Microdissection de tissu rénal primaire Segments et intégration avec la technologie de nouvelle construction exempte d’échafaudage

Résumé

Tissulaire rénales constructions offrent une solution pour la pénurie d’organes et les effets délétères de la dialyse. Nous décrivons ici un protocole se rapportant au micro disséquer les reins murins pour l’isolement des segments cortico-médullaire. Ces segments sont implantés dans des constructions cellulaires exempte d’échafaudage, formant organoïdes rénale.

Résumé

Transplantation rénale est maintenant une thérapie ordinaire pour insuffisance rénale terminale. Cependant, avec environ 96 000 personnes sur la liste d’attente et seulement un quart de ces patients atteignant la transplantation, il y a un besoin urgent d’alternatives pour ceux qui ont le défaut des organes. Afin de diminuer les conséquences néfastes de dialyse ainsi que les frais de soins de santé dans l’ensemble qu’elle engage, enquête active est en cours à la recherche de solutions alternatives aux greffes d’organes. Implantables tissulaire rénales constructions cellulaires sont une telle approche faisable pour remplacer la fonction rénale perdue. Décrite pour la première fois, voici la microdissection des reins murins pour l’isolement de vie corticomédullaire segments rénales. Ces segments sont capables d’intégration rapide au sein des constructions d’exempte d’échafaudage endothéliales-fibroblaste qui peut permettre une connexion rapide avec vascularisation hôte une fois implantée. Reins de souris adultes ont été achetés auprès de donneurs vivants, suivies par microdissection stéréoscope pour obtenir des segments rénales 200-300 µm de diamètre. Plusieurs constructions rénales ont été fabriquées en utilisant des segments rénales primaires ne récoltés qu’un seul rein. Cette méthode montre une procédure qui pourrait sauver le tissu rénal fonctionnel des organes qui pourrait autrement être mis au rebut.

Introduction

Insuffisance rénale chronique (IRC) est l’un des défis majeurs de santé publique partout dans le monde actuel¹. La prévalence de CKD aux États-Unis dépasse les 14 % de la population totale, avec plus 600 000 américains souffrant de la forme la plus sévère, stade terminal d’insuffisance rénale (terminale IRT)². Les options de traitement actuelles disponibles pour les personnes souffrant d’insuffisance rénale terminale comprennent la transplantation de dialyse et des reins. Bien qu’environ 25.000 patients subissent chaque année de la transplantation rénale, un nombre important de patients est ajouté chaque année conduisant à une forte disparité entre les personnes en attente d’un organe de sauvetage et les récepteurs de transplantation³. En plus de ses graves effets négatifs sur la longévité et la qualité de vie, dialyse est associé à une charge financière étonnante. En 2014, l’assurance-maladie demandes payées ont totalisé $ 30 milliards pour les patients d’IRT². Avec un approvisionnement limité orgue et aucune tendance à la baisse apparente chez les patients nécessitant une dialyse, les efforts de recherche visant à identifier des solutions alternatives à la dialyse et transplantation sont toujours importants. Même un délai relativement court dans la nécessité d’une dialyse augmente considérablement nombre du patient des années de vie ajustées pour la qualité et la productivité tout en reportant les coûts liés à la dialyse^4,5,6.

Solutions pour la perte de tissu fonctionnel, comme celui de l’insuffisance rénale terminale, sont actuellement à l’étude en génie tissulaire et des laboratoires de médecine régénérative, avec des approches très variées allant de fabrication axée sur l’échafaud organoïde d’organes entiers à l’aide technique DECELLULARISE structures de l’orgue pour implantation cellulaire^7,8,9,10,11. Récapitulant les structures rénales complexes des reins marginaux ou mis au rebut que partiellement a été étudiée. En fait, presque 20 % des reins achetés à la transplantation sont abandonnées pour diverses raisons^12,13. Le tissu rénal fonctionnel de ces greffes présumés pourrait être utilisé et incorporé dans une ou plusieurs constructions tissulaire. Des études antérieures ont démontré la possibilité de travailler avec ces organes mis au rebut, utilisant les reins de la matrice extracellulaire pour tissus ingénierie fins^14,15. Cependant, peu ont utilisé des principaux tissus nephronal des reins en bonne santé pour l’ingénierie tissulaire fins^16,17,18.

