Non invasive, High-throughput détermination de la durée du sommeil chez les rongeurs

Résumé

Nous décrivons une méthode de haut-débit de mesure sommeil au moyen fondé sur l’activité de surveillance maison-cage. Cette méthode présente des avantages par rapport aux méthodes traditionnelles axées sur l’EEG. Il est bien validé pour la détermination de la durée totale du sommeil et peut être un outil puissant pour surveiller le sommeil dans les modèles de maladies humaines.

Résumé

Traditionnellement, le sommeil est surveillé par un électroencéphalogramme (EEG). EEG études chez les rongeurs nécessitent l’implantation chirurgicale des électrodes suivie d’une période de récupération long. Pour effectuer un enregistrement de l’EEG, l’animal est connecté à un récepteur, créant une attache contre nature pour la tête-Mont. Surveillance EEG prend beaucoup de temps, porte mise en danger de l’animal et n’est pas un environnement complètement naturel pour la mesure de sommeil. Méthodes alternatives pour détecter le sommeil, en particulier dans un mode haut débit, ferait progresser considérablement le domaine de la recherche du sommeil. Nous décrivons ici une méthode validée pour la détection de sommeil via axée sur l’activité de surveillance maison-cage. Des études antérieures ont montré que sommeil évalué par le biais de cette méthode a un haut degré d’accord avec définie par les mesures traditionnelles axées sur l’EEG de sommeil. Considérant que cette méthode est validée pour la durée totale du sommeil, il est important de noter que le sommeil combat durée devrait être évaluée par un EEG qui a la meilleure résolution temporelle. L’EEG permet de distinguer aussi paradoxal (REM) et non le sommeil paradoxal, ce qui donne plus de détails sur la nature exacte du sommeil. Néanmoins, détermination fondés sur l’activité de sommeil peut être utilisée pour analyser plusieurs jours de sommeil paisible et évaluer le sommeil comme une réponse à un événement aigu (comme le stress). Ici, nous montrons la puissance de ce système pour détecter la réponse de souris aux injections intrapéritonéales quotidiennes.

Introduction

Sommeil a des fonctions importantes pour la restauration du corps et du cerveau après la charge quotidienne d’éveil¹. Il a été démontré que le sommeil joue un rôle dans la conservation de la mémoire et de la plasticité cérébrale générales¹. L’EEG est l’étalon-or pour détecter le sommeil². Chez les rongeurs, surveillance EEG nécessite l’implantation chirurgicale d’électrodes apposées sur un tête-Mont, après quoi l’animal a besoin d’une période de temps pour récupérer². Après la récupération, l’animal est attaché à l’appareil d’enregistrement et est donné à une autre période d’accoutumance². En raison de ces périodes nécessaires de récupération et de l’accoutumance, EEG est fastidieux et laborieux et ne peut être raisonnablement effectué à grande échelle. En outre, l’intervention chirurgicale de l’implantation de l’électrode comporte un risque inhérent à l’animal. Enfin, l’analyse des données pour la notation de sommeil dans les études de l’EEG est également très laborieuse. Une alternative, méthode non invasive, haut débit de sommeil suivi faciliterait grandement recherche rongeurs sommeil.

Un activité maison-cage système de surveillance permettant de détecter le sommeil porte sur les limitations des études EEG. Le principe simple est qu’un animal inactif est probablement un animal dormant. Il a été démontré que 40 s d’inactivité continue (binned dans des époques de s 10) est une mesure fiable du sommeil tel que mesuré avec un EEG (montré avoir accord de 88 à 94 %)³. Systèmes de surveillance de domicile-cage peuvent servir à étudier les grands groupes d’animaux avec des temps de préparation minime. Nous avons montré qu’il faut animaux environ une journée pour s’habituer à un logement individuel dans le système surveillance⁴ maison-cage, contrairement à des semaines de récupération nécessaire pour EEG études². En outre, certaines configurations peuvent aussi détecter les paramètres physiologiques tels que la température centrale du corps, rythme cardiaque, l’activité et l’alimentation. La température et la fréquence cardiaque sont déterminés à partir de l’implantation d’un petit émetteur. Ces paramètres peuvent fournir plus d’informations sur la souris et peuvent servir à ajouter à notre compréhension du sommeil et comment il est affecté en parallèle avec l’enregistrement du sommeil.

