Une méthode Simple et efficace pour la Manipulation de gène spécifique cardiaque In Vivo par intramyocardique Injection chez la souris

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour manipulation spécifique cardiaque génétique chez la souris. Sous anesthésie, le coeur de souris ont été externalisé par le quatrième espace intercostal. Par la suite, adénovirus, codage de gènes spécifiques ont été injectés avec une seringue dans le myocarde, suivi par mesure d’expression de protéines via l’imagerie in vivo et Western blot analyse.

Résumé

Manipulation génétique spécifiquement au coeur potentialisent considérablement l’enquête de cardiopathie pathomécanismes et leur potentiel thérapeutique. In vivo la livraison gène spécifique cardiaque est généralement obtenue par livraison locale ou systémique. L’injection systémique via la veine caudale est simple et efficace pour manipuler l’expression des gènes cardiaques à l’aide de virus recombinant adéno-associés 9 (AAV9). Toutefois, cette méthode requiert une quantité relativement élevée de vecteur pour la transduction efficace et peut entraîner dans la transduction du gène orgue non ciblés. Nous décrivons ici une méthode simple, efficace et gagner du temps d’injection intramyocardique pour la manipulation spécifique cardiaque gène in vivo chez la souris. Sous anesthésie (sans ventilation), les muscles pectoraux de majeurs et mineurs ont été disséqués sans ménagement, et le coeur de souris a été rapidement exposé par externalisation manuelle par une petite incision à la quatrième espace intercostal. Par la suite, adénovirus encodage luciférase (Luc) et récepteur de la vitamine D (VDR) ou l’ARN en épingle à cheveux courts (shARN) ciblant les VDR, a été injecté avec une seringue de Hamilton dans le myocarde. Subséquent en vivo imagerie démontré que luciférase a été avec succès surexprimée spécifiquement au cœur. En outre, analyse par Western blot a confirmé la surexpression réussie ou silencieux du VDR dans le coeur de souris. Une fois maîtrisé, cette technique peut servir pour les manipulations génétiques, ainsi que l’injection de cellules ou d’autres matériaux tels que nanogels dans le coeur de souris.

Introduction

La maladie cardiaque est la principale cause de morbidité et mortalité dans le monde^1,2. L’absence de stratégies thérapeutiques efficaces pour troubles cardiaques mortelles, y compris l’infarctus du myocarde et insuffisance cardiaque attire une exploration intensive des pathomécanismes sous-jacente et l’identification de nouvelles options thérapeutiques³. Pour ces explorations scientifiques, manipulation génétique spécifique cardiaque est largement utilisé^4,5. Manipulation génétique cardiaque peut être réalisée par génome édition utilisant la nucléase effecteur comme activateur de transcription puissant (TALEN) et groupés régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR) / CRISPR associated protein 9 (Cas9) outils, ou par livraison des matériaux génétiques ectopique (p. ex., vecteurs de virus porteurs de gènes codant des protéines d’intérêt)⁶. Même si génome édition permet les modifications précises et spatio-temporelle du génome chez les souris vivantes, c’est encore une pratique de longues et fastidieuses no⁶. Alternativement, manipulation de gène spécifique cardiaque par vecteur du virus ou à un petite gêne livraison complexe ARN (siRNA) sont systématiquement effectuée⁶.

Livraison de vecteur de virus au coeur de souris adulte est réalisée par environ deux stratégies : injection locale ou systémique. L’injection systémique de sérotype cardiotropic de AAVs tels que AAV9 est non invasive pour de manipulation génétique cardiaque⁷. Toutefois, cette méthode nécessite une quantité relativement élevée de vecteur nécessaire à la transduction efficace et l’expression des gènes et transduction significative des organes ciblés tels que les muscles et le foie⁷peut entraîner. Injection locale de virus est réalisée par injection intramyocardique ou intracoronaire livraison⁷. Livraison intracoronaire conduit à une répartition plus égale de virus dans le cœur par rapport à l’injection d’intramyocardique. Toutefois, les inconvénients de cette technique sont le lavage rapid sur des vecteurs viraux pour la circulation systémique et la transduction des organes⁸, et son exigence de dispositifs de mesure de la pression lors de l’opération. En revanche, permet d’injection intramyocardique meilleure rétention de virus dans le myocarde ainsi que livraison de site spécifique, mais il ne parvient pas à répartir viral vector⁷. Pour petits animaux, livraison intracoronaire est techniquement difficile à réaliser, alors que l’injection systémique de AAV9 et d’intramyocardique sont plus communément pratiqué^4,5,7. Si injection systémique est facile à réaliser, injection conventionnelle intramyocardique exige thoracotomie et ventilation mécanique, provoque des lésions tissulaires vaste et prend du temps.

