’effet de l’anesthésie répétée sur les métabolites de glucocorticoïdes. Un exemple de calcul de taille a été réalisée pour déterminer le nombre d’animaux à être utilisés : n ≥ 2 × (s / µ₁- µ₂)² × (z_α +_βde la z)². ₁de µ - µ₂ est la différence entre les moyennes de population à laquelle puissance et échantillon taille calculs sont effectués (α = 5 %, β = 80 %) ; z_α = 1,96 et z_β = 0,84 sont les quantiles de la distribution normale standard. La figure 1 illustre la ligne de temps du présent protocole. Si un paramètre du Protocole montre une différence avec le niveau de contrôle, l’animal doit être étroitement surveillée, et le paramètre doit être mesuré à nouveau après une période adéquate. Par exemple, si le comportement de lié à l’anxiété trait est augmentée, ce comportement devrait testé à nouveau une semaine plus tard, afin d’aider à déterminer la période jusqu’au rétablissement complet. Points dans le temps et les périodes définies par le présent protocole peuvent être adaptés pour être utilisé avec d’autres procédures. Lorsque vous modifiez les points dans le temps, périodes d’accoutumance doivent être conservés tel que décrit dans le protocole. Afin de réduire les facteurs pouvant influencer le comportement de la souris, des essais qui nécessitent une manipulation plus devraient être effectués après les essais qui ne pas dérangent le comportement normal des souris. La figure 2 résume tous les tests du protocole à l’aide d’une fiche de notation. La figure 3 fournit simplifiée des échelles du niveau du bien-être, qui donnent un aperçu de la façon d’interpréter les résultats des tests.

1. habituant souris à une manipulation par l’expérimentateur

1. Permettre aux souris de s’habituer à l’animalerie pendant au moins 2 semaines après que qu’ils ont été obtenus d’une autre installation ou du vendeur.
2. Maison des souris dans les groupes et les maintenir dans des conditions normales (température de la pièce 22 ± 2 ° C, hygrométrie 55 ± 10 %) sur un cycle de lumière : obscurité de 12:12 h.
3. Fournir à tous les groupes d’un tunnel et coton nidification comme enrichissement standard et fournir de la nourriture et l’eau ad libitum.
4. S’habituer à toutes les souris au tunnel et/ou coupe manutention au moins une semaine avant le test¹².
   NOTE : Ramasser des souris par la queue peut induire le stress ou l’anxiété, qui se répercute sur le bien-être et a également un impact sur les résultats de ce protocole¹².

2. préparation de la salle d’examen comportemental et appareils

Remarque : Prévoir une pièce séparée pour le test, idéalement près de la salle où les animaux sont maintenus. Transporter les souris dans leur maison aux tests chambre au moins 60 min avant que la procédure se déroule. Si possible, effectuer tous les tests du présent protocole dans la même salle d’examen où l’intervention est effectuée.

1. Préparer une cage d’observation à l’épreuve de comportement fouisseur⁸ et de prendre des photographies pour utilisation dans la MGS¹³ (Figure 4).
   1. Utilisez une cage de verre avec une superficie d’environ 220 × 290 mm et une hauteur de 390 mm.
   2. Toute la surface de cette boîte avec environ 0,5 cm de matériau de literie.
   3. Eparpiller une poignée de litière usagée de la cage sur le dessus de la nouvelle litière pour réduire la détresse causée par le nouvel environnement.
   4. Fournir de la nourriture, le même genre normalement fourni dans le régime alimentaire et l’eau.
      Remarque : si possible, utilisez des bouteilles d’eau, parce que les souris peuvent remplir les abreuvoirs avec matériel de literie.
2. Préparer une cage (de type III : 420 mm x 260 mm x 150 mm) pour la période d’observation de 24 h, pour lesquelles les souris sont logés individuellement (Figure 5).
   Remarque : Afin de réduire la durée de logements individuels, collecter des données pour nid construction de comportement, l’activité de la maison cage, la prise alimentaire et métabolites fécaux corticostérone (FCM) au cours de cette période.
   1. Place nouvelle literie matériel dans la cage (environ 0,5 cm de profondeur) et les nuages de points XY une poignée de litière usagée sans matières fécales de la cage sur le dessus le nouveau matériel, afin de réduire la détresse.
   2. Fournir un nestlet coton carré normalisée d’un poids défini, comme enrichissement environnemental seulement (voir le tableau des matériaux)¹⁴.
      NOTE : Nidification commerciale peut être différent du poids. C’est pourquoi, nous avons modifié le poids de la nestlet décrite par Deacon et utilisé 2,0 g au lieu de 2,7 g¹⁴.
   3. Monter le capteur infrarouge sur le dessus de la cage, lorsque vous utilisez un capteur infrarouge pour mesurer l’activité de la maison cage (voir table des matières).
   4. Fournir de la nourriture, le même genre normalement fourni dans le régime alimentaire, et l’eau ad libitum.

