Échafaudage conductrice de moduler et de fournir des cellules souches

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication d’un système de culture cellulaire pour permettre à l’ensemencement des cellules souches sur un échafaudage de polymère conducteur pour in vitro la stimulation électrique et subséquent en vivo l’implantation de l’échafaudage graines cellules souches en utilisant un technique mini-invasive.

Résumé

Thérapie de cellules souches a émergé comme une course passionnante thérapeutique, mais la méthode de livraison optimale reste floue. Alors que la technique de microinjection a été utilisée pendant des décennies pour fournir des cellules souches dans des modèles de course, cette technique est limitée par le manque de capacité à manipuler les cellules souches avant l’injection. Ce livre présente en détail une méthode d’utilisation d’un échafaudage de polymère conductrice pour la livraison de cellules souches. La stimulation électrique des cellules souches à l’aide d’un échafaudage de polymère conducteur modifie les gènes de la cellule souches impliquées dans la survie cellulaire, réponse inflammatoire et remodelage synaptique. Après préconditionnement électrique, les cellules souches sur l’échafaud sont transplantés de données dans un modèle de rat occlusion distale artère cérébrale moyenne. Ce protocole décrit une technique puissante pour manipuler des cellules souches par un échafaudage de polymère conducteur et crée un nouvel outil pour développer la thérapie axée sur les cellules souches.

Introduction

L’AVC est la deuxième cause de décès dans le monde et la cinquième cause de décès aux États-Unis. Malgré ces taux de mortalité élevé, les traitements pour la récupération de l’AVC restent actuellement un défi avec aucune des options viables médicaux actuellement disponible¹. On compte actuellement environ 300 essais cliniques traitant des accidents vasculaires cérébraux ischémiques, dont 40 seulement utiliser les cellules souches. Des études antérieures ont montré que les cellules souches ont un effet bénéfique sur AVC réparation^2,3. Facteurs paracrines comme facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et la thrombospondine-1 (INCULPER-1) libérés par les cellules progénitrices neurales humaines transplantées (hNPCs) ont montré amélioré la récupération fonctionnelle par le biais de mécanismes associés à une augmentation Synapse formation, angiogenèse, ramifications dendritiques et nouvelles projections axonales, ainsi que moduler le système immunitaire^4,5,6. Cependant, les méthodes de livraison optimal des cellules souches demeurent insaisissables.

Livraison réussie des cellules souches au cerveau reste un défi. Actuellement, hydrogel injectable et systèmes d’échafaudage polymères ont été introduites pour fournir des cellules souches. Ces méthodes de livraison protègent les cellules souches au cours de la transplantation ainsi qu’offrent une protection contre l’environnement hostile de post-accident vasculaire cérébral dont la réponse inflammatoire de l’hôte et des conditions d’hypoxie^{7,8,9 , 10}. Cependant, les matériaux couramment utilisés sont inertes, qui limite l’utilisation de la modulation continue (c.-à-d., stimulation électrique) des cellules¹¹. La stimulation électrique est une piste qui influe sur la différenciation, densité de canaux d’ion et la croissance des neurites des cellules souches¹². Par rapport aux polymères inertes, les polymères conducteurs peuvent transporter un courant permettant la stimulation électrique et la manipulation des cellules souches². Toutefois, le mécanisme précis par lequel la stimulation électrique module libération du facteur neurotrophique (c.-à-d. BDNF et INCULPER-1) n’est pas encore complètement exploré.

Dans ce protocole, nous décrivons les étapes pour construire un système de culture cellulaire, constitué d’un échafaudage de polymère conducteur, polypyrrole (PPy), qui permet pour in vitro la stimulation électrique. En raison de la manière dont le système de culture cellulaire est fabriqué, implantation ultérieure de l’échafaudage de cellules souches semées sur le cortex péri-infarctus est possible. Pour ce système, nous préconditionner électriquement des cellules souches sur l’échafaud pour un court laps de temps avant l’implantation. Après une stimulation électrique, l’échafaud de polymère conducteur transportant les cellules est correctement implanté données à l’aide d’une méthode peu invasive.

