Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Nous décrivons ici un protocole pour la segmentation automatique des tissus fluorescent étiquetés sur les diapositives à l’aide d’un système d’analyse de haute teneur widefield (WHCAS). Ce protocole a de nombreuses applications dans n’importe quel domaine qui implique la quantification de marqueurs fluorescents dans les tissus biologiques, y compris les sciences biologiques, ingénierie médicale et sciences de la santé.
Automatisé de numérisation de diapositives et segmentation des tissus fluorescent marqué est le moyen le plus efficace pour analyser ensemble diapositives ou des coupes de tissus grand. Malheureusement, de nombreux chercheurs passent énormément de temps et de ressources en développement et optimisation de flux de travail qui n’est pertinentes que pour leurs propres expériences. Dans cet article, nous décrivons un protocole qui permet à n’importe quel tissu monté sur glissière, avec options de personnalisation dans les modules précompilés trouvée dans le logiciel associé à l’image de ceux qui ont accès à un système d’analyse de haute teneur widefield (WHCAS). Pas prévu pour la numérisation de diapositives, les étapes détaillées dans cet article permettent d’acquérir des diapositive, numérisation des images dans le WHCAS qui peut être importé dans le logiciel associé. Dans cet exemple, la segmentation automatique des diapositives de tumeur de cerveau est démontrée, mais la segmentation automatique de n’importe quel marqueur fluorescent marqué nucléaire et cytoplasmique est possible. En outre, il y a une variété d’autres modules de logiciels quantitatives, y compris les dosages pour la localisation/la translocation des protéines, prolifération/viabilité / l’apoptose cellulaire et l’angiogenèse qui peut être exécuté. Cette technique va économiser l’effort et le temps des chercheurs et créer un protocole automatisé pour l’analyse de la diapositive.
La quantification exacte et précise des tissus fluorescent marqué sur des lames est une technique très recherchée dans de nombreux domaines scientifiques. Cependant, chercheurs comptent des spécimens souvent manuellement ou dépensent des sommes considérables de temps à développer des techniques automatisées ésotériques pour y parvenir. Ici, nous fournissons un protocole pour la numérisation automatique pour lames et la quantification des cellules à l’aide d’un WHCAS et son logiciel associé, avec des cellules immunitaires innées dans les sections de tumeur de cerveau humain congelé à titre d’exemple. Le logiciel associé propose une large gamme de modules personnalisables intégrés de la croissance des neurites comptant à la différenciation des cellules types1,2,3,4,5, 6. l’objectif de cette méthode consiste à fournir aux chercheurs un protocole début à la fin, facilement reproductible à acquérir des images d’et à quantifier les entités fluorescent marqué dans n’importe quel tissus monté sur glissière.
Dans ce protocole, la WHCAS est principalement utilisé pour l’imagerie des plaques pour l’analyse subséquente sur les logiciels associés même si une diapo et les bases de glisser balayage7 étaient disponibles. C’était prohibitif pour diapositives d’image car l’étalonnage attention spatiale de la zone d’acquisition, la sélection des revues appropriés, la création d’équipements sur mesure et une liaison avec les représentants de produit ont été nécessaires. Dans le corps plus large de la littérature, au lieu d’acheter un dédié diapositive-imagerie et analyse appareil8, un précédent rapport technologique ayant accès à ce logiciel contourné l’acquisition d’images de diapositives sur le WHCAS au total9. Analyse d’image acquisition ou image sur différentes plateformes, nécessite un travail supplémentaire pour s’assurer que chacun est compatible avec l’autre.
La possibilité d’utiliser le WHCAS et son logiciel de capture d’image permettrait d’éviter les complications inutiles de chercher ou de développer un étranger de flux de travail à ces outils. Dans cet article, les étapes requises pour créer un scan d’aperçu de faible grossissement et les images correspondantes de fort grossissement en traitant la diapositive comme une plaque, et les analyses subséquentes en utilisant le module segmentation multi-longueur d’onde cellule marquant permettant la réaffectation de la WHCAS. Ce protocole facilement utilisable fournit un avantage sur les autres techniques car il n’y a aucune nécessité de développer des algorithmes ou multi-étapes comptage protocoles10,11 une fois que les images sont acquises sur le WHCAS. Ce protocole atténue le temps nécessaire pour optimiser une technique de dosage, est plus précis de12 et plus efficace que le comptage manuel et maximise l’utilisation de la WHCAS. Ce protocole peut être facilement et largement utilisé car il permet l’imagerie et l’analyse de n’importe quel tissus fluorescent marqué sur des lames.
Les échantillons de tumeur ont été obtenus conformément au protocole approuvé par le Comité de Conseil et de l’éthique examen local de l’établissement et conformément à la réglementation nationale. Le WHCAS et ses logiciels associés utilisés dans cet article sont énumérés dans la Table des matières.
