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Résumé

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Résumé

La constitution génétique des acides aminés non canoniques (ANAC) via la suppression de codon stop ambre est une technique puissante pour installer des sondes artificiels et réactives moitiés sur protéines directement dans les cellules vivantes. Chaque ncAA est constituée par deux (RAA) orthogonal dédié suppresseur-/ amino-acyl-ARNt-synthétase de tRNA qui est importé dans l’organisme hôte. L’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut diffèrent grandement et insatisfaisante dans certains cas. Orthogonaux paires peuvent être améliorées en manipulant les RAA ou l’ARNt. Cependant, évolution dirigée des ARNt ou RAA à l’aide de grandes bibliothèques et les méthodes de sélection morts/vivants ne sont pas réalisables dans les cellules de mammifères. Est présenté ici, un essai basés sur la fluorescence facile et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales en cellules mammifères. Le test permet de dépistage des dizaines ou des centaines de variantes de RAA/ARNt avec un effort modéré et dans un délai raisonnable. Utilisation de ce test pour générer de nouveaux ARNt qui améliorent considérablement l’efficacité du système orthogonal pyrrolysine est décrite, ainsi que l’application de l’ANAC à l’étude des protéines G récepteurs couplés (RCPG), qui contestent les objets de la ncAA mutagenèse. Tout d’abord, en intégrant systématiquement les une ncAA photo-réticulation tout au long de la surface extracellulaire d’un récepteur, les sites de liaison des ligands différents sur le récepteur intact sont mappés directement dans les cellules vivantes. Deuxième, incorpore un RCPG de dernière génération ANAC, ultrarapide récepteur sans catalyseur marquage avec un colorant fluorescent est démontrée, qui exploite bioorthogonal cycloaddition contrainte-favorisé inverse Diels Alder (SPIEDAC) sur les cellules vivantes. ANAC peut être généralement appliquée à n’importe quelle protéine indépendamment sur sa taille, la méthode est d’intérêt général pour un certain nombre d’applications. En outre, incorporation de ncAA ne nécessite pas d’aucun équipement spécial et est facilement effectuée dans les laboratoires de biochimie standard.

Introduction

L’incorporation génétique des sondes chimiques dans les protéines est une méthode puissante pour faciliter l’étude des aspects structurels et dynamiques de la fonction des protéines directement dans le contexte autochtone de la cellules vivantes. De nos jours, des centaines d’amino-acides non canoniques (ANAC) équipés de groupes chimiques plus disparates peuvent être relativement incorporés dans les protéines par biosynthèse1,2,3,4. Entre eux, on trouve photosensibles ANAC comme photo-agents réticulants5, mis en cage-photo6,7,8,9 et photo-commutable acides aminés10, 11, acides aminés portant tendues alcènes et alcynes pour bioorthogonal sans catalyseur chimie2,12,13,14,15,16 ,,17acides aminés transportant dansyl18, coumarine9,19et fluorophores21 prodan20,et acides aminés équipés d’autres sondes biophysiques comme Bien que le post traductionnelle modifications1,2,3,4,22,23,24,25.

Le codage génétique d’un ncAA est activé par un dédié amino-acyl--synthétase de tRNA (RAA) couplé à un suppresseur-tRNA apparenté, qui incorpore la ncAA en réponse à un codon stop ambre pendant la synthèse ribosomique ordinaire. paires de ncAARS/ARNt sont conçus afin d’être orthogonal dans l’organisme hôte, c'est-à-dire pas la diaphonie avec les paires endogènes. La technique est bien établie en hôtes procaryotes et eucaryotes et cellules facilement applicables aux mammifères. Paires pour l’incorporation de la ncAA en cellules mammifères reposent sur trois principaux systèmes orthogonaux : le système de tyrosyl, qui combine la TyrRS d’e. coli26 avec un suppresseur de tyrosyl ambre de b. stearothermophilus27 (Ec TyrRS / paire YamBst), l’e. coli leucyl système (EcLeuRS/ARNtLeuCUA paire)6,18,28 et le système de pyrrolysyl d’archaea (PylRS/ARNt Pyl paire)3, auquel cas l’ARNtPyl est un suppresseur de l’ambre naturel. En général, chaque ncAA est reconnu par un ncAARS spécialisées. Selon la structure de la ncAA, le ncAARS est obtenu par évolution dirigée de la TyrRS, LeuRS ou PylRS, bien que certains synthétases peuvent accepter plusieurs ncAA.