Protocole

Toutes les procédures d’animaux et de cellules souches ont été approuvées par le Comité de surveillance de recherche de cellules souches de Stanford et de la Commission Administrative de l’Université de Stanford sur Laboratory Animal Care (SCRO-616 et APLAC-31909).

1. la gravure du verre ITO

1. Préparer l’indium tin oxyde (ITO)-lame de verre couverte en plaçant un agent masquant sur le côté conducteur de la vitre.
   NOTE : Les bandes transparentes plus commerciales peuvent servir comme un agent masquant.
   1. Retirez le masque excès à l’aide d’une lame, laissant seulement la forme désirée de la conception finale de ITO couvert sur le verre.
2. Mélanger 5 % (v/v) d’acide nitrique et de 45 % (v/v) de HCl dans un bécher de verre à l’intérieur d’une hotte aspirante pour préparer la solution de décapage.
   1. Utiliser une plaque chauffante et un thermomètre pour s’assurer que la température de la solution de gravure est à 70 ° C.
3. Une fois que la solution de décapage atteint 70 ° C, placer la diapositive masquée-ITO verre dans la solution pendant 2 minutes pour enlever la couche d’ITO excédentaire.
   NOTE : Masquage ruban protège la couche d’ITO de l’exposition à une solution d’acide.
4. Retirer la lame de la solution et rincer avec désionisée (DI) H₂O.
5. Retirer délicatement la résistance masque et mesure à l’aide d’un multimètre pour s’assurer que l’OTI restant est intact. Affichage de la zone décapée souhaitée devrait être environ 0 Ω.

2. préparation de la Solution de Pyrrole

1. Dans une bouteille en verre 1000 mL, dissoudre 70 g de sodium dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) dans 600 mL de DI H₂O.
2. Une fois que le NaDBS est dissous, ajoutez 14 mL de 0,2 M pyrrole et 386 mL de DI H₂O à la solution.
3. Couvrir la solution avec du papier aluminium et conserver à 4 ° C.

3. dépôt électrolytique de Polypyrrole sur verre ITO

1. Chauffer la solution de pyrrole à température ambiante jusqu'à ce que NaDBS est redissous entièrement.
   Remarque : Cela prend environ 15 à 20 minutes.
2. Verser 25 mL de la solution de pyrrole dans un bécher.
3. Connectez le verre dépoli de ITO à un multimètre et plonger la lame dans la solution de pyrrole.
   1. Faire en sorte que le 0 résistance Ω fait face vers l’électrode de référence de platine maille.
4. Appliquer un courant électrique pour ouvrir la galvanoplastie de PPy sur la surface de ITO à l’aide d’un multimètre (courant contrôlé à 3 mA/cm² pour 4 heures).
5. Retirez le verre ITO le multimètre et laver plaqué-PPy DI H₂O pour supprimer l’agent tensio-actif résiduel.
6. Doucement, retirer la plaque plaqué-PPy diagonalement ITO à l’aide d’une lame de rasoir.
   1. Stocker la plaque PPy à température ambiante.

4. préparation du polydiméthylsiloxane (PDMS)

1. À l’aide d’une spatule et un plat de peser, mélanger 18 g d’agent de base avec 2 g de salaison et versez le mélange dans des moules de verre deux 10 x 8 cm.
2. Retirer les bulles de moules à l’aide d’une chambre à vide pendant 15-20 minutes.
3. Placer les moules dans un four à 70 ° C pendant 3 h.
4. Une fois refroidi, utilisez une spatule plate pour retirer le PDMS les moules.