1. importer les journaux
2. création de paramètres d’aperçu Scan Acquisition
3. Créez des paramètres pour l’Acquisition de la diapositive à fort grossissement
4. Placer la diapositive dans le système d’analyse Widefield haute teneur
5. acquérir un aperçu de la numérisation
6. fort grossissement de numérisation
7. image Analysis
Les images peuvent être visualisées dans le logiciel WHCAS. La figure 8 montre les vignettes de grossissement élevé de tous les sites dans la région définie d’intérêt. Examiner chaque site afin d’identifier celles qui doivent être exclus de l’analyse (des exemples sont montrés au grossissement faible et élevé dans la Figure 8 et Figure 9, respectivement). Par exemple, Site 149 est floue (Figure 9 a), Site 219 a bulles (Figure 9 b), et 54 Site contient un pli (Figure 9) et devrait être exclue. Il est typique pour exclure les 10-15 % de tous les sites imagés. Dans l’exemple fourni, 15,3 % des sites ont été exclus (25/300 a bulles, 17/300 étaient flous, 3/300 ont été pliées et 1/300 était sur le bord). Figure 10 a est une image représentative choisie pour l’analyse (sa vignette de faible grossissement correspondante est affichée dans la Figure 8). Ici, les recouvrements correspondants générés par le module multi-longueur d’onde cellule marquant démontrent les résultats de la segmentation automatique effectué sur Site 59, adaptés aux caractéristiques des auteurs (largeur minimale de noyaux = 2,5 µm, largeur maximale = 7,5 µm, et intensité au-dessus de fond local = 35 graylevels ; La largeur minimale des cellules CD11b positives = 4 µm, largeur maximale = 18 µm, minimal teinté zone = 15 µm2et intensité au-dessus de fond local = 310 graylevels ; et la largeur minimale des cellules CD45 positives = 4 µm, largeur maximale = 18 µm, minimal teinté zone = 15 µm2et intensité au-dessus de fond local = 50 graylevels). Après la segmentation, les données quantitatives de la proportion de cellules positives pour chaque marqueur de coloration (6,2 ± 5,1 % et 3,8 ± 2,1 % de CD11b+ et CD45+ cellules, respectivement), les deux marqueurs (3,5 ± 2,1 % CD11b+CD45+ cellules), aucun marqueur (86,6 ± 9,0 % CD11b–CD45– cellules ; Figure 10 b), signifie souillé zone (40,0 µm ± 9,2 et 36,7 ± 7,6 µm de CD11b+ et CD45+ cellules, respectivement ; Figure 10) et l’intensité de fluorescence moyenne (408,9 ± 40,3 fluorescence relative unités et 373,9 ± 38,1 fluorescence relative CD11b+ et CD45+ cellules, respectivement ; Figure 10) peut être obtenue.
Figure 1 : paramètres d’acquisition de la lame à faible grossissement. A. cette image affiche les paramètres de la plaque. B. ici, les paramètres de fond de plaque sont affichés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : paramètres d’acquisition de la diapositive à fort grossissement. Cette figure illustre la sélection des revues appropriées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : démonstration de comment charger des diapositives à l’aide de l’adaptateur de diapositives. A. la lame est placée lamelle vers le bas avec l’étiquette sur le côté de l’encoche d’adaptateur de diapositives. B. la diapo est chargé dans le système d’analyse de haute teneur widefield. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : paramètres d’aperçu diapositives. A. ce chiffre affiche les paramètres pour l’acquisition. B. ici, les valeurs pour les paramètres de longueur d’onde de Hoescht/DAPI sont affichées. C. cette image montre les paramètres du journal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : dessiner une zone de diapositive. A. l’outil zone rectangulaire (les autres outils de dessin ne peut pas être utilisés) est utilisé pour sélectionner la zone aperçu de la numérisation et de créer des zones d’intérêt sur le scan DAPI. B. le contour de teal dans cette figure montre comment toute la surface de la lame (y compris l’étiquette) doit être sélectionnée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : créer des régions d’intérêt sur l’aperçu de la numérisation. L’aperçu ou le scan DAPI représente la zone de diapositive entière. Dans cet exemple, il y a trois sections de tissu de cerveau série (les contours rectangulaires blancs solides). La zone située au-dessus de ces sections représente les étiquettes circulaires sur la diapositive. Arrangements de section différente ne limitera pas la sélection ultérieure des régions d’intérêt. La région d’intérêt dans cet exemple est illustrée avec un plan rectangulaire blanc en pointillé. L’échelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : acquisition d’image windows essentielles à fort grossissement. A. l’Acquisition Site fenêtre montrera combien de colonnes et de lignes sont dans l’ou les régions d’intérêt. B. assurer le bon nombre de colonnes et lignes indiquées dans la Figure 7 a sont entrés dans la boîte de configuration de Acquisition de plaque et les sites sont carrelées. C. il est nécessaire de garder la fenêtre de WellPositions ouvert pendant la durée de l’acquisition de l’image, même si elle est vide. D. le nombre de régions d’intérêt doit être mises en évidence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : image représentative de la région d’intérêt. Chaque site peut être affiché dans une composite miniature de la région d’intérêt. Les sites représentatifs qui ont été exclus (marquées avec cases rouges) et un exemple d’un site inclus (marqué avec une boîte verte) est montré à un grossissement plus élevé. Il est recommandé d’examiner chaque site pour s’assurer que c’est d’une qualité suffisante pour