La paire orthogonale est importée dans les cellules en utilisant simplement un vecteur plasmidique. Plus efficaces et communes de plasmides sont bicistronique et codent pour la synthétase et l’ARNt formant la paire orthogonale29. Un deuxième plasmide codant pour la protéine d’intérêt portant un codon ambre sur le site désigné pour la modification est co-transfectée. La ncAA est simplement ajouté au milieu de croissance cellulaire. Cependant, différents groupes spécialisés utilisent souvent les différentes variantes de constructions de plasmide même pour l’incorporation de la ncAA même. Constructions diffèrent par l’arrangement des gènes dans le vecteur, le type de la synthétase, l’utilisation de codon dans le gène de la synthétase, l’utilisation de promoteur, la variante de l’ARNt et le nombre de cassettes d’expression ARNt. En outre, l’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut varier considérablement en raison de l’efficacité catalytique différente les synthétases différentes, la qualité de l’ARNt et autres facteurs30. Par conséquent, il est important de disposer d’une méthode rapide et fiable pour évaluer l’efficacité d’une paire orthogonale, à choisir le système le plus approprié pour une application souhaitée tant pour effectuer certaines étapes d’optimisation qui améliorent l’expression protéique globale rendements.

Nous avons établi une analyse axée sur la fluorescence simple et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales29 (Figure 1). Dans l’essai, les cellules sont transfectées conjointement avec le plasmide codant pour la paire orthogonale, ainsi que d’un plasmide de journaliste bicistronique codant pour la protéine fluorescente verte portant un codon d’arrêt ambre à une position permissive (EGFPTAG) et la gène mCherry. Fluorescence rouge et verte de lysats de cellules entières sont interprétées dans des canaux séparés sur un lecteur dans une plaque à 96 puits. L’intensité de la fluorescence verte est directement en corrélation avec l’efficacité de la répression ambre, alors que l’intensité de la fluorescence rouge donne une estimation directe de la taille de l’échantillon mesuré et l’efficacité de transfection. En ce qui concerne des études similaires basées sur la fluorescence assistée cellule triant (FACS) lecture31,32, le test donne une évaluation immédiate et complète de l’expression protéique dans la population de cellules entières, ce qui est plus représentatives des conditions expérimentales usuelles et propose une acquisition de données plus facile et le traitement avec le logiciel standard. Dans l’ensemble, le principal avantage du dosage est qu’un support pour un grand nombre d’échantillons peut être analysé en parallèle. À l’aide de ce test, nous avons projeté une bibliothèque conçue rationnellement des ARNt-suppresseur pour améliorer l’efficacité du système orthogonal Pyl30. Cet ouvrage décrit le protocole expérimental pour effectuer ce test et montrent des exemples de son application, y compris l’optimisation de la paire orthogonale pour l’incorporation de la photo-réticulation ncAA p-azido-L-phénylalanine (Azi) et la comparaison des efficacité de l’incorporation de différents acides aminés (Figure 2).

Au cours des dernières années, outils de ncAA sont sont avérées très puissants pour étudier la structure et les aspects fonctionnels de la G-protéine couplée récepteurs (RCPG)33,34,35,,du3637 , 38. chez les humains, les RCPG forment une grande famille de récepteurs membranaires (800 membres) et représentent les principales cibles des médicaments thérapeutiques. Il est toujours difficile de directe caractérisation structurale des RCPG et méthodes biochimiques complémentaires sont très nécessaires pour leur enquête. Nous avons mis au point l’utilisation de photo-réticulation ANAC pour cartographier les surfaces GPCR et découvrez le ligand liant poches34. Est-ce que nous en utilisant notre système optimisé pour l’incorporation de l’Azi, systématiquement intégrées Azi dans tout le domaine de juxtamembrane entier d’un RCPG directement dans les cellules de mammifères vivants. Lors de l’irradiation UV, Azi forme une espèce de nitrène fortement réactif qui capte par covalence molécules voisines. Quand le ligand est ajouté au système, Azi sert une sonde de proximité à révéler quels postes du récepteur se rapprochent du ligand lié. De cette façon, le mode de liaison de l’hormone de neuropeptide urocortine I (Ucn1) sur le récepteur de la classe B GPCR corticotropin-releasing-factor de type 1 (CRF1R)33 a d’abord été dévoilé. Dernièrement, nous avons divulgué modes de liaison distincte des agonistes et antagonistes sur les mêmes récepteurs38. Une approche similaire a été appliquée par les autres pour révéler des orthosteric et des sites de liaison allostérique d’autres peptides et des ligands de petites molécules autres RCPG39,40,41,42. Ce manuscrit décrit le protocole expérimental appliqué dans notre laboratoire photo-réticulation cartographie des surfaces des RCPG. La méthode est relativement rapide, simple et ne nécessite pas d’aucun équipement spécial, afin qu’elle s’applique dans les laboratoires de biochimie standard. Ce qui est important, l’approche fournit un outil précieux non seulement pour identifier les sites de liaison de ligand où les données structurales 3D sont rares, mais aussi pour compléter les données in vitro existantes avec les informations de récepteurs entièrement post-traductionnellement modifiées dans le environnement physiologique de la cellule en direct.

