Micromanipulation des Chromosomes dans les Spermatocytes insectes

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons la sélection et la préparation de cellules appropriées pour micromanipulation et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique à repositionner des chromosomes dans les cellules.

Résumé

La micromanipulation des chromosomes est une méthode essentielle pour éclairer le mécanisme de chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase et a joué un rôle clé pour comprendre ce qui contrôle les mouvements du chromosome au cours d’une division cellulaire. Un biologiste qualifié peut utiliser un micromanipulateur pour détacher les chromosomes de la broche, de repositionner des chromosomes dans les cellules et d’appliquer des forces aux chromosomes à l’aide d’une aiguille de petit verre avec une pointe très fine. Tandis que des perturbations sont possibles aux chromosomes à l’aide d’autres méthodes comme le piégeage optique et autres utilisations d’un laser, à ce jour, aucune autre méthode ne permet le repositionnement des composants cellulaires à l’échelle de quelques dizaines à plusieurs centaines de microns avec peu ou pas de dommages à la cellule .

La sélection et la préparation des cellules appropriées pour la micromanipulation des chromosomes, décrivant spécifiquement la préparation des cultures primaires de sauterelle et le cricket spermatocyte pour l’imagerie de cellules vivantes et micromanipulation, sont décrit ici. En outre, nous montrons la construction d’une aiguille à utiliser pour le déplacement des chromosomes au sein de la cellule et l’utilisation d’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par joystick avec une aiguille de verre attachée à elle pour repositionner des chromosomes dans les cellules en division. Un résultat de l’échantillon montre l’utilisation d’un micromanipulateur pour détacher un chromosome d’un axe dans un spermatocyte primaire et de repositionner ce chromosome au sein de la cellule.

Introduction

Micromanipulation a révélé des pièces du mécanisme pour une chromosome congression, la broche checkpoint et mouvements de chromosome de l’anaphase. La première publication décrivant les résultats des expériences de micromanipulation était par Robert Chambers¹. Chambers a utilisé un micromanipulateur mécanique avec une aiguille de verre ci-joint pour sonder le cytoplasme d’un certain nombre de différents types cellulaires. Malheureusement, les méthodes de contraste permettant la visualisation des chromosomes et de nombreux autres composants cellulaires dans les cellules vivantes n’étaient pas disponibles dans le temps, donc expériences Chambers' impossible d’afficher les effets de ces composants cellulaires de repositionnement. Micromanipulations précoces qui a modifié la position chromosomique utilisé l’appareil Chambers à balayer le milieu de la broche dans les cellules de l’anaphase, montrant que ces manipulations pourraient modifier la position des bras chromosomiques en neuroblastes sauterelle de l’anaphase² . Nicklas et ses collaborateurs furent les premiers à effectuer des micromanipulations fines des chromosomes, qui s’étend des chromosomes³, détacher de la fusée et induisant une réorientation^3,4, stabiliser une malorientation en appliquant la tension pour les chromosomes^5,6,7et en mesurant les forces produites par pivots en anaphase^8,9. Autre travaux par le laboratoire de Nicklas ont montré que les granules cytoplasmiques pourraient également être manipulé¹⁰ et que les centrosomes pourraient être réorientées en micromanipulation¹¹. Micromanipulation n’est pas seulement utile pour déplacer des chromosomes et autres composants cellulaires. Une aiguille de micromanipulation peut couper proprement un fuseau mitotique dans demembranated cellules¹² ou peut être utilisée pour dissoudre l' enveloppe nucléaire¹³. En outre, les cellules adjacentes peuvent être fusionnés par micromanipulation^14,15.