Dans ce rapport, nous avons décrit une méthode facile, rapide et hautement efficace pour intramyocardique injection. Adénovirus codage luciférase et VDR ou shARN ciblant les VDR, a été injecté pour manipuler l’expression des gènes cardiaques. Une fois maîtrisé, cette méthode peut être utilisée pour les manipulations génétiques, ainsi que l’injection de cellules ou d’autres matériaux dans le coeur de souris.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectués selon le National Institutes of Health Guidelines sur l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de l’Institut. Les souris C57BL/6J mâles (âgés de 8 à 10 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences. Souris ont été logés dans des conditions à 24 ° C ± 4 ° C, suivant un cycle de lumière/obscurité de 12 h, libre accès à l’eau et les aliments exempts de micro-organismes pathogènes.

1. préparation de la Solution de l’adénovirus

1. À l’arrivée de la solution purifiée adénovirus, conserver la solution dans un congélateur à-80 ° C.
   Remarque : L’injection de l’adénovirus a été réalisée chez les souris viables. Pour garantir la stérilité du vecteur adénovirus, l’adénovirus (encodage luciférase, VDR ou shARN ciblant les VDR) ont été préparés et purifiées commercialement^9,10.
2. Le jour de l’opération, retirez la solution purifiée adénovirus (3 x 10¹⁰ plaque formant unités [pfu] / ml) du congélateur à-80 ° C et décongeler solution vecteurs adénovirus sur la glace.
3. Mettre sur un masque facial, des gants stériles et robe stérile.
4. Préparer un 50 µL seringue de Hamilton qui a été stérilisé le jour avant l’opération.
   Remarque : Pour la stérilisation, la seringue de Hamilton était enveloppée dans de la gaze et placée dans un stérilisateur à pression haute température/haute. Le mode de la « Stérilisation pour le solide » a été sélectionné et stérilisation a été introduite en appuyant sur le bouton « Démarrer ».
5. Après décongélation complète de la solution purifiée adénovirus, vaporiser le tube contenant la solution de l’adénovirus avec 75 % d’éthanol et mettez la solution adénovirus dans une hotte à flux laminaire stérile.
6. Dans une hotte à flux laminaire stérile, aspirer 50 µL de solution d’adénovirus en utilisant la seringue sans aiguille, suivie par la fixation d’une aiguille de 30 G à la seringue de Hamilton de Hamilton.
7. Tenir la seringue avec l’aiguille 30 G vers le haut et poussez doucement le piston de la seringue jusqu'à ce que l’aiguille est rempli de solution d’adénovirus (confirmée par l’apparition des premières gouttes de la solution de pointe de l’aiguille).
   Remarque : Il faut environ 45 µL de solution pour combler l’aiguille 30 G, alors maintenant presque aucune solution n’est visible dans la seringue.
8. Utilisez la seringue préparée ci-dessus pour aspirer soigneusement un autre 30 µL de solution d’adénovirus et placez la seringue vaguement plafonnée sur la glace pour une utilisation ultérieure.

2. anesthésie et préparation du dispositif

1. Ajouter 20 mL isoflurane dans un vaporisateur isoflurane et connecter le vaporisateur isoflurane à un réservoir d’oxygène.
2. Ouvrez le robinet et laisser l’oxygène écoulement du réservoir d’oxygène pour le vaporisateur isoflurane. Maintenir le débit d’oxygène à 2 L/min via un moniteur de flux d’oxygène dans le vaporisateur isoflurane.
3. Induire l’anesthésie de la souris à l’isoflurane de 4 % à 100 % d’oxygène (2 L/min) pendant 2 min dans une cage en plastique reliée à l’isoflurane vaporisateur.
4. Sortez la souris anesthésiée de la cage en plastique et fixez-le sur une plate-forme en plastique en position couchée sous une hotte à flux laminaire stérile et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane de 2 % à 100 % d’oxygène (2 L/min) via un cône de nez.
5. Confirmer l’anesthésie adéquate par l’absence de réponse de pincement orteil.
6. Appliquez la crème ophtalmique stérile à chaque œil pour protéger les cornées de l’évaporation.
7. Raser la poitrine et l’abdomen supérieur. Appliquez une crème dépilatoire commercialement disponible sur le site rasé pour 1 min. Retirer la crème dépilatoire et restant de fourrure avec des gazes humides.
8. Stériliser le site chirurgical (partie inférieure gauche de la poitrine) avec 3 gommages d’iode-chlorhexidine fondé antiseptique (par exemple entoiodine). Couvrir le champ opératoire avec un drap stérile.