Le développement récent de nouveaux ANAC portant sur les côté chaîne des groupes chimiques convenant ultra-rapide sans catalyseur bioorthogonal chimie a ouvert la possibilité d’installer des fluorophores de dernière génération pour l’imagerie de Super-résolution en protéines directement sur la vie des cellules de2,43. Ces ancrages chimiques comprennent tendue cyclooctyne SCOK14, nonyne bicyclo [6.1.0] BCNK12,17et trans-cyclooctènes de TCO * K13,15,17 entre autres ANAC héberger un norbornène16,17,44 ou le cyclopropène45,46 portion. ANAC encombrants pour la chimie de bioorthogonal est intégrées par une variante de le PylRS généralement décrit comme PylRSAF (indiquant la mutation Y271A et Y349F en PylRS de M. barkeri ), ainsi que par d’autres ad hoc a évolué de ncAARSs17 , 44. les ancres bioorthogonal réagissent avec tetrazine réactifs47 par cycloaddition de Diels-Alder inverse électron-demande pour donner des rendements élevés et étiquetage dans quelques minutes43,48. Cependant, application de cette approche puissante pour étiquette RCPG a été difficile en raison d’une faible efficacité globale du système orthogonal ncAA incorporation. En utilisant notre système amélioré de Pyl, nous avons récemment démontré incorporation de haut rendement de ces acides aminés dans les RCPG et ultrarapide GPCR étiquetage sur la surface des cellules de mammifères vivants30. Récepteurs marqués étaient encore fonctionnels, car ils physiologiquement intériorisé dès l’activation du récepteur avec un agoniste. Le protocole expérimental pour l’incorporation de bioorthogonal ancres dans les RCPG et les étapes suivantes d’étiquetage sont décrites ici. Équiper les RCPG avec des fluorophores lumineux petits est la première étape fondamentale vers l’étude de la dynamique des structures RCPG dans les cellules vivantes par l’intermédiaire de techniques de microscopie avancées.

Protocole

1. fluorescence-based Screening des efficacités d’Incorporation (Figure 1)