5. fabrication de la chambre de Stimulation électrique In Vitro

1. Autoclave, les plaques de métal (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) et débit vannes à 120 ° C pendant 1 heure.
2. À l’aide d’une diapositive de chambre comme gabarit, couper deux morceaux de PDMS.
   NOTE : Une seule pièce de PDMS sert le périmètre de la chambre de cellules avec des découpes de deux carrés contigus au sein de la chambre de la cellule. L’autre morceau PDMS est un plan du périmètre de la chambre.
   1. Couper l’intérieur chambre de cellule afin qu’elle soit carrée en forme et correspond à la forme de la chambre de la cellule. Veiller à ce que la forme globale des deux pièces du PDMS est rectangulaire et correspond à celui de la diapositive de la chambre.
3. Les matériaux de couche comme suivant de bas en haut : (1) Plaquemétallique, PDMS (2) (sans découpes), (3) PPy plaque (perpendiculaire au PDMS), (4) le PDMS (découpes) et chambre de cellules (5).
4. Fixer l’appareil ensemble une fois qu’il est parfaitement aligné.
5. Coupez deux morceaux de 60 cm d’un fil métallique et pâte d’argent permet d’attacher un fil à chaque extrémité de la plaque de PPy qui fait saillie à l’extérieur de la chambre. Veiller à ce que les fils sont assez longs pour s’étendre de l’appareil à l’extérieur d’un incubateur.
6. Une fois que la pâte d’argent est guérie, renforcer et rendre étanche la liaison métallique avec revêtement époxy.
   1. Enregistrer la résistance à l’aide d’un multimètre pour s’assurer que le champ appliqué est le même dans chaque chambre.
   2. Pour l’implantation, enlever les fils ; les chambres de la cellule de desserrage et PDMS, puis les séparent de l’échafaud conductrice. La dimension des échafaudages implantés est environ 1 x 3 x 0,25 mm.

6. placage humain cellules progénitrices neurales (hNPCs) sur PPy

1. Stériliser les chambres assemblés sous la lumière UV pendant 2 heures.
   1. Après 1 heure, faire pivoter l’assemblage chambres de 90°.
2. Après stérilisation, recouvrir la surface de PPy au fond de la chambre avec 800 µL d’un substrat de revêtement et laisser le substrat se solidifier sur la plaque de PPy dans un incubateur à 37 ° C à 5 % de CO₂ pendant 1 h.
3. Après une heure, retirer le surnageant de chambers et rincer doucement avec 1 mL de SPD + Ca + Mg / puits.
   Remarque : Évitez de laver la surface du PPy avec force, car cela provoquerait le détachement du substrat enduit.
4. À l’aide de milieux cellulaires fraîches, mécaniquement se dissocient les cellules cultivées pour une utilisation avec les chambres d’une plaque de culture tissulaire avec douceur de pipetage.
   Remarque : Les cellules doivent être anastomosé de 90-100 % à la dissociation.
5. Recueillir des granulés hNPC par centrifugation à 8000 x g pendant 5 minutes.
6. Utilisant un hémocytomètre, compter et remettre en suspension les cellules à un volume de 100 000 cellules/cm².
7. Plaque de 100 000 cellules dans chaque chambre bien (100 000 cellules/cm² dans 1 mL de médias).
8. Retour des chambres dans l’incubateur à 37 ° C à 5 % de CO_2.

7. électrostimulation de hNPCs

1. Un jour après l’ensemencement les cellules dans les chambres, utilisez un générateur de signaux pour appliquer une stimulation électrique aux cellules.
2. Avant la stimulation, supprimer les anciens médias dans chaque chambre de bien et de reconstituer avec 800 µL de supports neufs.
3. Après changement de médias, replacez les chambres dans l’incubateur, étendre les fils hors de l’incubateur et les attacher à un générateur de signaux
4. Appliquer la stimulation aux cellules avec un signal carré à ±400 mV avec 100 Hz pendant 1 h.
5. Après la stimulation, enlever les fils et incuber les chambres pour un autre jour dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
6. Effectuer des analyses biologiques ultérieures dont la viabilité cellulaire et quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) suivant le protocole du fabricant.