l’analyse. L’échelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : exemples de sites qui doivent être exclus de l’analyse. A. les sections de tumeur du cerveau humain ont été souillées avec CD11b (vert) et CD45 (rouge), marqueurs de la microglie et des macrophages. Cette image est floue et a été exclue de l’analyse. B. bulles sont présents dans cette image qui a été exclue de l’analyse finale. C. Ce site a été exclu de l’analyse à cause du pli dans le tissu. Les barres d’échelle sont 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : images représentatives et analyse. A. chaque image est affichée en regard les superpositions représentant les résultats de la segmentation automatique. Dans l’overlay, noyaux sont affichés en blanc et cellules colorées positivement sont représentées en vert CD11b et rouge pour CD45. Après à l’exclusion des sites de qualité insuffisante de l’analyse et en combinant les résultats de tous les sites restants, B. les proportions moyennes du nombre total de cellules dans chaque site qui souillé positifs pour chaque marqueur et étiqueté conjointement pour les deux marqueurs, C. la moyenne teinté de zone et D. l’intensité moyenne des cellules sont représentés graphiquement. RFU = unités de fluorescence relative. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. Les barres d’échelle sont 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Un problème commun qui entravent l’efficacité de la recherche en sciences biologiques est l’élaboration de protocoles pour la quantification impartiale, exacte et précise des tissus fluorescent marqué et leurs structures au sein. Des quantités importantes de temps et d’efforts sont orientées vers la recherche de moyens pour analyser des lames de tissu une fois qu’ils ont été photographiés. Beaucoup de méthodes existantes fournit des algorithmes pour les utilisateurs de recréer au sein de programmes12,13,14. Ces méthodes sont acceptables, mais l’importance de ce rapport est qu’il permet à l’utilisateur de facilement et rapidement créer une acquisition d’image globale et le protocole d’analyse si l’utilisateur a accès à un WHCAS. Essais de différencient les types de cellules et de quantifier plusieurs structures et processus, analyse du cycle cellulaire et la translocation nucléaire, par exemple, sont déjà disponibles dans le logiciel associé.
La configuration implique quelques étapes cruciales. Tout d’abord, les paramètres spatiaux de la lame sont définis comme s’il s’agissait d’une plaque. Deuxièmement, un scan d’aperçu de faible grossissement est créé d'où les régions d’intérêt sont sélectionnées pour l’imagerie fort grossissement. Enfin, les sites qui affectent l’exactitude et la précision des analyses subséquentes sont exclus. La plus grande limitation de cette technique est que son applicabilité dépend de si l’utilisateur a accès à un WHCAS. Cependant, avec le besoin croissant de systèmes d’analyse de haute teneur, nombreuses institutions fournissent à leurs chercheurs de demeurer concurrentiel15. Dépannage est nécessaire plus couramment lors de coupes de tissus n’ont pas la même épaisseur. Si plusieurs régions d’intérêt sont sélectionnées, certains seront en bref tandis que d’autres ne le feront pas. Idéalement, au cours de la section, l’utilisateur prendrait soin pour créer des échantillons homogènes. Toutefois, si les échantillons sont incompatibles, se concentrer sur la longueur d’onde de la coloration nucléaire (ou fluorophore plus brillants de l’utilisateur), qui sert à la mise au point, peut être réajusté pour chaque région d’out-of-focus d’intérêt et même pour chaque champ de vision. Les autres longueurs d’onde sont simplement compensées de la longueur d’onde de la coloration nucléaire, seulement cette longueur d’onde a besoin de réajustement.
Dans ce rapport, nous détaillons comment numériser et analyser les diapositives à l’aide d’un WHCAS et des logiciels associés. Le module multi-longueur d’onde cellulaire Scoring permet à l’utilisateur de compter automatiquement des marqueurs nucléaires et cytoplasmiques qui sont étiquetés fluorescent. Après les réglages de mise au point et définissant les caractéristiques cellulaires tels que la largeur et transversale pour personnaliser le module au tissu imagé, il n’est plus nécessaire pour l’intervention de l’utilisateur d’obtenir les slides imagés et les données quantitatives. Jusqu'à trois diapositives peut être photographiée à la fois et plusieurs régions d’intérêt peuvent être définies. Cela permet de protocole WHCAS utilisateurs qui ont besoin d’analyser les diapositives profiter de personnalisable, polyvalent, automatisé des workflows qui ne nécessitent peu ou aucun optimisation et peuvent être appliquées dans tous les projets dans l’avenir qui impliquent l’analyse histologique des tissus.
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier dans les produits décrits dans ce manuscrit et n’ont rien d’autre à divulguer.
Ce projet a été financé par une subvention des instituts de recherche en santé du Canada et Alberta Innovates - Health Solutions/Alberta Cancer Foundation. Les auteurs tiennent à souligner l’unité de régénération dans les installations de base neurobiologie de l’utilisation de leurs équipements, les travaux de Paula Gedraitis dans la construction de la Fondation sur laquelle diapositive balayage sur le WHCAS a été rendu possible et le créateur des produits mentionnées dans cet article, Molecular Devices.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |
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