Bien qu’il soit un outil puissant, il y a certaines limitations, aux types de données qui peuvent être acquis auprès d’activité-Accueil-cage surveillance. Des études EEG peuvent différencier REM et non le sommeil paradoxal, qui peut être important pour une compréhension plus profonde de l’architecture du sommeil. Systèmes de surveillance de l’accueil-cage d’axée sur l’activité ne peuvent fournir de données pour la durée totale du sommeil. En outre, bien que la sortie pour la surveillance de domicile-cage axée sur l’activité fournit des informations sur la durée du sommeil combat, nous ne pouvons pas évaluer avec précision la durée du combat en raison de la limitation inhérente de 40 s intervalles³. Malgré ces limites, cage d’accueil suivi de la durée du sommeil fournit une mesure biologique importante qui peut-être influer sur nombreux facteurs en aval, notamment la santé de l’animal et comportement⁵.

Fondé sur l’activité de surveillance maison-cage a été utilisé pour détecter le sommeil dans de nombreuses études indiquant sa polyvalence. Nous citons un échantillon de ces études^{4,6,7,8,9,10,11,12}. En plus de la méthode présentée, il y a autres méthodes de détection de sommeil via basé sur les activités de surveillance, contenant chacune ses propres limites^13,14. Certaines de ces études examinent les longues périodes de sommeil ininterrompu (72 h) tandis que certains examiner sommeil en blocs de 24 h. Dans cette étude, nous présentons l’analyse du sommeil pour chaque période de 24 h après la réponse aux injections intrapéritonéales quotidiennes de (IP) et à des changements périodiques de cage dans un modèle murin de (souris deFmr1 KO) le syndrome de le X fragile. Nous avons choisi des souris KO Fmr1 parce qu’ils ont réduit le sommeil⁴ et sont hypothétiquement hyper réactifs aux informations sensorielles¹⁵. Nos résultats mettent en évidence la capacité de détecter des changements dans les habitudes de sommeil en réponse à un événement stressant. Cette méthode est idéale pour obtenir des informations générales sur le sommeil dans des cohortes de souris. La méthode peut être utile pour comprendre les effets des altérations génétiques spécifiques sur le sommeil, les effets des traitements pharmacologiques, ou les réponses aux événements, comme un facteur de stress. En outre, la méthode fournit un moyen simple de dépistage pour une réponse avant d’entreprendre des études plus impliqués.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de National Institute of Mental Health Animal Care et effectués selon le National Institutes of Health Guidelines sur le soin et l’utilisation des animaux.

1. mise en place des unités de détection dormir

1. Acheter le nombre désiré d’unités et de logiciels.
2. Suivez les instructions pour mettre en place les systèmes de surveillance.
   1. Aligner un détecteur en face d’un émetteur. Assurez-vous que les rayons infrarouges sont vers l’intérieur et sont alignés à la même hauteur.
   2. Utilisez les vis fournies pour positionner les détecteurs et les émetteurs à la hauteur désirée sur le support en métal. Cette hauteur doit être ajustée pour que la litière de la cage est au-dessous du niveau des faisceaux infrarouges, mais la poutre est à la hauteur voulue pour détecter l’activité de l’animal. Cela crée une zone interne de 27 cm × 32 cm (10.625 × 12,75 po).
      1. Si les autres vis sont nécessaires, achat plus à un matériel stocker (6-32 ¼ po vis à tête cylindrique).
3. Reliez chaque détecteur avec chaque émetteur. Connectez l’émetteur sur le hub fourni relié au récepteur. Exécutez cette fonction pour le x et les y avions. Répétez cette étape pour toutes les configurations.
4. Connectez le récepteur à un ordinateur avec le hub USB fourni.

2. Configuration du logiciel

1. Installez le logiciel d’analyse et sélectionnez le fichier de configuration de matériel fourni par défaut. Le fichier de configuration du matériel doit être changé uniquement par la société.
2. Cliquez sur le fichier | Ouvrez Configuration de l’expérience. Ouvrir la configuration d’expérience par défaut.
3. Cliquez sur expérience | Propriétés.
4. Cliquez sur l’onglet numérisation . changer le taux de numérisation à 10 s.
5. Cliquez sur l’onglet activité changer le taux d’activité d’échantillonnage à 10 s.
6. Cliquez sur le fichier | Enregistrez expérience en tant que d’enregistrer ces paramètres de configuration pour de futures expériences.