8. in Vivo PPy Implantation

1. Effectuer des modèles de temps de l’occlusion distale artère cérébrale moyenne (dMCA) sur des lymphocytes T-deficient rats nus mâles adultes (NIH-RNU 230 ± 30 g) comme décrit précédemment². Effectuer l’occlusion implantation une semaine post-dMCA.
2. Un jour avant l’opération, donner ampicilline (1 mg/mL) pour les rats dans l’eau de leur cage.
3. Anesthésier le rat dans une chambre d’induction à l’aide 0.5 - 3 % mg/kg d’isoflurane administré par inhalation.
4. Confirmer anesthetization du rat par l’absence de réaction réflexe de la toe pincée.
   1. Alors que l’animal est sous anesthésie, continuer à suivre sa membrane couleur, mode de respiration et la température rectale toutes les 15 minutes.
5. Une fois qu’anesthetization est confirmée, appliquer des larmes artificielles sur les yeux du rat pour prévenir le dessèchement.
6. S’assurer qu’une technique aseptique est maintenue au cours de cette procédure en utilisant des gants stériles et un drapé chirurgical stérile¹³. Garder les instruments chirurgicaux stériles dans un champ stérile.
7. Bien que le rat soit sous anesthésie, percer une craniectomie au-dessus du cortex gauche. Ouverture de la dure-mère.
   1. Retirez la dure-mère du cerveau à l’aide d’une aiguille mince chirurgicale.
8. Les échafaudages conductrices du système in vitro sur le cortex de rat de l’implant.
   NOTE : Pour nos expériences, nous avons implanté échafaudages de in vitro lendemain 3 hNPC placage.
   1. Placer l’implant principalement sur la pénombre cortex médial à la lésion de l’accident vasculaire cérébral.
9. Après que l’échafaudage est placé, placez hémostatique sur l’implant pour empêcher tout mouvement de fermeture de la peau.
10. Suture de la plaie fermée et injecter par voie sous-cutanée les rats avec buprénorphine SR à la dose de 1 mg/kg pour gérer la douleur associée à la chirurgie stéréotaxique et occlusion de la dMCA.
11. Placez le rat dans une cage de récupération car il reprend conscience.
    1. Ne jamais laisser l’animal sans surveillance alors qu’il est inconscient.
    2. Ne pas placer l’animal avec les autres jusqu'à ce qu’il a pris pleinement conscience.
12. Surveiller les animaux tous les jours des signes de douleur, y compris la perte de poids de corps, absorption réduite de nourriture/eau, pelage hirsute/toilettage réduite, diminue/augmente l’activité spontanée, posture anormale, déshydratation cutanée sous la tente, les yeux enfoncés, masquage, automutilation, respiration rapide, respiration bouche ouverte, tics, tremblements, tremblements et vocalisation.
    1. Surveiller les animaux tous les jours jusqu'à ce qu’il semble qu’ils sont manger, boire, toilettage et prendre du poids ; et puis toutes les semaines après la prise de poids.
13. Euthanasie au début par l’inhalation de CO₂ et une confirmation secondaire d’euthanasie (pour s’assurer que l’animal ne sera pas revivre en raison de l’inhalation de₂ CO d’oxygène normale d’alimentation post a) se produira à tout animal qui semble être de ne pas manger, boire et prise de poids après l’intervention chirurgicale initiale ; apparaît dans la douleur ; ou semble incapable de terminer les tests comportements en raison d’un plus grand que prévu le déficit du cortex moteur.

Résultats

Le schéma de la Figure 1 représente le flux de travail global de la stimulation électrique des hNPCs et des éventuelles applications en aval. Une limitation de courant dans la thérapie de cellules souches, c’est que les cellules souches sont exposés à un environnement d’après la transplantation dur notamment l’inflammation et conditions ischémiques. Ces conditions difficiles susceptibles de limitent leur efficacité thérapeutique

Discussion

Plus en plus évident a démontré la promesse des cellules souches comme une thérapie de nouveaux accidents vasculaires cérébraux. Cette promesse a entraîné un effort majeur pour faire progresser la thérapeutique de cellules souches au chevet du malade au moins 40 essais cliniques en cours ou achevés. Pathologie de la course propose un trouble neurologique unique qui se prête à la thérapie de cellules souches, parce qu’après l’insulte aiguë, il n’y a aucun processus neurodégénératif empêchant la r?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706