3. souris Grimace échelle

NOTE : Photographies pour les MGS sont pris dans la cage d’observation à trois moments : (i) 2 jours avant l’intervention à des niveaux record MGS, (ii) 30 min après l’intervention et (iii) 150 min après l’intervention. Quand bien-être est médiocres, les scores sur la MGS augmentent. Si une augmentation des scores MGS sont encore observés après 150 min, prendre des photos supplémentaires à un stade ultérieur.

1. Utiliser une caméra haute définition pour la photographie.
2. Doucement, transférer la souris dans la cage d’observation et permettre à la souris pour s’habituer au nouvel environnement pendant au moins 30 min.
3. Continuellement prendre environ 30-40 photos à chaque fois la pointe dans 1-2 min.
4. Trier toutes les photos en sélectionnant les photographies frontales ou latérales pointus et en jetant les photos floues ou des photographies qui montrent les visages de souris d’autres perspectives que la vue frontale ou latérale.
5. Choisir au hasard une photo de chaque point dans le temps (c'est-à-dire 2 jours avant la procédure, 30 min après l’intervention et 150 min après l’intervention) pour chaque souris.
6. Recadrer les photos pour afficher uniquement la tête de la souris afin que la position du corps n’est pas visible¹³.
7. Créez un fichier de feuille de calcul avec une feuille pour chaque photo et ajoutez une table comprenant cinq unités d’action faciale du SGM pour chaque feuille.
   Remarque : Le fichier contient des photographies de base ainsi que des photographies post procédure.
8. Randomiser l’ordre des feuilles.
9. Présenter le fichier sur un écran d’ordinateur à trois personnalités indépendantes, qui ont été précédemment formées à utiliser les MGS développé par Langford et coll. et faites-les marquer les unités d’action du visage à l’aide d’une échelle de points-3-(0 = absent, 1 = modérément actuelle, 2 = évidemment présents).
   NOTE : Notation est basée sur la suite paramètres¹³: orbitale de serrage (« rétrécissement de l’espace orbital, avec une paupière hermétiquement fermé ou un squeeze oeil ») ; bosse du nez (« arrondi extension de peau visible sur le pont du nez ») ; renflement joue (« apparence convexe du muscle joue ») ; position de l’oreille (« oreilles tiré dehors et retour de leur position de base ou présentant des stries verticales qui se forment en raison des conseils des oreilles étant tirés en arrière ») ; changement de moustaches (« mouvement de moustaches de leur ligne de base du poste soit en arrière, contre la face ou vers l’avant, comme si debout sur la fin ; moustaches peuvent également s’agglutiner ensemble »).
10. Analyser les résultats, comme suit (adapté de Langford et al. ( ¹³).
    1. Moyenne toutes les unités d’action faciale pour chaque photo pour générer la partition de MGS.
       Remarque : Si une des unités de mesures du visage ne pourrait pas être marquée, en moyenne les autres unités de mesures du visage.
    2. Soustraire la moyenne pour les photos de la base de la moyenne de la procédure post de photographies d’obtenir un score de différence MGS pour chaque souris.
    3. Test des différences dans les scores de différence MGS entre les personnes (test non paramétrique pour exemples associés).
       Remarque : S’il y a une différence significative (p < 0,05), déterminer si les scores de toutes photographies ou seulement des dizaines de photographies quelques diffèrent entre les personnes. Si celui-ci est vraie, répétez marquant de ces photographies. Dans le cas contraire, les personnes doivent répéter la formation de MGS et puis marquer les photos encore une fois.
    4. Moyenne les scores de différence MGS donnés par les buteurs différents pour chaque souris, si les résultats de toutes les personnes ne diffèrent pas significativement.
    5. Un test statistique non paramétrique permet de comparer les scores de différence MGS en moyenne entre les groupes d’étude.