  1. Maintenir les cellules HEK293 dans le milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM ; taux de glycémie élevé, 4 mM de glutamine, pyruvate) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.
  2. Les cellules des graines la veille de la transfection.
    1. Détacher les cellules pendant 5 min à 37 ° C à 0.05 % trypsine/PBS additionné de 0,5 mM EDTA. Utiliser 1 mL trypsine/EDTA pour un plat de 10 cm. Étancher avec 10 volumes de milieu complet et remettre en suspension les cellules de pipetage. Compter le nombre de cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre49.
    2. Semences 6.0 x 105 HEK293 cellules par puits de plaques 6 puits dans 2 mL de milieu de croissance complète. Préparer les puits autant comme le nombre d’échantillons et deux puits supplémentaires pour l’EGFP sauvage et un échantillon transfectées mock, respectivement.
  3. Contrôler la confluence (superficie occupée par les cellules) sous un microscope. Transfecter cellules à confluence ~ 70 % utilisant le réactif de POLYÉTHYLÈNEIMINE (PEI).
    1. 1h avant la transfection, ajouter la quantité appropriée de la solution fraîchement préparée ncAA dans toutes les loges pour une concentration finale de ncAA de 0,25 à 0,5 mM. Ajouter la ncAA dans toutes les loges, y compris du contrôle positif de type sauvage et les cellules transfectées mock, afin d’éviter des différences de signaux de fluorescence qui pourraient être causés par les effets de la ncAA sur la croissance cellulaire.
      Remarque : Pour préparer les solutions, dissoudre la ncAA de 0,1 à 0,5 M à l’aide de 0,2 à 0,5 M de NaOH. Toutefois, certains ANAC peut exiger initiale solubilisation dans le DMSO ou neutralisation en quatre volumes de 1 M HEPES (pH 7,4) avant utilisation. Communément, le fabricant recommande un protocole pour préparer une solution.
    2. Dans un tube de microcentrifuge, mélanger 1 µg d’ADN plasmide codant la paire ncAARS/ARNt à tester avec 1 µg de reporter l’ADN plasmidique (183TAG- mCherry pcDNA3.0-EGFP). Dans des tubes distincts, préparer une transfection identique à l’aide de la référence de type sauvage EGFP et une transfection simulée.
      Remarque : Nombre d’exemplaires de la cassette de tRNA intégré dans le plasmide codant pour la paire ncAARS/ARNt dépend de l’application. Afin de faciliter le clonage, 1 exemplaire de l’ARNt est recommandé lors de dépistage différents ARNt, tandis que 4 exemplaires sont recommandés (bien que pas strictement nécessaire) lorsque ncAARS différents tests ou l’incorporation de l’ANAC différentes de la même paire orthogonale.
    3. Chaque tube contenant l’ADN ajouter 100 µL de lactate une solution saline tamponnée (LBS) contenant du lactate de sodium 20 mM à pH 4,0 et 150 mM NaCl. Mélanger brièvement.
    4. Dans chaque tube contenant l’ADN en LBS ajouter 6 µL de 1 µg/µL PEI en LBS (ratio PEI/ADN = 3/1 w/w) et vortex immédiatement. Incuber à RT pendant 10-15 min.
    5. Prendre un milieu cellulaire 400 µL de chaque puits et ajoutez-le au mélange ADN-PEI pour neutraliser le pH. Dribble le mélange de l’ADN dans les cellules.
      Remarque : DMEM contient habituellement rouge de phénol comme indicateur de pH. Au cours de l’étape de neutralisation la couleur du mélange ajouté dans le tube passe du jaune (acide) au rouge (neutre). Bien que formant des complexes ADN lb à pH acide donne le plus haut des rendements transfection50, complexes ADN-PEI peuvent alternativement être formés directement à un pH de 7,4 (par exemple dans le milieu sans sérum DMEM). Si vous utilisez DMEM pour former des complexes ADN, sauter l’étape de neutralisation 1.3.5. Dans tous les cas, il est essentiel qu’aucun sérum n’est présent dans le mélange en formant des complexes.
  4. Récolter après transfection de cellules 48 h.
    1. Aspirer le milieu et rincer les cellules une fois avec 2 mL de PBS préchauffé (37 ° C). Ajouter 800 µL de PBS additionné de 0,5 mM EDTA et incuber pendant 20 min à 37 ° C. Détacher et suspendre les cellules par pipetage de haut en bas.
    2. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL contenant 200 µL PBS additionné de 5 mM MgCl2.
    3. Centrifuger pendant 2 min à 800 x g et éliminer le surnageant.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Dans ce cas, flash-solidification des granulés dans le liquide N2 et conserver à-80 ° C pendant environ un mois. Portez toujours des lunettes de protection.
  5. Ajouter 100 µL de tampon de lyse Tris (50 mM Tris-HCl de pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % X-100 Triton, EDTA 1 mM et fraîchement ajouté PMSF) pour les granules cellulaires et incuber sur glace pendant 30 min. Pour faciliter la lyse, vortex toutes les 5 min.
  6. Tournez en bas les débris cellulaires pendant 10 min à 4 ° C et 14 000 x g et transférer 90 µL du liquide surnageant dans noirs plaques de 96 puits. Mesurer la fluorescence EGFP et mCherry à l’aide d’un lecteur équipé d’un module de fluorescence.
    Remarque : Utiliser des filtres appropriés d’excitation et d’émission pour EGFP (λabs: 488 nm, λem: 509 nm) et mCherry (λabs: 588 nm, λem: 611 nm). Valeurs mesurées de EGFP seront étendra sur une plage comprise entre la valeur minimale obtenue des cellules transfectées mock et une valeur maximale, qui provient habituellement de type sauvage EGFP. Prendre soin de mettre en place la fenêtre de mesure correcte de l’instrument.
  7. L’efficacité de l’incorporation de la ncAA est calculée comme le rapport entre la fluorescence de l’échantillon et la fluorescence provenant d’expression du type sauvage EGFP. Toutes les valeurs sont normalisées à fluorescence mCherry.
    figure-protocol-6140