Une méthode précédemment décrite par Kim et coll. implique isolement de « segments » rénales de reins des rats sains, qui ont été ensuite ensemencés sur des échafauds de (PGA) acides polyglycolique pour construction fabrication¹⁶. Cependant, peu d’information est donnée au sujet de la méthodologie exacte dissection et segments ont été obtenus d’une combinaison de hacher fines et de filtration. Nous décrivons une modification du présent protocole, qui produit de la même façon des segments rénales discrètes avec architecture nephronal intact, mais au contraire repose sur des techniques de microdissection. Suivie est effectuées sur des souris adultes vivants, après quoi les reins sont transférés dans le microscope de dissection où la capsule rénale est supprimée et le tissu est disséqué plus loin. Petit calibre 30½ G aiguilles sont utilisées comme instruments de coupe et également comme guide aidant à dissection, comme l’aiguille diamètre est égal au diamètre de la cible des segments rénales. Les segments isolés, en l’espèce murines, rénales maintiennent la viabilité en culture et intègrent avec des constructions cellulaires exempte d’échafaudage endothéliales-fibroblaste¹⁹. Ces constructions avaient déjà été utilisées à l’ingénieur d’autres organes, y compris un pancréas artificiel bio²⁰.

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Protocole

Toutes les interventions chirurgicales animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par les institutionnels et animalier utiliser Comité (IACUC) à la Medical University of South Carolina, avant toute chirurgie animale ou l’utilisation de n’importe quel tissus animaux.

1. murine néphrectomie

1. Don un masque chirurgical et bouffant cap afin de minimiser le risque de contamination. Maintenir la stérilité au cours de la mise en place de la zone chirurgicale.
   1. Placer des draps chirurgicaux non fenêtrée sur la table d’opération.
   2. Ouvrez le pack des instruments stérilisés à l’autoclave sur les tentures stériles. Les instruments nécessaires pour néphrectomie comprennent 3 petite hémostatique, fine pince à dents, pince fine sans dents et ciseaux iris droite.
   3. Placez un autre drap chirurgicale non fenêtrée dans le centre de la table d’opération.
   4. Préparation de 5 mL de Dulbecco Phosphate Buffered Saline (SPD) de calcium et de magnésium, additionné de 1 % la pénicilline/streptomycine dans un tube conique stérile de 15 mL. Placez cette solution sur la glace à côté de la table d’opération.
2. Obtenir une souris C57BL/6 de 8 à 12 semaine vieux (mâle ou femelle) du complexe de logement des animaux.
3. Placez la souris à l’intérieur d’une chambre d’induction de l’anesthésie et induire à l’isoflurane 3,5 % inhalé. Placez un cône de nez sur la souris, l’isoflurane de 2 % pour l’anesthésiologie en entretien.
   1. Moniteur pour une profondeur adéquate de l’anesthésie périodiquement tout au long de l’intervention chirurgicale en évaluant pour pédale réflexe (pincement de l’orteil ferme).
4. Supprimer tous les cheveux de torse ventral à l’aide de la crème dépilatoire. Rincer cette surface avec l’eau distillée pour s’assurer que tous les cheveux a été retiré de l’abdomen.
5. Transférer la souris sur la table d’opération stérile en décubitus dorsal dans le haut de la page drap non fenêtrée. Découper une fenestration de² 2 x 2 cm dans le drap recouvrant tout l’abdomen de la souris.
6. Appliquer la povidone-iode, suivie de l’éthanol à 70 % à l’abdomen à l’aide de boules de coton ou de gaze stériles.
7. À l’aide de pinces fines avec des dents et iris ciseaux, faire une incision cutanée abdominale verticale de 3 à 4 cm parallèle à la ligne médiane, 0,5 cm à gauche de la ligne médiane
   Remarque : Si vous prévoyez d’enlever le rein droit, il s’agit d’une incision de 0,5 cm à droite de la ligne médiane.
   1. Saisir le péritoine avec une fine pince sans dents et inciser avec des ciseaux iris pour entrer dans la cavité abdominale. Appliquer une pince hémostatique sur les bords latéraux supérieurs et inférieurs de la peau et le péritoine de placer tension latéralement et mettez en avant.
   2. Déplacer le contenu intestinal délicatement sur le côté droit de l’abdomen pour exposer le rein gauche. Placez délicatement la traction au niveau des reins pour élever hors de l’abdomen.
   3. Placer une pince hémostatique à travers le hile du rein gauche. Utiliser des ciseaux iris transect de l’uretère et les vaisseaux rénaux.
   4. Placez le rein gauche dans le 1 % Solution SPD pénicilline/streptomycine sur la glace.
   5. Transférer le tube contenant le rein à la hotte de vitroplants stérile. Transférer le rein du tube conique 15 mL pour un plat de Pétri de 60 mm (Figure 1). Rincer deux fois à l’aide de 5 mL SPD avec calcium et magnésium. Gardez le rein suspendu dans 5 mL SPD dans le plat de 60 mm.
      1. Préparer une boîte de Pétri supplémentaire de 60 mm avec 5 mL SPD à utiliser pendant le protocole microdissection.
   6. Euthanasier la souris par thoracotomie et exsanguination suite à l’acquisition du rein, selon un protocole d’animale IACUC approuvé.