3. intramyocardique Injection d’adénovirus dans le coeur de souris

1. Enlever les gants et les mettre sur une nouvelle paire de gants stériles.
2. Stériliser des forceps, une pince hémostatique micro-moustiques, une paire de ciseaux chirurgicaux, et un porte-aiguille la veille de l’opération à une haute température/haute pression stérilisateur (voir étape 1.4 note).
3. Faire une incision de la peau de 0,5 cm le long de la ligne reliant la pointe et l’aisselle. Carrément disséquer pectorales grands et petits pectoraux avec forceps et une pince hémostatique micro-moustique.
4. Exposer les espaces intercostaux en rétractant pectorales majeur et mineur pectoraux. Percer et ouvrir le quatrième espace intercostal (ou le plus vaste espace intercostal par observation) avec une pince hémostatique micro-moustique.
5. Poussez le cœur vers l’incision d’externaliser le cœur avec l’index de la main non dominante en appuyant doucement contre le côté droit de la paroi thoracique.
6. Doucement Fixez le coeur externalisé avec l’index et le pouce de la main non dominante.
7. Injecter un total de 30 µL de solution d’adénovirus dans le myocarde du ventricule gauche dans trois sites (paroi ventrale, dorsale et latérale du ventricule gauche) par l’intermédiaire de la seringue de Hamilton rempli d’adénovirus (Figure 1) avec la main dominante.
8. Après injection, placer immédiatement le coeur dans l’espace intrathoracique.
9. Manuellement, évacuer l’air dans l’espace intrathoracique en appuyant doucement sur la paroi thoracique vers l’incision de la peau.
   Remarque : Évacuation de l’air réussie peut être attestée par le battement des pectorales majeur et mineur pectoraux causée par l’air expulsé.
10. Fermer la peau par suture de matelas horizontal avec une suture de soie de 5-0.
    Remarque : Pectorales majeur et mineur pectoraux ne doit pas être suturés, parce qu’ils sont seulement carrément disséqués et leurs structures anatomiques sont intacts tout au long de l’opération.

4. postopératoire gestion

1. Administrer la buprénorphine (3 mg/kg) deux fois par jour par injection sous-cutanée pour réduire les douleurs postopératoires pour les premières 48 h après l’opération¹¹.
2. Après opération, immédiatement maintenir les souris sur une bouillote (37 ° C) jusqu'à ce que complètement guéri. Placez votre souris vers la cage après qu’il récupère complètement.
3. Stériliser la seringue usagée de Hamilton et l’aiguille de seringue de 30 G dans un stérilisateur à haute température/haute pression (voir la note d’étape 1.4). Recueillir l’aiguille stérilisée de seringue de 30 G dans un conteneur d’objets coupants.

5. l’imagerie in Vivo pour mesurer l’Expression de la luciférase cardiaque

1. Jour 5 après l’injection de l’adénovirus, préparer une solution fraîche de luciférine à 15 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD). Filtrer la solution sur un filtre de 0,2 µm.
2. Intra-peritoneally, injecter les souris éveillés avec la solution de la luciférine à 150 mg/kg de poids corporel.
3. Allumez le système d’imagerie.
4. Après automatique self-test du système d’imagerie, sélectionnez le mode d’imagerie comme « Luminescents » et effectuer les réglages suivants : exposition : Auto ; Binning : 8 ; FStop : 1 ; Excitation : Bloc ; Émission : ouvert.
5. À 10 min après l’injection de la luciférine, anesthésier les souris par injection de l’hydrate de chloral (300 mg/kg de poids corporel). Confirmer l’anesthésie adéquate par l’absence de réponse de pincement orteil.
6. Fixer les souris anesthésiés sur une platine chauffante d’imagerie en décubitus ventral, avec la poitrine dirigée vers la caméra.
7. Recueillir les images (1 image pour chaque souris) et de quantifier l’intensité des signaux en dessinant des régions mesure circulaire identique d’intérêt (ROI) autour de sa poitrine.
8. Après la collection d’images, sacrifier les souris et recueillir les tissus comme mentionné dans la section suivante.

6. récolte des tissus

1. À des moments différents après l’injection de virus (Figure 1 b), anesthésier les souris avec 4 % isoflurane et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 2 % via une extrémité conique et le fixer sur une plate-forme en plastique en position couchée.
2. Faire une incision ventrale médiane du cou antérieur. Exposer l’artère carotide commune droite en rétractant les muscles omohyoid et du sternocléidomastoïdien.
3. Sacrifier les souris en sectionnant l’artère carotide commune droite et drainant le sang.
4. Faire une incision ventrale médiane dans l’abdomen. Couper les côtes des deux côtés de la cage thoracique, le long de la ligne claviculaire et le diaphragme du transect.
5. Exposer le cœur en soulevant la xiphoïde. Trouver l’aorte ascendante et retirer doucement le tissu adipeux périvasculaires.
6. Canule dans l’aorte et marqués perfuse le cœur avec une aiguille de 30 G, attachée à une seringue de 1 mL contenant 0,5 mL de 4 ° C du tampon phosphate (PBS).
7. Après la perfusion, le cœur de l’accise et divisez-le en les ventricules gauche et droit. L’accise du foie, des poumons et rate.
8. Après deux lavages en PBS froid (4 ° C), rangez tous les tissus collectés séparément dans des flacons dans l’azote liquide cryogéniques.