4. creuser le comportement^8,15,16

1. Préparer des terriers en plaçant 140 ± 2 g boulettes normalement fournis comme régime dans une norme bouteille d’eau en plastique opaque (250 mL, longueur 150 mm, diamètre de 55 mm, 45 mm de diamètre du goulot de la bouteille)⁸.
   Remarque : Comme les souris préfèrent tubulaires, terriers d’un diamètre de 68 mm peuvent être utilisés tel que décrit par le diacre¹⁶.
2. Placer le terrier rempli avec des boulettes de nourriture dans la cage 5 jours avant l’intervention pour l’acclimatation.
   Remarque : L’unité de distribution alimentaire régulière dans la cage ne doit pas être vidée mais doit rester aussi remplie de boulettes, comme les souris sont utilisées pour cela.
3. Effectuer le test deux fois, deux jours avant l’intervention (de base) ; effectuer la dernière procédure de post 30 min aussi bien.
   1. Laissez la souris s’habituer pendant au moins 30 min à la cage d’observation où ont été prises les photographies pour la MGS.
   2. Placez la bouteille d’eau en plastique remplie de boulettes parallèles à la paroi arrière de la cage d’observation.
   3. Peser les boulettes (g) restant dans le terrier après 2 h.
4. Calculer le poids des boulettes de nourriture enlevée du terrier de souris par rapport au poids initial (%).

5. 24-h période d’observation

Remarque : Les souris sont logés individuellement, comme indiqué au point 2.2. (Figure 5), pour une période de 24 h, afin de mesurer les aliments apport, activité maison cage, nid comportement de compilation et les niveaux de la FCM. L’observation de 24 h a lieu deux fois par : (i) 2 jours avant l’intervention pour des niveaux de référence, (ii) le jour de la procédure.

1. Prise alimentaire
   1. Peser les souris à intervalles réguliers (par exemple 2 jours avant l’anesthésie, immédiatement avant l’anesthésie, 2 jours après l’anesthésie et toutes les semaines après l’anesthésie), afin d’évaluer les modifications du poids corporel (partie de la feuille de match).
      Remarque : Le poids corporel est nécessaire pour calculer la prise alimentaire par gramme de poids corporel. Prise d’eau peut aussi se mesurer au cours de la période d’observation de 24 h. La prise alimentaire est diminuée, bien-être peut être compromise.
   2. Déterminer le poids initial du régime alimentaire standard (grammes) fourni dans l’unité d’alimentation de la cage (environ 100 g).
   3. Déterminer le poids du régime alimentaire standard à la fin de la période d’observation de 24 h.
   4. Scan du côté de la cage sous l’unité d’aliments soigneusement pour les déversements de produits alimentaires et ajouter n’importe quel granulés de nourriture supplémentaire constaté que le poids des boulettes de nourriture restant dans l’unité d’alimentation.
   5. Calculer la prise alimentaire par unité de poids corporel.
2. Activité de cage maison
   Remarque : Les instructions suivantes font référence à l’utilisation d’un capteur infrarouge (voir table des matières), mais l’activité maison cage pouvant également être évaluée par des programmes alternatifs. Déviation de l’activité de la maison cage de niveaux de contrôle (par exemple hypoactivité, hyperactivité) peut être un signe de bien-être avec facultés affaiblies.
   1. Démarrez le programme.
   2. Choisir un intervalle d’échantillonnage de 1 min et un temps d’acquisition de 24 h, ce qui signifie que les impulsions sont enregistrées chaque minute pendant 24 h.
      Remarque : Si l’expérimentateur entre dans la salle plusieurs fois après démarrage de l’enregistrement, utilisez uniquement les données de périodes, lorsque la souris n’étaient pas perturbés (c'est-à-dire au cours de la période d’obscurité).
   3. Résumer des intervalles de 10 min d’impulsions.
   4. Calculer l’aire sous la courbe de temps (impulsions × min).
3. Comportement de construction de nid
   NOTE : Les nids complexes et de hautes peuvent servir comme indicateur de bien-être.
   1. Placez un coton carré nestlet (voir Table des matières) avec un poids donnée (p. ex. 2,0 g) au milieu de la cage.
   2. Marquer le nid sur une échelle de 5 points (voir ci-dessous) selon diacre¹⁴ le lendemain matin, environ 2 h après que le voyant s’allume. Peser tous les morceaux qui sont au moins 5 % du poids initial nestlet nestlet untorn. Marquer les nids comme suit¹⁴
      1. Attribuer le score de « 1 » si 90 % de la nestlet intact.
      2. Attribuer le score de « 2 » si elle est intacte de 50 à 90 %.
      3. Affecter marquer « 3 » Si 50-90 % de la nestlet est déchiqueté.
      4. Assigner score « 4 » Si plus de 90 % est râpé mais nid est plat, et moins de 50 % de sa circonférence est supérieure à la hauteur du corps souris lorsque courbée vers le haut.
      5. Affecter marquer « 5 » Si plus de 90 % nestlet est déchiqueté et nid est élevé et plus de 50 % de sa circonférence est supérieure à la hauteur du corps d’une souris recroquevillée.
4. Métabolites fécaux corticostérone
   NOTE : Augmentations de FCM au-dessus du niveau de contrôle reflètent des niveaux de stress aigu au cours de la période postanesthetic de 24 h.
   1. Collecter toutes les pelotes fécales sèches de la cage à l’aide de pinces à la fin de la période d’observation de 24 h et éliminer des granulés humides contaminés par l’urine.
   2. Extraire le FCM selon Palme et al. ¹⁷, comme suit.
      1. Échantillons de matières fécales secs à une température de 60-70 ° C.
      2. Homogénéiser les échantillons de matières fécales à l’aide d’un mortier.
      3. Agiter une partie aliquote de 0,05 g avec 1 mL de méthanol à 80 % dans un tube à centrifuger pendant 30 min dans un vortex multiples.
      4. Centrifuger les échantillons à 2500 x g pendant 15 min.
      5. Pipeter 0,5 mL du surnageant dans un autre tube à centrifuger.
      6. Stocker les échantillons fécaux (et extraits) à un minimum de-18 ° C.
      7. Analyser la FCM à l’aide d’un 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one enzyme immunoassay (EIE)^18,19 ou un autre EIE entièrement validée.
   3. Calculer le pourcentage de variation des concentrations de la FCM par rapport à des concentrations de référence FCM.