2. génétique Incorporation d’ANAC RCPG pour Photo-réticulation cartographie des Interactions de Ligand-RCPG (Figure 3)

  1. Maintenir les cellules HEK293T DMEM supplémenté de 10 % (v/v) de SVF, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.
  2. Cellules des graines la veille de la transfection.
    1. Détacher les cellules pendant 5 min à 37 ° C à 0.05 % trypsine/PBS additionné de 0,5 mM EDTA. Utiliser 1 mL trypsine/EDTA pour un plat de 10 cm. Étancher avec 10 volumes de milieu complet et remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas. Compter le nombre de cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre49.
    2. Semences 5.0 x 105 293 t cellules par puits dans 2 mL de milieu de croissance complète en plaques 6 puits. Pour chaque poste à être projeté, préparer 1 bien par le ligand, plus un puits pour la liaison contrôle33,38. Un puits d’appoint à transfected avec le récepteur de type sauvage (wt) peuvent être inclus pour vérifier le niveau d’expression du mutant.
  3. Le lendemain, contrôler la confluence (superficie occupée par les cellules) sous un microscope. Transfecter cellules à confluence d’environ 70 % à l’aide de PEI.
    1. 1h avant la transfection, ajouter Azi dans toutes les loges à une concentration finale de 0,5 mM.
      1. Préparer une solution 0,5 M de Azi. Par plaque 6 puits, peser 1,2 mg Azi dans un tube et dissoudre dans 15 µL 0,5 M NaOH. Diluer la solution mère en milieu complet de 1,2 mL et ajouter 200 µL du mélange dans chaque puits.
        Remarque : Préparer une solution fraîche de Azi pour chaque expérience. La portion de l’azoture a une demi-vie courte en solution aqueuse, en particulier à pH basique, et le AziRS intègre l’intact, mais aussi la forme dégradée.
    2. Transfecter un montant total de 2 µg ADN / puits : 1 µg de plasmide codant pour la GRCP drapeau-le tag portant un codon TAG à la position désirée et 1 µg du plasmide codant pour la paire orthogonale dédiée à Azi (E2AziRS51 et 4 copies de l’apparenté suppresseur-tRNA BstYam)33,38.
      Remarque : Lorsque vous incluez une comparaison de poids pour vérifier les niveaux d’expression, transfecter un montant inférieur de l’ADN de plasmide pour le récepteur de wt. Selon le GPCR, 0,2 à 0,5 µg de plasmide codant les niveaux semblables de rendement du récepteur wt 1,0 µg du plasmide mutant. Transfecter la même quantité d’ADN dans tous les puits, remplissant l’ADN manquant avec un simulacre (par exemple un vecteur vide).
    3. Procédez comme décrit dans 1.3.3-1.3.5.
    4. transfection après 48 h, continuez avec l’étape 2.4 pour photo-réticulation des ligands ou passez à l’étape 2.5 pour récolte directe et l’analyse de contrôle de l’expression des récepteurs.
  4. Photo-réticulation du ligand.
    1. Préparer une solution ligand 1 000 x. Dissoudre le ligand de peptide à une concentration de 100 µM dans le DMSO.
      Remarque : La concentration de ligand dépend de la constante de dissociation KD de l’interaction ligand-RCPG. Une concentration finale de 100 x KD est recommandable. Si le ligand de peptide est un sel d’acide trifluoroacétique (TFA), considérer le poids du TFA lors du calcul de la masse moléculaire (1 x TFA par les acides aminés basiques du peptide). Aussi, pensez que les peptides sont en général hygroscopique. Éviter le gel répétée de poudre de peptide et n’ouvrez jamais un récipient de peptide jusqu'à ce qu’il n’a pas atteint la température ambiante.
    2. Diluer la solution mère ligand 1 : 1 000 dans le tampon de liaison composé de 0,1 % de BSA, 0,01 % Triton X 100, 5 mM MgCl2 dans un tampon HEPES dissociation (HDB) contenant de l’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 12,5 mM 4 (HEPES)-HCl pH 7,4, 140 mM NaCl et 5 mM KCl. Prepare 1 mL par mutant Azi-RCPG. Remplacer le milieu cellulaire avec 1 mL de la solution de ligand. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
      Remarque : Régler le temps d’incubation de la GRCP spécifique, comptabilité d’internalisation de cinétique et récepteur ligand. Prolonger la période d’incubation n’améliore pas les rendements de réticulation.