3. animaux Setup

1. La maison individuellement les souris dans des cages propres qui sont 31 cm (12,25 po) de longueur et 16,5 cm (6,5 po) de largeur. Pour empêcher la souris de s’accumuler la litière et obstruant les poutres, utilisez literie à une profondeur de 3 mm. Ne fournissent pas les autre matériaux de nidification pour les souris.
2. Fournir les souris avec accès à la nourriture et d’eau ad libitum au moyen d’un dévidoir qui est situé dans la partie supérieure de la cage hors de la voie les poutres. Si nécessaire, remplir de la nourriture et changer les bouteilles d’eau quand les cages sont changés tous les 3-5 jours pendant toute la durée de l’étude.
3. Aligner la cage de la souris à l’intérieur le faisceau infrarouge mis en place, en veillant à ce qu’il repose environ au milieu des poutres pour une couverture complète.
4. Assurez-vous que la lumière cycle sombre de la pièce est définie sur le cycle de lumière sombre des conditions normales de logement des souris en miroir, ou changer comme vous le souhaitez basé sur l’expérience.

4. préparation et Injections de drogue

1. Obtenir de l’eau stérile et cyclodextrine stérile.
2. Pour toutes les injections, utiliser une seringue de 1 mL avec une aiguille hypodermique de 25,5 à 30,5 G. Une nouvelle aiguille stérile et la seringue doivent être utilisés pour chaque souris.
3. Pour réduire le temps entre les injections, assemblez toutes les seringues à l’avance.
4. Pour les injections de cyclodextrine : préparer la solution de cyclodextrine en ajoutant 3 g de cyclodextrine à 10 mL d’eau pour faire une solution de cyclodextrine de 30 %.
5. Administrer 0,3 mL de sérum physiologique ou de cyclodextrine par injection Intrapéritonéale.

5. logiciel Record dormir

1. Ouvrez le fichier de configuration de matériel par défaut.
2. Cliquez sur le fichier | Ouvrez Configuration de l’expérience. Ouvrez le désiré ou default configuration d’expérience.
3. Cliquez sur expérience | Le programme d’installation.
   1. Désigner l’emplacement où sauvegarder le fichier de données, mais aussi un emplacement pour enregistrer le fichier de sauvegarde. Le logiciel requiert que le fichier de données stocké dans les Fichiers de programme sous le dossier de programme spécifique.
      Remarque : étant donné que certains ordinateurs ouvrir les Fichiers de programme comme sensibles, l’accès au fichier de données n'est pas possible après l’expérience. Par conséquent, il est recommandé d’enregistrer le fichier de sauvegarde dans un autre quartier non sensibles sur l’ordinateur local.
   2. Désigner l’animal ID à chaque veille de chambre et de saisir le poids de l’animal si vous le souhaitez. Si une chambre n'est pas utilisée dans l’expérience, en décochant la case désactivera cette chambre. Après avoir entré les informations d’identification, cliquez sur terminé.
4. Cliquez sur le fichier | Enregistrez expérimenter en tant que pour enregistrer la configuration actuelle d’expérience sous le nom de fichier souhaité.
5. Cliquez sur expérience | Exécutez ou F5 pour démarrer l’enregistrement. Attendez une ère de 10 s pour s’assurer que toutes les chambres sont ramasser d’activité. Comme les animaux ont été injectées juste, il est fort probable que les animaux se déplacera suffisamment pour être détectés par les rayons infrarouges.
   1. Si aucune activité n’est détectée, essayez de déplacer la cage souris manuellement pour s’assurer que les poutres ramasser le mouvement. Poursuivez le dépannage ou le déplacer vers une chambre de travail si l’activité n’est toujours pas enregistrée.
      Remarque : Exécutez l’expérience dès que les injections sont finies.
6. Couvrir les écrans d’ordinateur avec une couverture opaque pour bloquer la lumière. Couvrir les feux clignotants sur le témoin d’activité.
7. Exécutez l’expérience pendant 24 h.
   Remarque : En raison du temps nécessaire pour effectuer les injections, il sera pas un complet 24h. Les injections doivent être effectuées en même temps tous les jours. Sommeil ne devrait pas être enregistré lors des injections.
8. Le lendemain, à l’époque des injections, cliquez expérience | Arrêt pour arrêter l’enregistrement. Cliquez sur le fichier | Export | Générer l’objet CSVs pour recueillir les données brutes pour chaque souris.
   Remarque : Il peut prendre un certain temps à exporter, donc cela immédiatement et puis procéder aux injections pendant que l’ordinateur est le traitement.
9. Cliquez sur le fichier | Export | Sommeil pour exporter le fichier de sommeil de chaque expérience en ouvrant le raw. Fichier de données CFDC sur n’importe quel ordinateur qui a le logiciel installé.
   1. Sous Paramètres de détection activité Source, assurez-vous que l’axe x et l’axe des y de cases correspondantes sont cochées.
   2. Sous Sommeil des époques de seuil, vérifiez que les 4 époques sont sélectionnés.
   3. Sous le Seuil de sommeil, seuil de l’activité, assurez-vous que les comtes 0 sont activées.
   4. Sous Cycle lumière/obscurité, vérifier le moment propice pour le cycle lumière/obscurité.
   5. Au titre de la Fenêtre d’analyse, sélectionnez la durée souhaitée pour l’analyse. Dans le cas des études de l’injection, laissez le jour comme valeur par défaut. Régler l' heure de début comme ExpSTART. Régler la durée que 24 h 00 pour 24 h. analyse en utilisant que le logiciel peut être effectué pour un maximum de 72 h.
   6. Enregistrez la configuration pour gagner du temps pour exporter des données.
   7. Cliquez sur mise à jour.
   8. Cliquez sur Générer un fichier CSV , puis enregistrez le fichier vers l’emplacement souhaité.