6. libre paradigme exploratoire

1. Prendre la cage hors du rack et placez-le sur une surface de la table à la fin de la période d’observation de 24 h.
2. Placer un haut de cage maillées (sans les bouteilles d’eau ni de nourriture) dans la cage à un angle de 45° pour le plus long côté de la cage.
   Remarque : Ne pas détruire le nid, qui sert une cachette pour la souris, mais Placez le dessus de la cage en diagonale au-dessus du nid.
3. Surveiller ou enregistrer les souris pendant 10 min à une distance d’environ 1,5 m.
   1. Démarrer la minuterie.
   2. Notez toutes les fois où la souris monte sur le dessus de la cage (avec 4 pattes sur le dessus de la cage) ou quitte le haut de la cage (avec une ou plusieurs pattes sur le sol de la cage).
      Remarque : Certaines souris peuvent grimper sur le dessus de la cage et laissez-le pour marcher le long du bord de la cage. Certaines souris aussi arrière sur le dessus de la cage. Traiter ces cas comme si les souris étaient toujours sur le dessus de la cage.
4. Évaluer les paramètres suivant Bert et al. ²⁰.
   1. Analyser la latence de la première exploration (en secondes).
   2. Analyser le nombre d’explorations.
   3. Analyser la durée (en secondes) de l’exploration.
      Remarque : Une latence élevée pour une faible durée totale d’exploration première exploration et un faible nombre d’explorations peut indiquer des niveaux plus élevés d’anxiété trait.

Résultats

Ce protocole a été développé pour évaluer le bien-être des souris C57BL/6JRj suite à une expérience unique de l’anesthésie isoflurane (une seule séance de 45min anesthésie, n = 13 femelles) ou anesthésie isoflurane répétées (six séances de 45min anesthésie avec 3-4 jours entre les sessions de l’anesthésie, n = 13 femelles) par rapport au bien-être des souris témoins (n = 6 femelles)¹⁰, qui a reçu sans anesthésie, mais ont été testés sel...

Discussion

Le protocole a été développé pour évaluer le bien-être des souris C57BL/6JRj qui a reçu une seule anesthésie ou anesthésie isoflurane répétées. Les résultats confirment qui teste des comportements de luxe, mais aussi d’autres mesures (par exemple le paradigme exploratoire gratuit, MSG, la prise alimentaire fouisseur) étaient des méthodes sensibles permettant d’évaluer le bien-être. L’anesthésie isoflurane répétés causés des effets à court terme sur le comportement de caractère lié ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH	1214
InfraMot - Sensore Units	TSE Systems	302015-SENS
InfraMot - Control Units	TSE Systems	302015-C/16
InfraMot - Software	TSE Systems	302015-S
Nestlet N	Ancare - Plexx	NES3600
Camera EOS 350D	Canon