    3. Irradier les échantillons pendant 20 min dans une RETICULATION UV 365 nm avec 5 x 8 W tubes et ~ 5 cm de distance aux cellules. Détacher les cellules en pipettant également et de les transférer dans un tube de réaction de 1,5 mL. Les cellules pendant 3 min à 800 g de granule et éliminer le surnageant.
    4. Dissoudre un comprimé d’inhibiteur de protéase (PI) en cocktail dans 1 mL 25 mM EDTA/H2O pour faire une solution mère de 50 x. Aliquoter le PI solution mère et conserver à-20 ° C. Diluer le stock 50 x 01:25 dans HDB et remettre en suspension les granules cellulaires dans 50 µL de 2 x PI en HDB. Flash-gel les cellules dans le liquide N2.
      Remarque : Porter des lunettes de protection. À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pour environ un mois. Passez à l’étape 2.6.
  5. Matériel de récolte directe de cellules.
    1. Aspirez le milieu. Ajouter 800 µL de 0,5 mM EDTA en HDB. Incuber pendant 10 min à la droite ou sur la glace.
    2. Détacher les cellules par pipetage de haut en bas et de les transférer dans un tube de réaction de 1,5 mL. Ajouter 200 µL de 5 mM MgCl2 en HDB. Les cellules pendant 3 min à 800 g de granule et éliminer le surnageant.
    3. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 50 µL de 2 x PI en HDB et flash gel liquide N2. Porter des lunettes de protection.
      Remarque : À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pendant environ 1 mois.
  6. Lyse cellulaire.
    1. Décongeler les cellules dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 à 45 s et vortex brièvement. Conserver les échantillons froid à l’avenir. Membranes de pellet à 2 500 x g et 4 ° C pendant 10 min. éliminer le surnageant, qui contient la majeure partie des protéines cytosoliques.
    2. Remettre en suspension les pellets dans 50 µL de tampon de lyse HEPES contenant 50 mM HEPES-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, glycérol à 10 %, 1 % X-100 Triton, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 millimètre DTT et fraîchement ajouté 2 x PI cocktail. Mélanger soigneusement. Lyse des cellules 30 min sur glace et vortex toutes les 5 min.
    3. Tournez en bas les débris cellulaires pendant 10 min à 14 000 x g et 4 ° C. Transférer immédiatement le surnageant dans un tube de réaction fraîches.
      Remarque : Procéder à l’analyse tout de suite. Les lysats peuvent être stockés à-20 ° C, cependant, chaque cycle gel-dégel altère la qualité des résultats.
  7. Analyse par Western blot.
    1. Préparation des échantillons, prendre 3-5 µL de lysat et le remplir jusqu'à 7 µL avec H2O. Ajouter 2 µL 1 M TNT et 3 µL de tampon d’échantillon 4 x contenant des pH de 63 mM Tris-HCl 6,8, SDS de 2 %, 10 % de glycérol et 0,04 % bromophénol bleu. Incuber 30 min à 37 ° C.
    2. Quand le GPCR est glycosylée et faibles ou maculées de bandes est un problème, échantillons de déglycosyler avec PNGase F pour augmenter l’intensité du signal et d’aiguiser les bandes. Utiliser les 3-5 µL de lysat et déglycosyler dans un volume total de 10 µL suivant le protocole du fournisseur. Ajouter 3 µL 4 x tampon échantillon.
      Remarque : Les protéines membranaires sont souvent glycosylée dans plusieurs sites et les États, qui altère la qualité de la résolution en analyse SDS-PAGE. Toutefois, ne pas déglycosyler les échantillons pour l’analyse du niveau expression des mutants Azi-GPCR utilisant des anticorps anti-drapeau parce qu’il est pertinent d’évaluer la partie de l’entièrement glycosylée, mature récepteurs à la surface cellulaire.
    3. Résoudre les échantillons par SDS-PAGE standard et épongez les protéines de transfert sur une membrane de PVDF.
      Mise en garde : L’acrylamide est neurotoxique. Porter des gants et des lunettes de protection.
    4. Bloquer la membrane pour 1 h à RT ou toute une nuit à 4 ° C à 5 % de lait écrémé dans TBS-T contenant 20 mM Tris-HCl à pH 7,4, 0,15 M de NaCl et 0,1 % Tween 20.
    5. La membrane de la sonde avec un anticorps anti-ligand, suivi de l’anticorps secondaire conjugué HRP. Laver dans l’intervalle à SCT-T. Pour détecter le niveau d’expression de l’Azi-RCPG, sonder la membrane avec un anticorps HRP commerciale (voir Table des matières).
    6. Effectuer la réaction de chimiluminescence améliorée (ECL) utilisant le réactif ECL fait maison et détecter des signaux pendant 5 min dans le noir.