Avec une telle variété d’expériences intéressantes qui peut être fait à l’aide de micromanipulation, c’est à première vue surprenant que micromanipulation expériences ont été faites par très peu de biologistes du chromosome. Une des raisons de cette carence, c’est que les cellules cultivées de division mitotique qui sont dérivées de tissus vertébrés et sont couramment utilisés pour l’étude des mouvements des chromosomes sont extrêmement difficiles à micromanipulate. Ces cellules de culture de tissu ont généralement un cytosquelette cortical que « obtient de la manière » de la micromanipulation aiguille et chromosomes non plus n’est pas joignable par l’aiguille ou Marc de l’aiguille à travers la cellule, conduisant à une rupture de cellules et de la mort. Autres expérimentateurs qui utilisent la micromanipulation, et nous avons trouvé arthropodes cellules à se prêter à la micromanipulation. Les spermatocytes arthropodes sont facilement se propager sous une couche de Huilehalocarbone et semblent avoir un cytosquelette cortical beaucoup moins robuste qui sous-tendent la membrane cellulaire au cours d’une division cellulaire. Ainsi, les testicules arthropodes constituent une bonne source de cellules de division de méiose (spermatocytes) et de division mitotique des cellules (spermatogonies) avec des chromosomes facilement accessibles pour la micromanipulation. Une série de sectionnement d’un spermatocyte sauterelle fixé pendant une manipulation a révélé que l’aiguille pénètre jamais dans la membrane cellulaire ; la membrane cellulaire se déforme autour de l’aiguille (Nicklas R.B., communication personnelle). Les spermatocytes de plusieurs taxons d’insectes et araignées ont été micromanipulés avec succès, y compris les sauterelles, les Mantes priant, drosophiles, tipules, grillons, cercopes, papillons, araignées veuve noire, cave araignées et orb-weaving spiders ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Des cellules cultivées, facteur de division mitotique des insectes peuvent être micromanipulés. Par exemple, les chromosomes en neuroblastes sauterelle dans une culture primaire ont des chromosomes qui peuvent être facilement micromanipulés^2,23. Nous soupçonnons que la disposition cultivés lignées dérivées de drosophile et autres insectes seront également micromanipulatable, bien que nous n’avons pas testé la technique avec ces cellules. Nous allons montrer comment diviser des cellules de sauterelles et les grillons peut être préparé pour une micromanipulation. Grillons sont faciles à obtenir de la plupart des magasins pour animaux de compagnie à tout moment de l’année. Les sauterelles ne sont faciles à obtenir en été à moins que le chercheur a accès à une colonie de laboratoire, mais l’espèce utilisée (Melanoplus sanguinipes) a aplani facilement les cellules et longs, facile-à-manipuler les chromosomes.

Une autre raison pourquoi les expériences de micromanipulation ont été faites par une petite poignée de biologistes est que micromanipulateurs qui bougent bien les chromosomes sont rarement disponibles sur le marché. Nous avons constaté qu’un micromanipulateur piézoélectrique contrôlées par manette contrôle le mouvement de l’aiguille sans vibration, dérive, ou le décalage entre les mouvements de la manette et le déplacement de l’aiguille, mais les autres types de manipulateurs peuvent pousser aussi avec succès des chromosomes autour de la cellule. Les micromanipulateurs conçus par Ellis et Begg^25,26 sont idéales pour la micromanipulation des chromosomes, bien qu’elles utilisent la technologie plus ancienne. Micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE sont actuellement disponibles et couramment utilisés en électrophysiologie ; Toutefois, ces micromanipulateurs ne sont pas généralement contrôlée par joystick. Contrôle de manette de jeu est essentielle pour le mouvement lisse d’une micromanipulation réussie, et donc une manette de jeu personnalisé doit être construite pour faire les micromanipulateurs PIEZO-ELECTRIQUE actuellement disponibles fonctionnent pour une micromanipulation de chromosome. Les micromanipulateurs piézoélectriques contrôlées par joystick qui fonctionnent le mieux ont contrôle de position directe, où le mouvement du levier de commande se traduit directement à un déplacement de l’aiguille.

Un micromanipulateur piézoélectrique nouvellement conçu peut être construit de pièces disponibles sur le marché qui peuvent être facilement remplacés et de quelques petits composants imprimés 3D, et il fonctionne bien pour le chromosome micromanipulation²⁴. Le micromanipulateur n’a sensibilité réglable, positionnement manuel grossier et aucune vibration, dérive ou retard dans le mouvement de l’aiguille et le contrôle direct de position de l’aiguille. Les scientifiques peuvent construire le micromanipulateur à l’aide d’instructions disponibles en ligne²⁴. Voici les méthodes de préparation d’une culture de cellules de spermatocytes primaires et pour micromanipulating les chromosomes dans les cellules de cette culture.