6. analyse de données

1. Pour chaque session d’enregistrement, ouvrez le fichier de sommeil. Pour attribuer l’ID d’objet, ouvrez le fichier CSV individuels pour chaque chambre déterminer l’ID de l’objet. Enregistrer le TOT sommeil HH pour la lumière et les phases sombres pour tous les animaux.
   1. Recherchez le fichier CSV sujet individuel incohérences indiquant l’échec de l’enregistrement. Si le nombre de feux de route est détectés dans un seul plan, mais aucun décompte n’est observés sur un autre plan, cela indique un échec de faisceau.
      NOTE : Le « sleeping % » pour les phases de la lumière et l’obscurité est calculé sur la durée d’enregistrement totale, qui inclut les phases claires et foncées. Pour cycles de 12 h de lumière/obscurité, multipliez ce nombre par 2 pour obtenir le « sleeping % » dans les 12 h de lumière ou de la phase nocturne. Étant donné que les études d’injection ne vont pas pour une pleine 24h, calculée « % sleeping » n’est pas exact. Pour générer le bon « % sleeping », diviser le « hh : mm : TOT sleep » par le « temps écoulé Experiment : HH, » multiplier par 2 et multiplier par 100 pour obtenir le pourcentage. Si les injections ont été réalisées dans la phase éclairée, alors seulement la phase éclairée doit être réglée de cette manière.
2. Étant donné que les phases et des jours différents sont comparés entre eux, analyser la durée de sommeil pour cent pour chaque étape et chaque jour.

Résultats

Pour déterminer l’effet des injections quotidiennes sur le sommeil et la question de savoir si les animaux s’habituer aux injections, nous avons réalisé des injections quotidiennes de IP pendant 14 jours consécutifs à 09:00 (cycle de lumière a commencé à 06:00) et durée du sommeil a enregistré 12 souris Fmr1 KO C57Bl/6J. Nous avons utilisé un dans la conception des sujets, injecter chaque animal avec une solution saline normale pendant 4 jours consécutifs (1-4 jou...

Discussion

Nous présentons ici une méthode non invasive, haut débit pour la détermination de la durée du sommeil basée sur le contrôle de l’activité dans la maison-cage. Cette méthode d’évaluation de la durée totale du sommeil a été validée à l’EEG études³. Fondé sur l’activité de surveillance maison-cage, c’est simple, non invasif et applicables aux études de population dans un grand nombre d’animaux. Elle est limitée car il ne peut pas donner des renseignements détaillés s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Equipment and software to analyze sleep duration
Captisol Research Grade	Captisol	RC-0C7-100	Captisol for dissolving hydrophobic compounds
30 G BD Needle 1/2 inch	BD	305106	Needle for injections
BD Disposable Syringes	Fisher	14-823-30	Syringes for injections
B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J	Jackson Labs	3025	Fmr1 KO mice
Super Mouse 750 Mouse Cage	Lab Products, Inc.		Homecages for the mice
SANI-Chips Bedding	PJ Murphys		Bedding for the mice