3. ultrarapide Bioorthogonal étiquetage des RCPG sur cellules de mammifères vivants

Remarque : Le protocole est optimisé pour les 4 puits lamelle couvre-objet (évidement = 2,2 cm2). Pour des tailles bien différentes, le protocole doit être dimensionnée en conséquence.

  1. Revêtement de surface des lames de microscope. Réaliser l’ensemble de la procédure sous hotte stérile.
    1. Préparer un bromhydrate de poly-D-lysine (MW = 500-550 kDa) solution-mère (PDL) à une concentration de 1 mg/mL dans le tampon de borate de 50 mM (pH 8,5). Conserver à 4 ° C jusqu'à 6 mois. Ne pas congeler.
    2. Diluer le PDL solution mère 01:40 dans l’eau ultra pure stérile à une concentration finale de 25 µg/mL (solution de travail), puis filtrer la solution sur un filtre stérile de 0,22 µm.
      Remarque : La solution de travail peut être conservée à 4 ° C pendant 3 mois.
    3. Couvrir entièrement le fond de chaque puits de la lame de microscope avec 500 µL de solution de travail PDL. Incuber pendant 20 min à RT et aspirer la solution de travail PDL.
      Remarque : La solution de travail PDL peut être utilisée jusqu'à trois fois. Si la solution doit être réutilisé, transférer la solution utilisée de diapositives couchés dans un tube stérile fraîche et étiqueter le tube en conséquence. Ne jamais mélanger la solution recyclée avec une solution fraîche.
    4. Rincer chaque bien 3 x avec ~ 700 µl d’eau ultra pure stérile et laisser sécher pendant au moins 1 h.
      Remarque : Il est très important de rincer les puits avec précision, comme les résidus de la solution PDL sont toxiques pour les cellules. Les diapositives enduits peuvent être utilisés immédiatement pour la microscopie ou conserver jusqu'à une semaine à 4 ° C.
  2. Maintenir les cellules HEK293T DMEM supplémenté de 10 % (v/v) de SVF, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.
  3. Cellules des graines la veille de la transfection.
    1. Détacher les cellules pendant 5 min à 37 ° C à 0.05 % trypsine/PBS additionné de 0,5 mM EDTA. Utiliser 1 mL trypsine/EDTA pour un plat de 10 cm. Étancher avec 10 volumes de milieu complet et remettre en suspension les cellules de pipetage. Compter le nombre de cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre49.
    2. Semences 1,0 x 105 HEK293T cellules / puits (zone 2,2 cm²) dans 600 µL colorant libre DMEM complet.
      Remarque : Pour des fins d’imagerie documentaire, il est très commode travailler dès le début dans un milieu qui ne contient-elle aucun colorant. Colorant libre DMEM formulations sont disponibles dans le commerce.
  4. Contrôler la confluence (superficie occupée par les cellules) sous un microscope et transfecter les cellules à confluence d’environ 70 % à l’aide d’un réactif à base de lipides transfection.
    1. 1 h avant la transfection, préparer une solution fraîche de 100 mM du TCO * K à 0,2 M NaOH et 15 % (v/v) de DMSO.
    2. Par puits, mélanger 3 µl de l’arr * K solution-mère avec 12 µL de 1 M HEPES pH 7,4. Ajouter doucement la solution dans les puits pour un coût total de possession définitive * K concentration de 0,5 mM.
    3. Préparer un montant total de 500 ng ADN / puits. Dans un tube de microcentrifuge, diluer 200 ng de pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng de plasmide codant pour la MoPylRSAF/tRNAPyl paire orthogonale (quatre cassettes de l’ARNtM15) et 100 ng de pcDNA3.1_Arrestin3 plasmide dans 50 µL de milieu (colorant libre, sans sérum, antibiotique libre).
      Remarque : En général, co transfection de Arrestin n’est pas nécessaire d’observer l’internalisation des RCPG. Cependant, Arrestin3 co-transfection accélère internalisation des CRF1R, qui est très pratique lorsqu’on analyse l’internalisation de nombreux mutants.
    4. Diluer 1,25 ml du réactif base de lipides transfection (2,5 µL par 1 µg d’ADN) dans 50 µL de milieu (colorant libre, sans sérum, antibiotique libre) et ajouter la solution au mélange de l’ADN. Vortex immédiatement et incuber pendant 5-10 min des complexes ADN RT. Add lipidiques aux cellules.
      Remarque : Dans notre expérience, la morphologie des cellules transfectées avec base de lipides transfection ressemble plus physiologique par rapport à celle des cellules transfectées avec PEI. Comme PEI donne une plus grande efficacité de transfection, PEI doit être préférée pour des utilisations en aval comme la tache occidentale, tandis que les lipides à base de transfection est un meilleur choix à transfecter de cellules pour des expériences d’imagerie.
  5. étiquette de 24 h après la transfection, le récepteur avec les colorants fluorescents.
    1. Préparer une solution teinture-tetrazine 0,5 mM dans le DMSO et un 10 mg/mL d’ADN coloration teinture solution mère ultra purs H2O.
    2. Transférer 100 µL de milieu de chaque puits dans un tube de réaction de 1,5 mL. Ajouter 1,8 µL de la solution mère de colorant-tetrazine et 0,3 µL de l’ADN de coloration de la solution mère de colorant. Transférer le support contenant les colorants vers le puits et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
      Remarque : Tetrazine-orange-fluorescent colorant a une concentration finale de 1,5 µM.
    3. Aspirer le milieu et rincer doucement les cellules deux fois avec du PBS pour enlever le surplus de teinture. Ajouter 600 µL de colorant complet gratuit milieu préchauffé à 37 ° C.
  6. Internalisation de microscopie et de récepteurs de fluorescence.
    1. Visualiser les récepteurs étiquetées sous 63 x (ou similaire) grossissement en utilisant les filtres appropriés pour GFP (λabs: 488 nm, λem: 509 nm), colorant orange fluorescente (λabs: 550 nm, λem: 570 nm) et l’ADN coloration teinture (λ ABS: 350 nm ; Λem: 461 nm). Prenez une photo avec chaque filtre avant l’activation du récepteur.
    2. Promouvoir l’internalisation du récepteur à l’aide de 200 nM de Ucn1.
      1. Préparer une solution 1 000 x Ucn1 de 200 µM dans le DMSO.
        Remarque : Selon la solubilité du peptide, vous pouvez être en mesure de préparer le bouillon dans l’eau pure ou de la mémoire tampon.
      2. 100 µL de milieu de transfert provenant d’un puits dans un tube de réaction de 1,5 mL et ajouter 0,6 µL de la solution mère de peptide agoniste. Transfert au dos moyen dans le puits.
      3. Observer l’internalisation sous le microscope. Prendre des photos de survenance clairement décelables d’internalisation (10-15 min à heures, selon le receveur et la surexpression de Arrestins) en utilisant les filtres mentionnés précédemment.