2. murin rein Microdissection pour l’isolement du Segment rénale

1. Continuer à utiliser une technique stérile pour cette partie du protocole, y compris des gants stériles, masque chirurgical et bouffant pour minimiser les risques de contamination.
   1. Lieu stérile les rideaux sur la plateforme microscope stéréo, aussi bien quant à la zones juste à gauche et droite du microscope d’avoir un champ stérile pour instruments. Placer les feuilles de plastique adhésifs sur les boutons de mise au point de microscope et vaporiser avec l’éthanol à 70 %. Allumez le projecteur double col de cygne pour éclairer la scène.
   2. Ouverts instruments stérilisés (pince fine sans dents, manche de scalpel, lame de bistouri #15, une pince hémostatique droite deux deux 30½ jauge aiguilles creuses) sur draps stériles. Placer le #15 la lame sur le scalpel gérer maintenant et joignez une pince hémostatique à chaque adaptateur/hub d’aiguille pour créer des instruments de dissection de l’aiguille pour une utilisation ultérieure, comme illustré à la Figure 1.
2. Déplacez le Pétri de 60 mm, un contenant le rein dans le SPD et les autres SPD seul, de la hotte de culture de tissus dans la région de microscope.
   1. Placer le plat de Pétri de 60 mm au titre de l’objectif et enlever le couvercle afin d’exposer le rein. Laisser le plat contenant du SPD sur le côté sur le champ stérile pour une utilisation ultérieure.
   2. Déplacez le plat pour que seulement la surface antérieure ou postérieure du rein est en vue (c.-à-d., la grande face plate du rein, avec l’autre face, toucher le fond du plat). Zoom sur 3.2-4 X pour cette partie de la procédure. Avec la main non dominante, utilisez des pinces fines sans dents pour percer et épingler les reins contre le plat près des pôles inférieures et supérieures du rein.
   3. Gardez la main non dominante en place à la broche du rein. Avec la main dominante, utilisez la lame #15 pour retirer la couche capsulaire fibreuse translucide de la surface exposée. Rasez le plus superficiel 0,5 mm de la surface exposée du rein pour enlever le reste de la capsule.
   4. Utiliser la lame #15 à disséquer une pyramide inversée du tissu de la région de décapsulés, environ 2 mm³ en taille. Récupérer le plat 60 mm contenant uniquement de SPD et placez la pyramide du tissu dans le plat propre. Jeter le reste du rein.
   5. Diminuer le grossissement 1,5 à 2,0 x pour le reste de la dissection. À l’aide de deux instruments de Surgicel-aiguille comme instruments de coupe, tranche le fragment de tissu en morceaux de plus en plus petites jusqu'à ce que les segments de tissus sont inférieures ou égales au diamètre de la pointe de l’aiguille. Une de 2 mm de tissu rénal³ taille produira plus de 50 segments une fois complètement disséqués.
   6. Passer le plat de 60 mm avec des segments rénales à la hotte de la culture de tissus. Retirez le SPD avec 1000 µL pipette. Ajouter 5 mL DMEM, additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine.
   7. Culture pour 3 jours à 37 ° C dans une étuve ou un implant dans des constructions cellulaires immédiatement.