Protocole

1. préparation de la Culture de cellules primaires Spermatocyte insectes Micromanipulation

1. Préparation des lames
   1. Obtenir une lame de verre de 75 mm x 25 mm avec un trou circulaire de 20 mm de diamètre, découper au centre de la diapositive.
      NOTE : Elles ont été coupées d’une seule feuille de verre à vitre à la taille d’une lame de verre avec un trou au centre.
   2. Une lamelle de 25 x 25 mm #1.5 faire executer une flamme de bec Bunsen pour 2 s.
   3. Appliquez de la graisse sous vide sur le pourtour du trou dans la lame de verre
   4. Placer la lamelle sur le trou comme dans la Figure 1. Appuyez dessus et veillez à former un joint étanche.
   5. Retourner la lame de verre et remplir la dissection bien Huilehalocarbone.
2. Préparation de la culture de spermatocyte pour l’affichage sur le microscope
   Remarque : Nous décrivons ici la méthode de préparation de culture à l’aide de cellules sauterelle ou le grillon. Contenu des testicules d’autres arthropodes peut être cultivées à l’aide d’une méthode similaire.
   1. Procurez-vous les grillons mâles subadultes (ou sauterelles). Placez un insecte vivant dans un réfrigérateur pendant environ 2 min à froid-l’anesthésier. À l’aide de ciseaux de dissection, rapidement couper à travers la surface dorsale parallèle à l’axe longitudinal de l’abdomen juste derrière l’aile des bourgeons. Manuellement, presser l’abdomen doucement pour pousser les testicules à travers la coupe dans l’exosquelette (Figure 2).
   2. À l’aide de pinces, placez les testicules isolés dans une cupule contenant Huilehalocarbone la dissection.
   3. Le cas échéant, Découvre les testicules sous un microscope à dissection. Divisez-les en petits morceaux à l’aide de la pince fine pointes, enlevant toute graisse couvrant les testicules et utilisez la pince fine pointes pour briser les testicules (figures 3 a et 3 b). Étaler le contenu des testicules en vertu de l’huile, sur la surface de la lamelle (Figure 3).
   4. Étaler le contenu des testicules jusqu'à ce que la partie propagation du testicule est à peine perceptible à l’oeil (Figure 3). Utilisent des puits de dissociation de chargés en huile supplémentaire si nécessaire.