7. détermination de l’Expression des protéines

1. Préparer, tampon d’homogénéisation en ajoutant cocktail inhibiteur de protéase dans le tampon de lyse disponibles dans le commerce à un ratio de 1/100. Calcule le volume total basé sur le nombre d’échantillons à traiter. Garder la mémoire tampon d’homogénéisation préparés à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
2. Retirer les tissus de la cuve d’azote liquide. Peser le tissu sur les balances de haute précision (environ 60 mg de chaque morceau de tissu).
3. Transférer le tissu dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Immédiatement ajouter 200 µL de tampon d’homogénéisation et rafraîchies boules en acier de 1,5 mm (4 ° C) dans le tube de microcentrifuge.
4. Fixer les tubes de microcentrifuge rafraîchies (4 ° c) détenteurs de métal dans un tissu automatique machine de meulage et commencer l’homogénéisation en démarrant la machine avec les paramètres suivants : fréquence : 70 Hz ; temps : 120 s.
5. Après homogénéisation, centrifuger l’homogénat (16 000 × g, 4 ° C) et transvaser avec soin le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL avec une pipette 100 µL.
6. Ajouter chargement solution (x 5) à la protéine surnageante de la mémoire tampon à un ratio de 1:4 et dénaturer les protéines à 100 ° C pendant 5 min.
7. Les niveaux d’expression de protéine dans le cœur et les autres tissus de l’organe sont également surveillés par analyse par Western blot (représentant résultats sont illustrés dans la Figure 2 et Figure 3) selon le protocole décrit précédemment¹².

Résultats

Le protocole de l’expérience et certaines des étapes clés de la méthode signalée sont indiquées à la Figure 1. À 5 jours après l’injection intramyocardique de la luciférase encodage adénovirus (Adv-luc), in vivo d’imagerie chez les souris adv-luc injecté a indiqué robuste surexpression de la luciférase spécifiquement dans le cœur (Figure 2 a, B), qui a été confirmé par analyse pa...

Discussion

Le présent rapport illustre une technique modifiée pour injection intramyocardique de vecteurs viraux pour manipulation génétique cardiaque, ce qui a été modifié à partir d’une méthode d’induction de l’infarctus du myocarde par Gao et al. ¹³ actuellement, en vivo caractérisation des fonctions des gènes spécifiques plus souvent impliquent la génération de masquage ou de souris transgéniques^3,14,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Laminar flow sterile hood	Fengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)	FS-CJ-2F
Centrifuge	Thermo Scientific (Waltham, USA)	75005282
Tissue grinding machine	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)	Scientz-48
High temperature/high pressure sterilizer	Hirayama (Saitama, Japan)	HVE-50
Isoflurane vaporizer	Matrix (Orchard Park, USA)	VIP3000
IVIS  Lumina III imaging system	PerkinElmer (Waltham, USA)	CLS136334
Precision balance	Sartorius (Göttingen, Germany)	28091873
Instruments
Eppendorf pipette (100 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000059
Eppendorf pipette (10 µL)	Eppendorf (Westbury, USA)	4920000113
Forceps	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	JD4020	Curved tip
Hamilton syringe	Hamilton (Nevada, USA)	80501	Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostat	F.S.T (Foster City, USA)	13011-12	Curved, tip width 1.3mm
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)	J32110
Surgical scissors	F.S.T (Foster City, USA)	14002-12
1-mL Syringe	WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibody	CST (Danvers,  USA)	#2118
Anti-Luciferase antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab187340
Anti-rabbit IgG	CST (Danvers,  USA)	#7074
Anti-VDR antibody	Abcam (Cambridge, UK)	ab109234
Buprenorphine	Thermo Scientific (Waltham, USA)	PA175056
Chloralic hydras	LingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic Vials	Thermo Scientific (Waltham, USA)	375418	1.8 mL
Depilatory cream	Veet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco (Grand Island,  USA)	14040133
Entoiodine	LiKang (Shanghai, China)	310132
EP tube	Sarstedt (Newton, USA)	PCR001
Filter	Millipore (Bedford, USA)		Pore size 0.2 µm
Isoflurane	Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
Luciferin	Promega (Madison, USA)	P1041
Lysis buffer for western  blot	Beyotime (Shanghai, China)	P0013J	Without inhibitors
Ophthalmic cream	Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBS	Gibco (Grand Island,  USA)	10010023
Protease inhibitor cocktail	Thermo Scientific (Waltham, USA)	78438
5-0 silk suture	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ball	Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)		Width 1.5 mm
Syringe needle	Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)		30 gauge
Warm mat	Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )	NF-GNCW