3. rénale Segment construction cellulaire Fabrication

1. Normales fibroblastes dermiques humains culture (NHDF) et homme adipeux cellules endothéliales microvasculaires (HAMEC) pendant plusieurs semaines obtenir 7,2 x 10⁵ fibroblastes et 1,8 x 10⁵ cellules endothéliales par construction désiré. Dans la hotte de culture tissulaire, amorcer le rapport approprié de fibroblastes de cellules endothéliales (4:1) dans les puits en forme de bâtonnet dans les moules d’agarose pour former exempte d’échafaudage pré vasculaires endothéliale-fibroblaste constructions (SPEC) tel que décrites précédemment par Czajka et al. ¹⁹.
2. Obtenir une pince hémostatique stérilisée, aiguille 30½ G et une spatule stérile avec extrémité plate.
   1. Enlever la majorité des médias de la plaque de 60 mm contenant des segments rénales, en veillant à ne pas aspirer et enlever les segments rénales.
   2. Équiper les Loupes chirurgicales pour visualiser l’implantation des segments.
   3. Gratter l’extrémité de la spatule délicatement sur le fond du plat 60 mm pour obtenir des segments de 10-15, étaler uniformément le long de l’extrémité de la spatule. Placer l’extrémité de la spatule aussi près que possible de la lèvre du puits où la spécification a été ensemencée.
   4. Utiliser d’instrument pince hémostatique-30½ G aiguille dans l’autre main pour déplacer chaque segment individuel de l’extrémité de la spatule sur le bord du puits. Abaissez doucement chaque segment dans le bien à l’aide de la pointe de l’aiguille jusqu'à ce que légèrement immergé dans la suspension cellulaire préalablement ensemencée.
   5. La culture rénale segment-SPEC 2:1:1 ratio du milieu MGF-2/EGM-2/DMEM (total de volume de 2,5 mL). Changement des milieux de culture toutes les 24 h pendant 3 jours. Retirer les moules après 72 h des constructions et Difficulté ou flash-gel pour le traitement.

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Résultats

Le protocole décrit produit environ 50 segments rénales par section³ pyramidale 2 mm de tissu rénal. Les segments rénales qui ont été traitées et imagés possèdent des composants tubulaires et glomérulaires dans des proportions différentes (voir Figure 2). Les segments intacts ont été soumis à un test afin de déterminer la viabilité des différents segments une fois toutes les 24 h pendant trois jours. Vert fluorescent calcéine-AM e...

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Discussion

Méthodes utilisées pour vivre le tissu rénal constructions varient grandement en ce qui concerne le type de cellules et de biomatériaux utilisés et dans de nombreux cas, l’ingénieur sont obsolètes ou pas bien caractérisé dans la littérature⁷. Alors que beaucoup utilisent des approches de cellules souches ou récapitulant les différents composants de l’architecture rénale dans l’isolement, la perspective de recréer artificiellement un organe entier avec plus de 26 types de diffé...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-fenestrated Sterile Field	Busse Hospital Disposables	696
Fenestrated Sterile Field	Busse Hospital Disposables	697
Halsted Mosquito Forceps 5 Curved	Miltex	Mil-7-4	"Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth	Fine Science Tools	11155-10	Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)	Fine Science Tools	11152-10	Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4")	Fisher Healthcare	22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered Solution	Corning	21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-Cl
Isoflurane, USP	Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson	2254845
Nair Hair Remover	Nair	22600-23307	Hair Removal Cream in text
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2705	Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture Dish	Themo-Scientific	130181
Press'n Seal	Glad	12587-70441	Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Illuminator	Cole Parmer	41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck	Cole Parmer	EW-41720-60
Scalpel Handle #3	Miltex	Mil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15	Bard-Parker	371115
31 1/2 Gauge Needle	ThermoFisher Scientific	14-826F	Becton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine Serum	Atlas Biologicals	FS-0500-AD
Normal Human Dermal Fibroblasts	Lonza	CC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells	Sciencell Research Laboratories	7200
Surgical Loupes (2.5x)	Orascoptic	(N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)	Lonza	CC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)	Lonza	CC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells	ThermoFisher Scientific	L3224
Anti-Cytokeratin-18 Antibody	Abcam	ab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633	ThermoFisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A-11010
Anti-Von Willebrand Factor Antibody	Abcam	ab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate	Sigma Aldrich	A9771-50MG
Hoescht 33342	BD Pharmingen	561908
Background Buster	Innovex Biosciences	NB306