Résultats

Les grandes lignes de l’essai de fluorescence sont représenté dans la Figure 1. Le dosage est utilisé dans trois applications. En premier lieu, un certain nombre de variantes de l’ARNt pour incorporation de Lys(Boc) par la paire orthogonale Pyl est examiné. Lys(BOC) est un acide aminé stériquement semblable à Pyl. Pyl n’étant pas disponible dans le commerce, Lys(Boc) est couramment utilisé comme substrat standard pour la PylRS. Les ARNt filtré...

Discussion

Le protocole décrit une analyse simple et fiable pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales pour l’incorporation de l’ANAC protéines exprimées dans des cellules de mammifères. Le principal avantage de cette méthode en ce qui concerne les tests couramment issu des FACS est qu’il permet la préparation simultanée et la mesure d’un plus grand nombre d’échantillons et fournit des données qui sont analysées facilement à l’aide d’un logiciel ordinaire. La disponibilité d’une méthode de d?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été fondé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au titre de subventions CO822/2-1 (programme Emmy Noether) et CO822/3-1 à c. i.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammonium persulfate (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi)BachemF-3075.0001
Boric acidSigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Bovine serum albumine (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) home-made10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher (Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerolCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrüssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-Coumaric acidSigma-AldrichC9008-1G
poly-D-lysine hydrobromideCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Protease InhibitorRoche11873580001
PVDF membrane Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Skim Milk Powder Sigma70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazine-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSThe huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmidsPlasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGSynthesized by Genart (Life Technologies)Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate Sigma-AldrichA8592 monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibodySanta Cruzsc-2004
Rabbit-anti-CRF antibodyhome-madePBL #rC69polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibodyhome-madePBL #5779polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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