2. micromanipulation

1. Production de la microneedle
   1. Placez une extrémité d’un tube de verre (0,85 mm de diamètre extérieur, 0,65 mm de diamètre intérieur) dans la flamme d’un bec Bunsen. Tirer sur l’extrémité de la tubulure de verre de telle sorte qu’un angle de 150° est formé, et une zone d’extension du tube de verre étroit est créée. Casser le tube dans la région de mince afin que la région mince qui s’étend de l’angle est d’environ 10 mm de long (Figure 4 a).
   2. En utilisant une microforge (mesure selon Powell²⁷ ou commercialement disponibles-voir la Table des matières), toucher la pointe de l’aiguille de verre pour le fil de platine chaud pour faire fondre le verre à l’extrémité. Forme un angle d’environ 45° entre l’aiguille et le fil de platine de la microforge (Figure 4 b). Tirez sur la vitre de l’incandescent, tout en coupant la chaleur au fil, formant une pointe fine de ≤1. 5 mm à l’extrémité de l’aiguille de verre.
      NOTE : Le diamètre de pointe sera difficile à mesurer, mais une astuce de cette longueur est susceptible d’induire une aiguille souple mais ferme qui conviendra à la micromanipulation. Alternativement, un micropipettes pourrait servir à créer des tubes de verre avec un diamètre approprié (l’expérimentateur devra tester différentes recettes de traction pour produire une microneedle bien ferme mais souple pour le travail). L’aiguille pourrait être placé dans un support qui a la forme de la même façon à l’aiguille de manipulation créé selon la méthode décrite ci-dessus.
2. Positionnement du micromanipulateur
   1. Placez la diapositive préparée sur la scène d’un microscope à contraste de phase inversée. Trouver les Division des cellules et centrer dans le champ de vision. Mettre l’accent sur les cellules en utilisant le grossissement le plus faible possible.
      NOTE : Nous avons utilisé un objectif de contraste de phase X 16.
   2. Placez le micro aiguille dans le porte aiguille sur le micromanipulateur.
   3. Positionner le micro aiguille dans le trajet optique du microscope manuellement afin que la pointe de l’aiguille est éclairée par la lumière (Figure 5 b).
   4. Concentrer le microscope plusieurs plans focaux au-dessus du plan dans laquelle se trouvent les cellules.
   5. Repositionner le micro aiguille en utilisant le levier de commande à une faible sensibilité plusieurs fois pour trouver l’ombre de l’aiguille dans les axes X et y. Continuer à réajuster la position jusqu'à ce que la position de l’extrémité est visible. Ajustez la position de l’aiguille le long de l’axe z jusqu'à ce que la pointe de l’aiguille est au point.
   6. Se recentrer sur les cellules, puis se concentrer le microscope au-dessus du plan de cellule afin que les cellules sont juste hors de discussion et invisible. Réajuster la position de l’aiguille pour que son extrémité soit mise au point dans ce plan focal.
   7. Ajustez le grossissement du microscope selon vos besoins.
      NOTE : Nous avons utilisé un objectif 100 X 1.4 de contraste de phase ouverture numérique (NA) pour la micromanipulation.
   8. Après en se concentrant sur les cellules à l’aide de l’objectif de grossissement supérieur, encore une fois se concentrer le microscope au-dessus du plan de cellule afin que les cellules sont juste hors de discussion et invisible. À l’aide d’un réglage de sensibilité plus élevé, réajuster la position de l’aiguille pour que sa pointe est au point et centré dans le plan focal au-dessus du plan dans laquelle se trouvent les cellules.
   9. Se recentrer sur les cellules, en ajustant leur position afin qu’elles restent dans le centre du champ de vision. L’aiguille est maintenant prêt pour la micromanipulation.
3. Micromanipulation des chromosomes
   1. En utilisant le même paramètre de sensibilité en ce qui concerne le positionnement fine à un fort grossissement, utilisez le joystick pour contrôler le micro aiguille et bouscule les chromosomes à l’intérieur de la cellule. Gardez la pointe de l’aiguille au-dessus du plan des cellules.
   2. Pour tirer ou déplacer un chromosome, se concentrer sur un chromosome près du sommet de la cellule.
      Remarque : Ces chromosomes sont plus faciles à manipuler-manipuler les chromosomes proche de que la lamelle couvre-objet, il est probable que l’aiguille va moudre dans la lamelle, éclatement de la cellule et de mettre fin à l’expérience.
   3. Ajuster l’axe z sur la manette pour mettre la pointe de l’aiguille en focus et puis déplacer l’aiguille pointe avec le joystick en X et Y. Placer l’extrémité de l’aiguille directement sur le chromosome pour être manipulés et le pousser dans la direction souhaitée afin de permettre le manipulateur à repositi sur le chromosome.
   4. Selon quelle distance le chromosome est poussé, soit appliquer une tension sur le chromosome ou appliquer une tension suffisante pour détacher un chromosome de la broche. Une fois qu’un chromosome est enlevé d’une broche, le placer n’importe où dans la cellule.

Résultats

La figure 6 montre une micromanipulation échantillon de 2 spermatocytes primaires adjacentes sauterelle dans plusieurs exemples des utilisations possibles de micromanipulation. Cette expérience a été faite à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée,. 0:00 (les heures indiquées sont en min:s) image montre les deux cellules avant la manipulation. Un chromosome dans la cellule inférieure apparaît plus sous tension appliquée par l’aig...

Discussion

Avec la pratique, de déplacer des chromosomes dans la cellule peut devenir une seconde nature. Les aiguilles qui sont suffisamment rigides et suffisamment mince pointe sont difficiles à « obtenir le don de » fabriquer, mais cette capacité est également livré avec la pratique. Les aiguilles qui sont si fines qu’elles déforment quand ils sont déplacés dans le Huilehalocarbone ne sera pas utiles pour pousser les chromosomes de la cellule. Les aiguilles qui sont tellement brutal que leurs conseils sont visibles...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300